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方法論記事

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DOI:

10.3791/54585

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2016年10月6日

 , 
1Institute for Genetics, Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), University of Cologne

この記事について

サマリー

このプロトコルは、 ショウジョウバエの眼/触角成虫（EAD）に蛍光マークされ、遺伝的に定義されたクローンの腫瘍を生成する方法を示します。なお、第3齢幼虫とどのように遺伝子発現の変化と腫瘍侵襲性を可視化し、定量化するためにそれらを処理するからEADと脳を分析する方法について説明します。

要約

Drosophila melanogasterは、生物全体の文脈における腫瘍の発生と進行の機能的および機構的研究のための強力な実験システムとして登場しました。遺伝的モザイクを生成する高度な技術により、正常組織に囲まれた視覚的にマークされた遺伝的に定義されたクローンの誘導が容易になります。クローンは、多様な分子、細胞、オミクスのアプローチで解析できます。この研究では、ショウジョウバエの幼虫の眼/触角想像椎間板(EAD)にさまざまな悪性腫瘍の蛍光標識クローン腫瘍を生成する方法を説明しています 抑制可能な細胞マーカー(MARCM)技術によるモザイク分析。幼虫からモザイクEADと脳を回収する手順と、蛍光トランスジェニックレポーターのイメージングと抗体染色を同時に行うための処理方法について説明します。モザイク組織の分子特性評価を容易にするために、EADから全RNAを単離するためのプロトコルについて説明します。解剖手順は、あらゆる幼虫期からEADと脳を回収するのに適しています。想像上の椎間板の固定および染色プロトコルは、ショウジョウバエタンパク質を認識する多数のトランスジェニックレポーターおよび抗体と連携する。RNA単離のためのプロトコルは、様々な幼虫の臓器、全幼虫、および成虫のハエに適用することができます。Total RNAは、候補アプローチまたはゲノムワイドアプローチを用いた遺伝子発現変化のプロファイリングに使用できます。最後に、クローン性腫瘍の浸潤性を定量化する方法について詳しく説明します。この方法は使用が限られていますが、その基本的な概念は、認知バイアスを回避しなければならない他の定量的研究に広く適用できます。

概要

がんは発症率と死亡率の劇的全世界、特に高齢者の間で、増加している疾患の最も遺伝的に不均質なグループの1つを表します。がんは、固有の腫瘍抑制メカニズムを脱出し、制御不能に分割し、腫瘍開始細胞からクローン由来します。死と分化を抑制しつつ、協働の成長、増殖および運動性を促進する遺伝子病変の段階的な蓄積は非常に、悪性の転移性と致命的な腫瘍に初期良性の異常増殖を変換します。これは、遺伝的変化に加えて、腫瘍の進行は、その微小環境における腫瘍と複数の細胞型（ 例えば 、線維芽細胞、免疫細胞および内皮細胞）の間、周囲の間質とのクロストークの変化を必要とすることが明らかになりました。腫瘍 - 間質相互作用を含む悪性形質転換の根底にある分子の原則を理解することはプリベンを開発するために非常に重要です化と早期スクリーニング戦略だけでなく、癌の転移と薬剤耐性に対抗するための新しい効果的な治療法。

