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方法論記事

木部形成に関与する遺伝子およびプロモーターを研究するための誘導性体細胞セクター分析（ISSA）の使用とセカンダリステム開発

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DOI：

10.3791/54553

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2016年10月5日

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1School of Ecosystem and Forest Sciences, Faculty of Science, The University of Melbourne, 2Victorian AgriBiosciences Centre, La Trobe University R&D Park, 3College of Biological Sciences, Department of Plant Biology, University of California, Davis, 4Department of Genetics, Forestry and Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria

この記事について

サマリー

ここでは、比較的短い時間枠内で、木の二次幹組織における遺伝子およびプロモーターコンストラクトの中スループットから高スループットの機能特性評価を容易にするプロトコルを提示します。効率的で使いやすく、さまざまな樹種に広く適用できます。

要約

樹木における二次茎の成長と関連した木部形成は、生物学的および商業的な観点の両方から重要です。しかし、比較的少ないが、その開発を支配する分子制御について知られています。これは、多くの場合、二次成長過程の研究に関連する物理、リソースと時間制限による部分です。 in vitroでの多くの技術は、植物の一部または木質及び非木質植物種の両方でプラント全体のシステムのいずれかを含む使用されています。しかし、二次茎成長プロセスの研究のための彼らの適用性についての質問には、特定の種や労働強度の反抗は、高スループットのアプリケーションへの媒体のため、多くの場合、法外です。二ステム開発や木材形成を見たときにも、調査中の特定の形質のみが成長の数年後に後半ツリーのライフサイクルにおける測定可能になるかもしれません。 生体内の P で 、これらの課題の代替に対処するにはrotocolsは、直接、植物の二次茎トランスジェニック体細胞組織セクターの創出を伴う誘発性体細胞セクター分析、命名、開発されてきました。このプロトコルの目的は、樹種の範囲内で利用することができる遺伝子及びプロモーター機能的特徴付けのために、トランスジェニック植物の二次組織を作成するための、効率的で、簡単で、比較的迅速な手段を提供することです。ここに示された結果は、トランスジェニック二ステム部門は二次ですべてのライブの組織および細胞型で作成することができることを示して容易に高い中〜容易に評価することができる樹種の多様性の茎およびセカンダリでその木材の形態学的特性だけでなく、プロモーターの発現パターンは茎スループット機能的特徴。

概要

ツリーは、惑星のバイオマスのかなりの量を含み、巨大な、生物学、文化、商業的に重要である茎。セカンダリが他の多くの生命体のためのリソースや避難所を提供することにより、生息地を作成茎。彼らは、彼らが生息し、木材、紙パルプ及びその他の木材や非木材製品の生産のための再生可能な資源としての役割を果たす生態系に他の多くのサービスを提供します。二次茎の発達、より具体的に木材形成は、特定の細胞型の発達を調節する複雑な分子系によって支配される、生化学それらの細胞壁の組成および方法は、それらが組織および器官を形成するように配置されています。二ステム開発と木部形成の分子基盤を解剖することは内と茎の間、長い世代時間、アウト交差配偶システム、高ヘテロ接合性、高い遺伝的負荷、季節の休眠、長い木材や茎の特性のばらつきを含む多くの要因によって混乱されます成熟しました形質設立期間と成木の薄手の物理的な大きさ。その結果、植物の発達の分子制御のほとんどの他の態様の詳細な知識に二ステム開発の相対的な理解は、まだ始まったばかりです。