フルーツフライキイロショウジョウバエは、その高速な世代時間に起因する癌研究1-4のための魅力的なシステム、ハエと人間の間のノードのシグナリング顕著保全、のほぼすべての遺伝子の操作を容易に高度な遺伝子ツールの限られた遺伝的冗長性と豊富になってきています一時的および空間的に制限された方法。変化する悪性腫瘍の遺伝的に定義された腫瘍が再現MARCM技術5を用いて、そうでなければ、野生型組織における前駆細胞のサブセットにおいてgain-及び機能喪失変異を導入することにより、ショウジョウバエで操作することができます。 MARCMツールは、FLP / FRT（FLPリコンビナーゼ/ FLP認識ターゲット）はFLPアウト7およびGAL4 / UAS（上流活性化配列）8標的遺伝子との有糸分裂組換え6を媒介組み合わせ発現系9。 dsRNAを誘導される遺伝子サイレンシングのための癌遺伝子または蛍光タンパク質のcDNAまたは反転DNA反復を含む任意のUASベースの導入遺伝子のこのメソッド式で、特定の遺伝子座と組み換えによるGal4のリプレッサーを失った細胞のクローンに制限されます（ 図1A）。クローンパッチは緑色蛍光（GFP）または赤色蛍光タンパク質でマークされた（ 例えば、RFP、DsRedを、mCherryを）を容易に開発し、単離し、分析を通じて追跡することができます。重要なことには、それらの動作は、直接隣接し、野生型組織と比較することができます。このように、遺伝的病変の細胞自律的かつ非自律的効果に関連する質問が便利に研究することができます。哺乳動物に類似し、唯一の複数の発癌性病変が組み合わされたクローンは、 ショウジョウバエにおいて、悪性になると、哺乳動物の癌の主要な特徴を再現します。彼らは、アポトーシスを回避炎症を誘発し、不滅とINVAになり、過剰に増殖しますSIVEは、最終的にホスト10-17を殺します。

ここでは、MARCM技術を用いたショウジョウバエの幼虫の目/触角と脳組織に遺伝学的に定義されたクローン性腫瘍を生成するためのプロトコルについて説明します。この方法は、 アイレスエンハンサー（eyFLP）18,19の制御下で酵母FLPリコンビナーゼを発現するMARCMテスター株に依存しています。このように、GFP標識クローンはperipodial柱状EADの上皮および胚および幼生期（ 図1A、Bおよび参照20）を通じて、脳の神経上皮の両方で生成されます。神経上皮が差別視葉ニューロンを産生する神経芽細胞を生じさせるながらEADは、大人の目、アンテナと頭部カプセルに発展するにつれクローンは、簡単に成人期まで続くことができます。

モザイク組織の大規模な、分子の機能的および表現型の特徴付けを容易にするために、我々デスクライブ3齢幼虫からEADと脳の解剖のためのプロトコルは、3つの異なるアプリケーションのためにそれらを処理する方法を示しています。（ⅰ）トランスジェニック蛍光レポーターおよび免疫染色の検出、腫瘍侵襲性との（iii）の分析の（ii）の定量化遺伝子発現は、定量的リアルタイムPCR（QRT-PCR）またはハイスループットのmRNA配列（mRNAの-SEQ）（ 図1C）を用いて変更します。

免疫プロトコルは、特定の抗体と目的の任意のタンパク質を可視化するために使用することができます。トランスジェニック蛍光の転写レポーターは、特定のシグナル伝達経路の活性に便利で正確な時空間情報を提供します。細胞系統特異的レポーターは、他の一方で、モザイク組織内および個別の遺伝子型の腫瘍のうち、細胞集団における定性的および定量的変化を反映します。侵襲的な行動の定量化は、遺伝子型間の腫瘍の悪性度の比較が容易秒。最後に、RNA単離のためにモザイクEADの収集と処理を説明するプロトコルは、それぞれ定量RT-PCRおよびゲノムワイドのmRNA-seqの、続いて逆転写などの小型の両方大規模なダウンストリームアプリケーションに適しています。これらのアッセイから得られた定性的および定量的なデータは、クローン性腫瘍の社会的行動への新たな洞察を提供します。さらに、それらは個々の遺伝子、遺伝子ネットワークと異なる段階における腫瘍微小環境と腫瘍形成の側面の役割に関する機能研究のための強固な基盤を作り出します。

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プロトコル

注：この作品はeyFLP1を利用します。行為> Y +>のGal4、UAS-GFP; FRT82B、浴槽-GAL80 MARCM 82Bグリーンテスターライン11。 W等の菌株の男性にMARCM 82Bグリーンテスターの処女を渡ります。 UAS-; UAS-B のRNAi、FRT82B CのMUT遺伝子型は、有糸分裂組換えが第3相同染色体の右アームの間に生じるであろうに子孫を得られます。このようにして、FRT82B部位の遠位に位置する遺伝子Cのクローンホモ接合変異体は、EADおよび脳神経上皮内で生成されます。これらのクローンは、遺伝子B（ 図1A）のためのGFP導入遺伝子AとのdsRNAを発現します。 X、2L、2R、3L及び3R上の組換えのための様々なeyFLP-MARCMテスターラインが確立され、ハエのコミュニティ内で使用可能なされています。