インビトロでの多くの技術は、特定の木材及び二次細胞壁形成、二次茎の発達を研究し、理解するために使用されています。これらのプロトコルは、トランスジェニック植物のいずれかが作成されるか、特定の二次細胞または組織は、木材及び/又は二次茎の発達1の特定の側面の研究のために形質転換された植物全体または植物の部分システムの使用を含みます。トランスジェニック植物は、植物組織および細胞型の様々なからポスト形質転換を回収することができるが、進行が遅く、特に、長い再生に木質繊維特性を分析し、（年のオーダーで）熟成時間をステムと、高い技術と労働デーマンdsは、候補遺伝子だけでなく、いくつかの木本植物種を伝播するの難しさの低いスループット。同様の技術は、正常にこれらの制限の一部を克服するシロイヌナズナなどの非木質モデルシステムが開発されているが、これらの中には存在しないすべての二次の幹細胞型は、茎および季節性または寿命に関連する特性は、種2で検討することができません。あるいは、このようなPINUのラジアータのカルス培養3などの植物部分のシステムは、関連する時間枠を減らします。これらの方法は、しかし、個々の細胞型の研究に限定し、in vitroの実験のために述べたように同様の制約を受けるています。同様に、全体の茎外植片を含む頂端幹培養液4が有望であることが示されたが、まだ特定の遺伝子または関心のプロモーターの研究のために適用されていません。より最近では、毛状根培養を伴う代替のプロトコルは、ユーカリのために開発されており、正常でした5を適用し、しかし、この方法はまだ、 試験管内の培養に必要とする二次根を伴うのではなく茎や日付には、単一の樹種に限定されています。

ここに記載されるように誘導された体細胞セクター分析（ISSA）は、木材形成および二次茎組織発達における疑わしい役割を有する遺伝子およびプロモーターのためのハイスループット機能スクリーニングツールの媒体を提供するこれらの問題のいくつかを克服するために開発されました。 ISSA労働を克服しながら、完全な二幹トランスジェニック細胞および組織を産生するのにかかる時間を短縮するために開発されたインビボでの形質転換およびスクリーニングシステムであり、日常の技術的およびスループット限界は、 インビトロの方法で使用されます。二次はグラムなしの樹種や目的の組織では、短時間で茎にここで説明するプロトコルは、独立して形質転換組織の部門や細胞の数百の同時作成を可能に比較的短い時間枠と低人件費内eneticおよび/または環境変動。 ISSA のインビボ技術は、第一及び形成層の分化に関与する遺伝子および/またはプロモーターの研究によって二次茎組織で洗練されて以来、二ステム6と芽7組織について説明したとしていたが含まれます： チューブリン （TUB）8、 ファスシクリンのようなアラビノガラクタンを （ FLA）9、 セルロース合成酵素 （CESA）10、 二次細胞壁関連NACドメイン （SND 2）11、ARBORKNOX（ARK1）12と本当に面白い新しい遺伝子 （RING）H2タンパク質13。これらの研究は、ポプラおよびユーカリ植物の茎二次で実施し、細胞形態、細胞壁の化学的性質と遺伝子発現への洞察を提供しました。

ここで説明するプロトコルは、経験aを一緒に持って来るように意図されていますND知識は、過去10年間で出版され、未発表の研究の範囲からISSAの開発と応用を通して得られました。彼らは、二次茎組織6のin vivoでの変換に焦点を当て、 ギンドロ「錐」クローン、 ユーカリグロだけでなく、11 ユーカリグロのxカマルドレンシスクローンを含む研究に専念します。この文書は、組織の植物や細菌、幹組織の変革、成長と収穫の栽培からプロトコルを介して研究者を取り、トランスジェニック細胞および組織の識別、表現型の評価およびデータの収集と分析のための方法のための準備。技術が正常にスペースの制約、また9,11を細胞壁単糖組成を測定するために適用されているが、この文書は、細胞及び組織形態学を測定し、二番目の遺伝子発現パターンを理解するために使用される技術に集中しますEMSのみ。したがって、概説されたプロトコルは、ロールおよび/または二次的に連結された遺伝子の発現へのさらなる洞察を得るためにお探しの方に適した低コスト、技術的に容易で、かつハイスループット方法に培地を用いて茎。

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プロトコル

植物材料の調製

  1. 実験前に、種子または切断から優先樹種の新しい苗木を高め、実験のために意図された領域中の幹の直径は直径約1cmになるまでツリー/秒を育てます。
    注：必要な時間は、このステップのために3ヶ月から9ヶ月の間に許可し、したがってによる植物の成長率に変更になる場合があります。

2.バイナリーベクターの作成

  1. アグロバクテリウム・ツメファシエンスを取り扱うことができ、実験室のために処方、その適切な個人保護具を使用する実験室や温室内でのセクション7にこのセクションから作業を行っています。
  2. 関心のノックダウンまたは過剰発現カセットの遺伝子およびβグルクロニダーゼ（GUS）レポーター遺伝子カセットや研究の種類に応じて、GUS遺伝子に融合した関心のプロモーターのいずれかを含むバイナリーベクターを準備します。
    注：バイナリーベクターBACの数があります。商業や研究ネットワークだけでなく、バ​​イナリーベクターに目的の遺伝子およびプロモーターを挿入するために利用可能な多数の技術を通じて調達することができkbones。このプロトコルの文脈ではバイナリーベクターを作成する方法についての決定を行うための実験者に任されています。
  3. A.の武装解除株にバイナリーベクターをトランスフォームエレクトロポレーションまたは熱ショック14を使用し、実験に必要とされるまで適切に保管しツメファシエンス 。
  4. 任意の正および/または陰性対照のための手順を繰り返し2.2。
    注：陰性対照は、関心の研究と関心の研究のプロモーターのためのプロモーターをGUS遺伝子のために関心のない遺伝子を含まないバイナリーベクターを含むべきです。関心の研究のプロモーターの陽性対照は、GUSレポーターに融合されたカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（CaMV35Sプロモーター）を含むべきです。

A.の調製接種のためのツメファシエンス

  1. EXPERに少なくとも週前imentation、Aの少量（約1μl）を取りますツメファシエンスは、ステップ2.2と2.3の間に製造し、細菌の選択のための適切な抗生物質を含む寒天14プレートを用いて別々のLB培地上に薄く広げました。小さなコロニーを形成した後、4℃で保存するためにインキュベーター中28℃で増殖 必要になるまでCを°。
  2. 48時間実験前に、Aの1つのコロニーを転送独立した50ミリリットルに各プレートからツメファシエンスは、予め温めた（28℃）のLB培地14細菌の選択のための適切な抗生物質を含有するまで28℃で約48時間振とう培養器で200rpmで攪拌の5ミリリットルを含むトップチューブをねじ混合物は非常に濁っています。
  3. 4-6時間は、植物の接種の前に茎の間（セクション4）LB / Aの1ミリリットルを追加します新鮮な50ミリリットルにツメファシエンス混合物のための適切な抗生物質を含む新鮮な暖かい（28°C）のLB培地19ミリリットル（1：20希釈）を含むトップチューブをスクリュー細菌の選択。 600nmの（分光法によって測定されるようにOD 600）での光学密度（OD）が0.1以上である場合、これが達成されるまで、暖かいLBでさらに希釈します。
  4. 希釈したLB / Aを配置しますバックシェーカーインキュベーターにツメファシエンス混合し、OD 600が 0.4〜0.6と削除の間になるまで同じ条件（200 rpmで、28°C）の下に振ります。
  5. 遠心分離機LB / A.千×gで4℃で15分間、混合物をツメファシエンス 。
  6. 液体デカントし、すぐにAを再懸濁ツメファシエンスペレットの1mlをMS培地15を冷却に、2ミリリットルマイクロチューブに移し、接種（セクション4）のために必要になるまで氷上で保存します。この溶液を接種メディアと呼ばれています。