1.フライ処理、十字架、およびステージング

  1. 複数のBOを取り込むことによって、室温で適切なMARCMテスター在庫を展開同時にttles。十分な処女は、その後の交配のために収集することができるように、2〜3日ごとに新鮮なボトルに大人を反転します。
    注：処女を収集する場合、これは女性の生殖能力を損なうとして、CO 2への長期暴露を避けます。
  2. 実験の規模に応じて、少なくとも10 MARCMテスター処女と（ 例えば 、蛍光レポーターおよび免疫染色のイメージングのため）、または少なくとも30処女と10人の男性（ 例えば 、用とボトルで4人の男性を使用してバイアル内のフライ十字架を設定侵襲性のRNAの単離および定量化）。
  3. 長い一日16時間/ 8時間の明暗サイクル下、25℃で子孫を上げます。幼虫の再現可能なステージングを容易にし、過密を防止するために、新しいバイアル/ボトルに24時間毎に両親を反転します。
    注：卵は産卵後6日目に開始（AEL）、後期3齢制御幼虫停止送り、徘徊開始とpupariationを入力してください。これとは対照的に、幼虫、蛹遷移の開始は解除することができますEADは、過形成性または悪性クローン性腫瘍を担持して幼虫にレイアウトさまたは存在しません。

2.三齢幼虫の収集

  1. 免疫染色のために、約20後期3齢幼虫（壁に徘徊し、食品から同等のボディサイズのもの）を収集。優しくバイアルまたはボトルから幼虫を選択し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で満たされた胚のガラス皿にそれらを転送するために鉗子を使用してください。
    1. 侵襲性のRNAの単離および定量のために、少なくとも80後期3齢幼虫（壁に徘徊し、食品から同等のボディサイズのもの）を収集。表面が覆われるまで幼虫を含むフライボトルにPBSを噴出する噴出ボトルを使用してください。
    2. スパチュラで食品のトップ層を柔らかくし、ペトリ皿に幼虫を含有する食品のマッシュを注ぎます。鉗子を使用して、そっと幼虫を選択し、PBSで満たされた胚のガラス皿に移します。
  2. PBS UNTでの洗浄の幼虫IL全ての残留食べ物が削除されます。幼虫の体（ 図2A、2Bおよび考察の章を参照）全体にランダムGFP陽性スポットを運ぶすべての"ヒョウの幼虫」を破棄する8 16Xの倍率で蛍光実体顕微鏡下で幼虫を点検。
    注：RNAの単離のためには、1分間、70％EtOH中の最後から二番目の洗浄工程を含みます。
  3. 解剖するまで氷上でPBSで選択した幼虫を含む皿を置きます。寒さと飢餓の悪影響を回避するために30分以内に処理幼虫。