工場の4接種A.と茎ツメファシエンス

  1. アクティブと急速に成長形成層を持つセクション1で作成した植物を使用して、晩春か初夏の間に実験を開始します。以下のための良い診断アクティブと急速に成長して形成層は、師部が簡単に木部から剥離することができるということです。
  2. 植物の根元に近い幹の明確な直線部分を見つけ、任意の葉や枝を削除します。
  3. その後、鋭いメス（好ましくは11号）やカミソリの刃を使用して、長さが20ミリメートルの師部を介して2つの垂直の平行切開を導入することにより、ステムの明確なセクションが1cm 2 '形成層ウィンドウ」を作成し、1 5ミリメートル離れてその基端に2つの垂直カットを接続する水平カット。
  4. ピール切開によって作成された師部ストリップは、上向きに開発木部組織を露出し、ピペット（通常5〜10μl）を用いて露光、現像木部の表面を濡らすためにステップ3.6から十分な接種のメディアを追加します。すぐに師部ストリップを挿入します。
  5. パラフィルムでしっかりとステムに師部ストリップをバインドします。
  6. 繰り返しは関心が作成の遺伝子（複数可）またはプロモーター（複数可）のための追加の形成層の窓のための4.5に4.2ステップ1cm以上の上または下に他の形成層の窓やオフセット90°nyの新しい形成層の窓。
  7. 各ベクターは、実験に用いた各植物の同じ茎に付加されることを確実に完全ステップ陽性および陰性対照ベクター（ステップ2.4）4.5へ4.2。
  8. GUSアッセイのための幹直径定期的成長と収穫少なくとも5ミリメートルの半径方向の成長が茎で観察されている（第5節）を監視。
    注：必要なラジアル成長量は、下流の分析に必要な組織の量に依存します。

GUS組織学的アッセイ5.収穫

  1. 物品税の任意の組織ではない形成層ウィンドウ内の新たな成長の一部を除去し、ステムから「形成層ウィンドウ」。
    1. 木部と師部細胞/組織形態を成熟に関する研究のために、木部からの師部の皮をむきます。
    2. 形成層帯が無傷またはプロモーターの発現パターンが残るために必要な研究のために評価されますedは、横方向に厚さが0.5〜1mmのディスクにカミソリの刃または他の鋭い刃を使用して形成層ウィンドウをスライス。
  2. 。組織が完全に水没されていることを確認し、少なくとも5分間、溶液中に残留し、すべての余分な溶液がの終わりに除去される14ミリリットル丸底試験管内で処理形成層窓組織を配置し、pHが7〜14で、0.1 Mリン酸緩衝液中で2回すすぎ第二のリンス。
  3. GUS試薬（0.5mMのX-Glucを（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-グルクロン酸）の5 mlを加え、10mMのEDTA、0.5％トリトンX-100 V / V、0.5 mMのカリウム。参照ホーキンスら 16）を各チューブに、フェリシアン化物（III）は、0.05ミリモルのフェロシアン化カリウム（II）、0.1 mMリン酸緩衝液pH 7で最終体積にしました。組織が完全に浸漬されていない場合は、追加のGUS試薬を加えます。
  4. 暗所で55℃で10分間チューブをインキュベートします。
  5. 暗所で37℃でシェーカーインキュベーターでさらに12-16時間チューブをインキュベート（回転数30〜60）を穏やかな攪拌を使用して混合を可能にします。
  6. シェーカーインキュベーターから取り出した後、ランダムにpH範囲0-7でリトマス紙を使用して、チューブの小さなサブセットでGUS試薬のpHを確認してください。
    1. チューブのいずれかが6未満のpHを持っている場合は、それらにラベルを付けます。 pHが6以下であれば、pHおよびラベルを確認するために、チューブの残りの部分をチェックし続けます。
      注：6以下のpHを有するサンプルは、分析に適していないかもしれません。これらのサンプルは、さらなる分析から除外しなければなりません。
  7. GUS試薬をデカントし、組織をカバーするのに十分な70％エタノールと交換してください。
  8. 4℃で保存必要になるまで。