幼虫の3解剖

  1. 実体顕微鏡下EADを分析するために、穏やかにガラス皿の底に対する幼虫の中央部を押すように鉗子のペアを1つ使用します。第二の鉗子で、幼虫の口のフックをつかむと体（ 図2C）からそれらを引き離します。
    注：引張力は、多くの場合、EADパイを接続する光ファイバ茎を破壊するのに十分です脳ローブにrを。脳またはその部品がEADに取り付けたまま、それらの存在は、さらに用途のために所望されていない場合は、鉗子の2ペアの助けを借りて光学茎を切りました。浸潤性腫瘍の場合（ 例えば 、RAS V12のScrib 1）EADと脳ローブとの間の接続は、ますますクローン細胞を過剰成長と移行することにより、時間の経過とともに不明瞭になります。
    1. 無傷の腹側神経索（VNC）（ 図2D）とのEAD /脳の複合体を調製するために、体の真ん中に幼虫をカットするために鉗子を使用しています。後半を捨てます。
    2. 1鉗子の先端間の幼虫の体の前半分を持ち、第二の鉗子の先端で口のフックに押して、最初の鉗子のペアでそれ以上のキューティクルを圧延することにより幼虫内部をアウトフリップ。
  2. 慎重にEADのペアを残しながら、すべての余分な組織（ 例えば、唾液腺、脂肪体、および腸）を削除するか、鉗子を使用して口のフックに接続されたEAD /脳の複雑な。上層のクチクラから口のフックを解きほぐします。体の筋肉と表皮（ 図1B、2C、2D）に伸びる軸索投射を切断することによって、VNCを解放します。
    注：口のフックは鉗子で組織の安全な操作を可能と洗浄中に組織のより効率的な沈没と容易に認識を容易にします。 PBSで、未定着保持したときに、比較的高速なEADの変化形態を解剖。 20〜30分に解剖時間を制限します。
  3. 組織を転送するには、残りの体をピペッティングすることによりコートP20マイクロピペットの先端が上下に数回の死体。大きいEAD /脳の複合体を転送するには、はさみでP20マイクロピペットの先端を切りました。
    注：コーティング手順は、転送中に解剖組織の付着と損失を防止することが重要です。 P20マイクロピペットの使用が不要な限界希釈を、固定溶液にPBSの移動を最小限に抑えることができます。
    1. 免疫染色のために、転送400μlの4％パラホルムアルデヒド（PFA）固定液で満たされた0.5mLのチューブにEADを解剖。大きいEAD /脳の複合体のために1ミリリットルPFAで1.5ミリリットルチューブを使用しては、侵襲性のスコアリングのためのもの。
      注意：PFAは非常に有毒です。保護手袋や衣服を着用してください。皮膚、目や粘膜との接触を避けます。
    2. RNA単離のために冷PBSで満たされた新しいガラス皿に解剖EADを転送します。サンプル汚染を最小限に抑えるために、リングおよびリンパ腺からEADをきれいにするために鉗子を使用してください。
    3. 鉗子（ 図2E）を用いたアンテナディスクと口のフックとの間の接続を切断することによって、口のフックからEADを外します。 RNA分解および遺伝子発現のアーチファクトを回避するために、30分の解剖時間を制限します。 7に進みます。
      注：経験のある研究者は、幼虫の収集および洗浄に必要な時間を除いた30分で約60幼虫を解剖することができます。全RNAの収量は、遺伝子型とdevelopmenta間で異なるEADのサイズに依存しますリットルのステージ。後期3齢幼虫80から100の制御EADのペアの解剖は5-8μgの全RNAが得られるはずです。

4.固定、免疫染色、および取り付け

  1. 室温で章動ながら25分間PFA固定液中のサンプルを修正しました。固定時間は、組織形態およびタンパク質の抗原性を変化させることなく、60分まで延長することができます。
  2. 固定液を取り出して、旋回装置を用いて10分間3回PBST（0.1％トリトンX-100を含むPBS）でサンプルを洗います。各洗浄工程（400μL/ 0.5 mlチューブ）のためにPBSTの十分な量を使用してください。
    注：固定EAD /脳の複合体は、免疫染色を必要としない侵襲性のスコアリングのためのもの。 GFPシグナルは固定後も表示されたまま。最終的な解剖のために4.4に進みます。
    1. 免疫染色のため、室温で穏やかに攪拌しながら20分間ブロッキング溶液（0.3％BSAを含むPBST）200μl中、ブロック組織。
      1. プリムでインキュベート穏やかに振盪しながら進抗体は、4℃で一晩ブロッキング溶液100μlで希釈しました。推奨抗体希釈用の一次抗体のデータシートまたは公開された文献を参照してください。
        注：一次抗体の希釈を最適化することが必要になる場合があります。
      2. 穏やかに暗所で4℃で一晩、室温で2時間振とうまたはながらPBSTで5〜10分間洗浄した後、蛍光二次抗体で染色組織は、ブロッキング溶液中で希釈しました。
      3. PBSTで洗浄サンプル3回10分。
  3. DAPI染色溶液500μlでPBSTを交換してください。 F-アクチンを標識するために、DAPI染色液に蛍光色素に結合させファロイジンを追加します。暗所で15分間の章動後、PBSTで10分間、一度組織を洗います。
    注：F-アクチン標識は、DAPI染色とは独立に行うことができます。
  4. 最終的な解剖手順については、1ミリリットルのパイを使用して、PBSで満たされたガラス皿に戻って組織を移しますpette。口のフックをオフにクリップ鉗子の2ペアを使用します。
    1. 分析を妨げる可能性があります生い茂っEADとして眼茎を切断することにより、EADから侵襲性の定量化のために使用される脳を分離します。
  5. 客観スライド上のマウンティング培地のドロップ（22ミリメートル×22ミリメートルカバースリップのための15μl）を配置します。鉗子先端の助けを借りて、薄い層にメディアを配布します。 P20マイクロピペットとマウンティング培地にEAD、脳またはEAD /脳の複合体を転送します。
  6. 組織を配布し、スライド上でVNCをまっすぐにするために鉗子のヒントやタングステン棒を使用してください。
  7. マウント中に気泡が、最初のタッチ1マウンティング培地へのカバーガラスのエッジと鉗子の助けを借りて、マウンティング培地上にゆっくりと下の形成を避けるために。ろ紙または組織の小片を使用してカバーガラスのエッジの周りに余分なマウンティング培地を吸収するために拭いてください。
    注：DABCO /ポリ（ビニルアルコール）4-88マウンティング培地硬化します時間内に4℃で。スライドを4℃でヶ月間保存することができます。