トランスジェニック組織の6同定

  1. 鉗子を使用して、顕微鏡可視化を可能にするために、小さなトレイまたはペトリ皿内のすべての形成層窓管からの組織と場所を取ります。
  2. 1X及び4X倍率間の解剖顕微鏡を用いて、細胞または組織の数を特定し、集計それは明るいブルー染色を持っています。青色に染色された細胞または組織を、以降この点から、セクタと呼ばれます。次の方法でそれらをタリー。
    1. 師部は（ステップ5.1.1）削除されたサンプルについては、開発木部（形成層部門、 図1a）の表面に見られる形成層組織内のセクタの数を数えます。
    2. ディスク（ステップ5.1.2）にカットされた試料については、別の細胞または組織型（ 図1b、1C、1D）に投票された数のセクタをカウントします。セクターは、以下の組織タイプで見つけることができます：周皮（周皮部門、 図1eの ）、師部（師部部門、 図1F）、形成層組織を（形成層部門、 図1グラム 、1時間 、1I）、創傷実質（創傷柔セクター、 図1J）およびチロース中（チロース部門、 図1K）。
      1. 顕微鏡Aの間にディスクの両側が視聴されていることと、番号が過大評価されないように、2枚のディスク全体に発生したセクタが一致していることを確認してくださいssessment。
  3. 必要になるまで70％エタノールとストアを含むチューブに戻すだけの組織を含むセクタを配置します。
  4. 陽性および/または陰性対照を含む任意の追加の形成層の窓6.3を繰り返し手順6.1。
  5. 形成層の1cm 2当たりの形質転換事象の平均数を導出するために1cm 2の形成層の窓の総数でセクタの合計数を割ることによって個別の遺伝子または目的のプロモーターおよびコントロールの各セクタタイプについての平均変換効率を算出し接種（ATScm -2）。
  6. 形成層組織中の細胞や組織形態を評価するための技術のための7.2と8プロモーターの発現パターンとステップ7.1の分析のために、7.2または7.3に進みます。

7.分析形成層組織中の細胞や組織形態

注：以下にISSAの分析のために首尾よく使用されてきた技術の選択は、サンプルに由来します。

  1. 走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて、木部細胞面積、内腔面積、セル壁の厚さとセル壁面積の分析。
    注：このプロトコルは、最小限のサンプル調製を必要とし、概説形態学的形質に関連するセクター分析の比較的高いスループットを可能にします。
    1. 以降、このステップから、木質組織が処理され、処置されているときはいつでも白衣、目の保護と手袋が使用されていることを確認してください。
    2. 分析のための形成層のセクターを特定し、切開ディスク（ 図2a）を作成するために、単一のエッジかみそりの刃を使用して、その両側に約0.5ミリメートルを作ります。
    3. セクターの接線方向側に木部組織の約1ミリメートルを残して過剰木部組織を切り落とす（ 図2b）。
    4. 注意深いですlyが新鮮なダブルエッジのカミソリの刃（ 図2c）を使用して、部門の中心を通って横方向に切断しました。
    5. トランスジェニック組織（ 図2d）を画定する部門の横断面両側に二つの追加の浅い放射状切開を行います。 GUS染色は組織に深く浸透しないように形成層表面で見つかった染色された組織のいずれかの側に細胞の半径ファイルに沿います。
    6. SEMピンスタブの段階まで準備し形成層のセクターの顔を添付すると、SEM導電性テープ（ 図2E）を使用してマウントし、SEMの可視化のために必要になるまでデシケーター中に保管してください。
    7. 繰り返しは、陰性対照からのものを含む任意の追加セクタのために7.1.6に7.1.2を繰り返します。
    8. 低真空モードでのSEM（エネルギーが5kV、3.0 nmのスポット）を使用して、部門（ 図2F）を可視化し、セクター内の細胞/組織だけでなく、細胞/組織直接隣接の写真を撮ります。倍率の量関心のある特徴に依存しています。木部繊維の場合、2,000Xは、適切な（ 図2グラム ）です。
    9. 形成層セクタが可視化し、写真が適切な倍率で撮影された後、画像計測ソフトウェアを使用して、関心の木部細胞/組織の形態学的特性を測定します。
    10. 統計分析のために、複数のペアワイズを行うPを決定するために、各セクタのためのトランスジェニックセクターで測定形態素との差（セクタエッジ0.5 mm以内に測定）は、隣接する非トランスジェニック対照細胞/組織を比較する対応のあるt検定を用いて分析し-値。
    11. ネガティブコントロールのための手順を繰り返し7.1.10。
      1. ポジティブコントロールは低いp値（α<0.05）を示している例では、形態学的形質についてトランスジェニックおよび隣接する非トランスジェニック細胞/組織との間の差を計算します。 negatで目的の遺伝子の効果を比較するために、対応のないt検定では、この「差分値」を使用しますp値を決定するための制御をアイブ。
  2. 光学顕微鏡を用いて、幹細胞/組織中の形成層の細胞/組織形態又はプロモーターの発現パターンの組織化学的分析。
    注：より多くの時間がかかりますが、この方法は、形成層の力学、 例えば、形成層の幅だけでなく、プロモーターの発現パターンの態様を含むより多くの分析オプションを可能にします。また、SEMにアクセスすることができない場合、この手順は、ステップ7.1のための代替として使用することができます。
    1. 小さなブロックとしてカミソリの刃といくつかの周囲の組織を用いて目的の物品税部門（大きくない3ミリメートル 1以上）と4℃で少なくとも2日間、スクリューキャップ付きサンプルバイアル中の100％エタノール1-3ミリリットル中に直接置きますシェーカー上。ミクロトームがアクセスする関心の表面を可能にするような方法で小さなブロックを準備します。
    2. 陰性対照からのものを含む任意の追加セクタのために繰り返します。
    3. 液体を削除し、2と交換5％エタノール：条件を維持する2日間75％のLR白の混合物。
    4. 50％LR白、25％エタノール：75％のLRは白そして最後に二回100％のLR白と50％エタノールで繰り返し手順7.2.3。
    5. 短い方の端に合わせ関心の表面と金型の埋め込みに小さなブロックを置き、慎重に新鮮なLRの白でカバーし、製造業者の指示に従って重合します。
    6. 回転式ミクロトーム上で関心の表面から5μm切片をカットし、スライドガラス上にマウントします。細胞壁および/または他の特徴を視覚化するためにサフラニンO（0.01％）染色を使用してください。
    7. 、取り付けメディアを追加カバースリップを置き、一晩設定することができます。
    8. 100Xおよび600X倍率とキャプチャ画像との間の光顕微鏡下で見ます。
    9. 画像計測ソフトウェアを使用して画像から形態学的特徴をキャプチャします。
      1. 定量的形態学的形質の統計分析のために、ステップ7.1.10からに従ってください。
      2. 形態学的形質の定性分析のために、比較して、目的の遺伝子またはプロモーターと負および/または正の対照について観察されたパターンを記述します。
  3. 光学顕微鏡を用いて浸軟ファイバのミクロフィブリル角度（MFA）の分析。
    1. 部門からだけでなく、それに隣接する非トランスジェニック組織から直接消費税トランスジェニック木部組織の別々の1.5ミリリットルチューブ内及び場所（0.5ミリメートル、 図2H以内）。陰性対照からのものを含む任意の追加セクタのために繰り返します。
    2. 完全な手順は、ドラフト内で7.3.5に7.3.3。
    3. 各チューブに過酸化水素250μlの氷酢酸250μlのを追加します。
    4. ヒュームフード中で2時間、90℃のヒートブロックにチューブを置きます。
    5. チューブから組織を取り出して、慎重に少なくとも2回、蒸留水ですすいでください。
    6. 水溶性封入剤を使用して、スライドガラス上の組織をマウントし、カバースリップを固定する前に鋭いピンセットで離れていじめます。
    7. ビュー光学顕微鏡下で400倍よりも大きな倍率で個々の繊維の画像を取り込みます。
    8. 繊維のミクロフィブリル角度を決定するために、ピットの開口部および/または細胞壁条痕や画像計測ソフトウェアを用いた繊維（ 図2I）の長軸との間の角度を測定します。
    9. 統計分析のために、ステップ7.1.10からに従ってください。