5.共焦点イメージング

  1. 20X、40Xと60X油の目標を装備した共焦点顕微鏡を使用して、単一の共焦点セクションとのスタックを取得します。
  2. ピクセルの飽和を防止します。 Zシリーズの画像解像度、レーザー入力電力、ゲイン、オフセット、フレーム平均、ステップサイズを含む同じ画像取得パラメータを使用して、異なる遺伝子型21,22間のピクセル強度の比較を可能にするために、すべての遺伝子型のため、これらの設定を維持します。
    注：EAD /脳の複合体の可視化のために、最大突起部を生成し、それぞれ、隣接する画像をステッチ。最終画像の準備のため、パネルアセンブリのためのポスト画像処理ソフトウェアを使用し、明るさとコントラストを調整します。

腫瘍侵襲性の6.定量

  1. 腫瘍invasivenesの異なるレベルを特徴づけるます採点システムを定義します。侵略の空間パターンと脳とVNCに拡散GFP陽性細胞の量を考えるとね。ドキュメント（ 図3A）のために評価シートを準備します。
  2. マウントは、少なくとも80 24ミリメートル×50mmのカバースリップあたりマウンティング培地40μlのを使用して1つのスライド上の各遺伝子型について、無傷の脳を固定します。
    1. 公平な採点を可能にするために、スコアリング手順が公平になるように、スライドを匿名中性パーティをお願いします。独立して2ラボメンバーによる匿名化スライドを評価します。カウントが終了した後にのみ遺伝子型を開示しています。
  3. GFPフィルターセットを装備した蛍光実体顕微鏡下に取り付けられた脳のブラインドスコアリングによって悪性度を評価します。既にダブルカウント（ 図3B）を回避するために視聴されている脳を標識するためのマーカーを使用してください。
  4. 遺伝子型ごとに定義された侵襲性の各カテゴリに陥る脳の割合を計算します。統計のを決定しますカイ二乗検定（ 図3C）を使用してignificance。

7. RNAの単離、DNアーゼ処理、および品質チェック

注：以下の手順で使用される全ての試薬（ソリューション、プラスチック製品）はRNase活性があってはなりません。必ず手袋を着用し、有機溶媒での作業のための化学フードを使用します。