8.分析プロモーターの発現パターン

  1. 二次茎組織におけるプロモーター発現パターンの解析。
    1. ステップ6.2.2で述べたように、関心のプロモーター、ならびに陽性および陰性対照のため、各セクター型の頻度をタリー。
    2. p値を確立するためにカイ二乗検定を使用してポジティブコントロールと利益のプロモーターのための異なるセクタタイプの頻度を比較してください。細胞/組織特異性のさらなる分析は、必要に応じてステップ7.2を用いて行うことができます。
      1. 複数のプロモーターの場合関心のその後関心のあるすべてのプロモーターおよび陽性対照との間に、この分析を作るの比較を繰り返し検討されています。
      2. セクタまたは青色の染色が陰性対照で観察されている場合は、分析にこれを追加したり、程度に応じて、または内因性の染色が疑われる場合（ 説明を参照）放棄。
  2. 形成層派生開発と分化中のプロモーターの発現パターンの解析。
    1. 解剖顕微鏡を使用して、ステップ6.2で識別されたすべての形成層のセクタ（図1グラム 、1時間 、1I）を可視化し、形成層由来3の組織型におけるブルー染色の存在/不在を決定。師部（P）は、木部（X1）または開発木部組織（X2）を開発する（ 図3a参照します ）。
    2. ステップ8.1.2あたりのように、int型のプロモーターのP、X1とX2の領域でGUS染色の存在/不在の頻度を比較しますp値を確立するためにカイ二乗検定を使用してポジティブコントロールとerest。細胞/組織特異性のさらなる分析は、必要に応じてステップ7.2を用いて行うことができます。
      1. 追加の考慮事項については、ステップ8.1.2.1と8.1.2.2を参照してください。

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結果

このプロトコルを使用してすべてのライブ二幹細胞及び組織型は、Aに対して感受性であることが示されています変換ツメファシエンスと最初に形質転換された細胞の種類に基づいて、セクタの種類と、それ以降の発育成長パターンに定義されています。セクターの種類は周皮、師部、形成層、創傷実質およびチロース（ 図1b、1C、1D） が含まれ 、一貫性の場所にあります。この段落の残りの部分で説明します。周皮部門は周皮でのみ発見、決して師部（ 図1eの ）内に延びる形質転換された細胞のグループで構成されます。師部部門は、これらの周囲の組織（ 図1F）内に延びることはありません、しかし、開始層と周皮との間に様々な場所で見つけることができます。形成層のセクターはTRANから派生形質転換された木部/形成層/篩部組織から構成されています...

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ディスカッション

ISSAプロトコルは、木材に関わる目的の遺伝子およびプロモーターの分析のため、数ヶ月の空間における樹種におけるトランスジェニック幹組織を作成するための比較的単純かつ効率的な方法であり、形成を生じます。少しの努力は、生きている植物を保つことを超えて、大規模な培養は、組織または植物を維持するために必要とされる木材生産を開始する年まで取ることができる場所や、真のin vitroの方法とは対照的に立っているトランスジェニック幹組織次の接種を成長させるために必要とされます二ステムは1を作成されません。 ISSAもあれば、最適化が必要であり、ここで、非常に少ない（データは示していない） ポプラ 、 ユーカリおよびマツ 6の属だけでなく、 アカシアとCorymbiaで種を含む樹種の広い範囲に適用可能であることが示されていますトランスジェニック組織を導き出します。この方法を使用して、数値Oを調査することが可能ですF遺伝子または関心のほとんどの種への関心のプロモーター。さらに、プロトコルは、より広く、複...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

著者は、リンケージ助成金LP0776563（GB）AS）とLP0211919）、業界パートナーのSappi氏とMondi氏、オーストラリア研究評議会からのオーストラリア大学院賞（EM）、オーストラリア農務省（LT）によるヤング・イノベーター&サイエンティスト賞）を通じて、この研究の側面に対する資金提供に感謝したいと思います。また、このプロトコルの開発中に多くの議論とアイデアを出してくださったZander Myburg氏、Qing Wang氏、Colleen MacMillan氏、Simon Southerton氏、そして研究室関連の作業を支援してくださったMartin Ranik氏、Minique De Castro氏、Julio Najera氏、Valerie Frassiant氏、Angelique Manuel氏、Noemie Defaix氏にも感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
植物NANA必要に応じて植物については地元の苗床サプライヤーにご相談ください
アグロバクテリウム株NAアグロバクトリウム株を取得する方法はたくさんあります。あなたの国や地域での細菌の入手には制限がある可能性があるため、地元の研究コミュニティ内でフォローアップすることをお勧めします。
バイナリベクター(遺伝子およびプロモーター)NANAゲートウェイリコンビナーゼシステムを使用して、ISSAプロトコルに適したさまざまなベクターを開発しました。これには、改変されたpCAMBIAベクターに基づく過剰発現、RNAiノックアウト、プロモーター融合ベクターが含まれ、必要に応じて喜んで提供します。さらに、研究コミュニティが利用できる多くのベクトルがあります。
LB培地ΣL3022同じ製品を他社から調達可能
寒天SigmaL2897A同様の製品を他社から供給可能
Antibiotics SigmaNAカタログ番号は、バイナリベクターの細菌選択にさまざまな抗生物質が使用されるため、必要な抗菌薬によって異なります。この製品は、 企業の範囲
50 ml スクリュートップチューブフィッシャーサイエンティフィック14-432-22同じ製品を別の会社から供給できます
2 ml マイクロチューブワトソンバイオラボ132-620C同じ製品を別の会社から供給できます
MS MediaシグマM9274同じ製品を別の会社から供給できます
メスブレード番号 11シグマS2771同じ製品は、別の会社Parafilm
"M"BemisPM996これは、形成窓のポスト作成 をバインドするために使用するのに最適な製品です。
14 ml丸底チューブThermo Scientific150268同じ製品を別の会社から供給できます
EDTASigmaE6758同じ製品を別の会社から供給できます
TritonSigma X100同じ製品を別の会社から供給できます
X-GlucX-GLUC 直接あなたは注文するためにウェブサイトに行く必要があります - http://www.x-gluc.com/index.html
フェリシアン化カリウム(III)シグマ244023同じ製品は別の会社から供給することができます
フェロシアン化カリウム(II)シグマP9387同じ製品は別の会社から供給することができます
リトマス紙シグマWHA10360300同じ製品は別の会社から供給することができます
シングルエッジカミソリブレードProSciTechL055製品を別の会社から供給することができます
ダブルエッジカミソリブレードProSciTechL056製品を別の会社から供給することができます
ピンスタブProSciTechGTP16111同じ製品を別の会社から供給することができます
キャップ付きサンプルバイアルProSciTechL6204同じ製品が別の会社から供給されることができる
エタノールσE7023同じ製品が別の会社から供給される可能性がある
LRの白いProSciTechC025同じプロダクトは別の会社から供給
金型を埋め込むProSciTechRL090我々はこの品種をお勧めしますが、利用可能な
多くのオプションがあります 水Soulableの封入媒体ProSciTechIA019オプションも存在し、検討の余地がある封入剤の一例です。
過酸化水素シグマ216763Aのような製品は別の会社から供給することができます
氷酢酸シグマA9967のような製品は別の会社から供給することができます
Safranin OProSciTechC138のような製品は別の会社から供給することができます
量子環境走査型電子顕微鏡FEIこれはこの研究の一部で使用された機器ですが、低真空モードを持つ他のSEMを利用することができ
ImageJイメージングソフトウェアは次のURLから入手できます http://rsbweb.nih.gov/ij/
NA 培地 から供給することができます 同じ同じSEMスクリューすることができる 他の、

参考文献

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木部形成に関与する遺伝子およびプロモーターを研究するための誘導性体細胞セクター分析（ISSA）の使用とセカンダリステム開発
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