  1. 1.5ミリリットルチューブにコーティングされたP20のマイクロピペットチップできれいEADを転送します。
  2. 慎重にPBSを除去し、（最大140 EADのための十分な）100μlのRNA溶解試薬と交換し、チューブの底に組織シンクをしてみましょう。
  3. ボルテックスにより溶解組織。この時点で、試料を液体窒素中で凍結し、-80℃で保存された深い直接標準RNA単離プロトコールを用いて処理することができます。
    注：複数の解剖ラウンドからの同様の遺伝子型のサンプルは、RNA溶解試薬で一度にプールすることができます。
  4. RNA溶解試薬で0.9ミリリットルのサンプル容量を入力します。クロロホルムとミックスサンプルヴィゴロの0.2ミリリットルを追加します。15-20秒間usly。
  5. 室温で2〜3分間インキュベーションした後、4℃で15分間10,000×gで試料を遠心します。
  6. 相間を乱すことなく、新しいチューブにRNAを含む無色の上部の水相を転送します。それは、タンパク質およびゲノムDNAを含むように相間から近づきません。
    注：回収されたボリュームは、均質化のために使用されるRNA溶解試薬の体積の約60％であるべきです。
  7. イソプロピルアルコールを0.5mlを添加することにより、RNAを沈殿させます。ボルテックスし、室温で10分間サンプルをインキュベートします。
  8. 4℃で15分間万×gでサンプルを遠心。
  9. 上清を捨て、75％エタノール600μlので一度RNAペレットを洗浄。短いボルテックスし、遠心分離（4℃、7分間万XG）後、すべてのエタノールを破棄し、RNAペレットを空気乾燥きれいなティッシュワイプに開いたチューブを配置する5〜10分間にしましょう。
    注：RNAペレットは、小さな不透明/ホワイトSTなどの目に見えるかもしれませんチューブまたは非表示の下部に熟しました。残りのエタノール滴を注意深くP10マイクロピペットチップを用いて除去することができます。
  10. ピペットチップを通して数回ボルテックスまたは溶液を通過させることによってDEPC処理水50μl中のRNAを溶解させます。
  11. ゲノムDNAの混入を最小限に抑えるために、DNアーゼの1μlの（2 U /μl）をし、DEPC処理水で10倍DNアーゼ緩衝液10μlを含むミックス50μlのを追加することにより、DNアーゼとのトータルRNAを扱います。ボルテックスとスピンダウン。
  12. 水浴または30〜40分間加熱ブロック中、37℃でサンプルをインキュベートします。インキュベーション後、各サンプルにDEPC処理水100μlを追加します。
  13. 4℃で7分間ソリューション、1分間ボルテックスし、遠心万×gでサンプル：クロロホルム：イソアミルアルコール（1：25：24）DNアーゼから酵素活性を、きれいなRNAを不活性化するために、フェノール200μlのを追加します。
  14. 慎重に新しいチューブにRNAを含む上部の水相を転送します。等容積（200μl）を追加します。クロロホルム、ミックスして上から遠心分離工程を繰り返します。
  15. 慎重に上相を収集し、3 M酢酸ナトリウム1/10容量を追加することにより、RNAを沈殿させ、pHを5.2には、100％エタノールのDEPC H 2 Oおよび2.5容量で製造しました。ボルテックスで混ぜます。
    注：沈殿ミックスに0.5μlのグリコーゲン（20μgの/μl）を追加すると、RNAペレットを可視化するのに役立ちます。 RNAの損失を最小限にするために、シリコーン処理、低結合1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブを使用しています。
  16. 少なくとも1時間、-20℃でRNAを沈殿させます。
    注：インキュベーションを一晩行っている可能性があります。サンプルは、同様に-80℃に置くことができます。
  17. 4℃で30分間万×gでの遠心分離によってペレットRNA。 7.9での説明の後洗浄し、乾燥したペレット。
  18. DEPC処理水の10〜15μlのRNAを溶解させます。 -80℃で保存するRNA。
  19. 分光光度計を用いて230 nmで、260 nmおよび280 nmでODを測定することにより、RNAの量と純度を決定します。 RNAの共同を計算します規則を適用することによりncentration 40 / mlのRNAに等しいnmの260での1 ODいます。
    注：A 260/230比は2.0から2.2の範囲内であるべきである一方で、「純粋な」RNAのA 260/280比は2.0に等しいです。 1.7と2.0の間のA 260/280比を有するRNA試料は、cDNA合成などの下流の用途に適しています。 mRNA-seqのライブラリーの調製のためのRNAの質と量は、自動電気泳動システムを使用してチェックする必要があります。 28S / 18S比は1.8以上である必要があります。

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結果

クローンの3種類が誘導されたショウジョウバエ EADで定義された遺伝子型のGFP-マークされたパッチを生成するために、eyFLP-MARCM技術の可能性を実証するために：（1）コントロールのみGFPを発現する、（2）悪性腫瘍が小さいの発癌性型を発現します腫瘍抑制遺伝子の落書きのホモ接合損失（ のScrib 1）の背景には、Gタンパク質のRas（ラスV12）、及び（3）過剰成長が、非侵襲性のras V12のScrib 1 JNK DNクローンを、6月-N末端キナーゼ（JNK）は、そのドミナントネガティブフォーム（ 図4、遺伝子型について表1）の発現により不活性化しました。 RAS V12ののScrib 1クローン性腫瘍の侵襲性がJNKシグナル伝達の異常な活性化を必要と...

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ディスカッション

ショウジョウバエにおける遺伝的モザイクを生成するための技術は、遺伝子機能33を解析し、操作するための最も洗練されたツールの一つです。それはアイレスエンハンサーは9,18アクティブになっている組織では、空間的に制限された方法で視覚的にマークされ、遺伝学的に定義されたクローン、 すなわちの誘導を可能にするようeyFLP-MARCMシステムは、強力で堅牢であることが証明されました。複数の遺伝的病変は、同じ細胞内で合成される場合に特に重要です。 EADと脳neuroepitheliaに限定するとき、これらの高度に異常なパッチは幼虫の開発を可能にしながら、熱ショック制御FLP（hsFLP）クローンの場合のように幼虫の体に散在するとき、彼らは致死性を引き起こす可能性があります。重要なことは、活性化された癌遺伝子は腫瘍抑制の損失と結合するフライEAD上皮におけるクローンの誘導は、いくつかのヒト癌における固形上皮腫瘍の発生と進行を再現します。ホーweverは、システムはまた、簡単に説明するには限界を有しています。昆虫が開いた循環系を持っていることを考える...

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開示事項

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

ブルーミントンストックセンター、ダーク・ボーマン、カティア・ブリュックナー、イシュトヴァン・アンドウにフライストックと抗体に感謝します。原稿へのコメントをいただいたMarek Jindra氏とColin Donohoe氏に感謝します。本研究は、アレクサンダー・フォン・フンボルト財団からSofja Kovalevskaja Award to M.U.、ドイツ研究財団からDFGプロジェクトUH243/1-1 to M.U.の支援を受けて行われました。

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材料

mmp1
この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
寒天Gewürzmühle Brecht, Eggenstein, Germany00262-0500フライフードレシピ: 160 g 寒天、360 g 酵母、200 g 大豆粉、1.6 kg イエローコーンミール、1.2 L 麦芽抽出物、300 ml ライトコーンシロップ、130 ml プロピオン酸、200 ml 15% ニパギンで 20 L フライフードを準備します。フライフードは85°Cで1時間調理する必要があります。°C.
コーンシロップGrafschafter Krautfabrik Josef Schmitz KG, Meckenheim, Germany01939
Propionic acidCarl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany6026.1
CornmealReformKontor GmbH, Zarrentin, Germany4010155063948
麦芽抽出物CSM Deutschland GmbH, ブレーメン, ドイツ728985
Soy flourStockmeier Food GmbH,Herford, Germany1000246441010
YeastWerner Ramspeck GmbH, Schwabach, Germany210099K
Methyl-4-benzoate/ NipaginSigma-Aldrich, Deisenhofen, GermanyH5501を含む 15% ストック溶液を調製
Kisker Biotech, Steinfurt, Germany789008
Vial plugsK-TK e.K., Retzstadt, Germany1002
ショウジョウバエ フライ フード ボトルGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germany960177
Bottle plugsK-TK e.K., Retzstadt, Germany1002 S
Poly(vinyl alcohol) 4-88/[-CH2CHOH-]]nSigma-Aldrich, Deisenhofen, ドイツ81381封入用剤レシピ:ポリ(ビニルアルコール)6 g 4-88を39°Cに溶解します。ミリポアH2O、1Mトリス(pH 8.5)6ml、グリセロール12.5ml。50°Cで一晩攪拌します °Cおよび遠心分離機20 5,000 rpmで最小。上清にDABCOを添加して、最終濃度を2.5%にします。アリコートを-20 °C.
1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン価/ DABCO Sigma-Aldrich, Deisenhofen, GermanyD2522
Triton X-100Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany9002-93-1
リン酸緩衝生理食塩水/ PBS137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 ミリポア H2O
PBST0.1% Triton X-100 in PBS
パラホルムアルデヒド/ PFASigma-Aldrich、ダイゼンホーフェン、ドイツ1581274% PFA 固定剤レシピ: 溶解 4 マグネチックスターラープレート上の80 mlミリポアH2O中のPFAを55°Cに加熱した。°C. すべてのPFA粒子が溶解するまで、1 M NaOHを滴下します。10 mLの10x PBSを加え、1 M HClでpHを7.4に調整します。l Triton X-100 を Millipore H2O で 100 ml まで充填します。アリコートは-20°Cで保管し、解凍を繰り返すのは避けてください。(注意:PFAは非常に有毒です。PFA固定液をドラフトで調製します。自給式呼吸器、手袋、衣服を着用してください。皮膚、目、粘膜との接触を避けてください。
ウシ血清アルブミン/ BSASigma-Aldrich、Deisenhofen、ドイツA3059ブロッキング溶液レシピ:PBSTに0.3%BSAを溶解
蛍光標識されたファロイジンInvitrogen、カールスルーエ、ドイツ、分子プローブA12379、A22283、A22284ファロイジンストック溶液:粉末(300 U)を1.5 mlメタノールに溶解します。-20°Cで保管してください。染色には、PBSTで1:250(A12379、A22283)および1:100(A22284)を希釈して使用します。
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール ジヒドロクロリド/ DAPICarl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany6335DAPI染色液: ミリポアH2Oに5 mg/mlのストック溶液を調製し、アリコートを4°Cで保存します。PBSTで1:1,000の希釈に使用されます。
マウス抗H2抗体Kurucz et al., 2003ブロッキング溶液
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK715-175-151ブロッキング溶液
Dumont #5 鉗子Fine Science Tools, Heidelberg, Germany11295-10
ガラス胚皿 (30 mm)Thermo Scientific, Schwerte, GermanyE90
TungstenNeedles Fine Science Tools, Heidelberg, Germany10130-20
Nickel Plated Pin HolderFine Science Tools, Heidelberg, Germany26018-17
Microscope slidesVWR, Darmstadt, Germany631-1553
Coverslips 22 x 22 mm (#1 Menzel-Gläser)VWR、ダルムシュタット、ドイツ631-1336
カバースリップ24 x 50 mm(0.13-0.16 mm)Thermo Scientific, Schwerte, Germany1076371
Kimtech Science Precision WipesThermo Scientific, Schwerte, Germany06-677-70
解剖実体顕微鏡Olympus, Hamburg, GermanySZX7 (DF PLAPO 1X-4 Japan)
蛍光実体顕微鏡Olympus, Hamburg, GermanySZX16 (SDF PLAPO 0.8X Japan) with DP72 CCD cameraGFPの励起用ナローブルーバンドパスフィルターセット、その他の青色興奮性蛍光色素(励起フィルターBP460-480nm、バリアフィルターBA495-540nm)、RFPなどの緑色興奮性蛍光色素用のナローグリーン励起・ロングパスバリアフィルター(励起フィルターBP530-550、バリアフィルター BA575IF)を装備。ソフトウェア:オリンパスcellSensスタンダード1.11。
共焦点顕微鏡オリンパス、ハンブルク、ドイツFV1000倒立IX81顕微鏡を搭載。目標:20回;UPlan S-APO(NA 0.85)、40回;UPlanFL(NA 1.30)および60×UPlanApo(NA 1.35)。レーザー:UVレーザーダイオードLD405(50 mW)、アルゴンレーザー、マルチライン 457/(476)/ 488/515 (40 mW)、イエロー/グリーンレーザーダイオードLD560(15 mW)および赤色レーザーダイオード635(20 mW)です。ソフトウェア: Fluoview 2.1c ソフトウェア
ショウジョウバエ冷却インキュベーターEwald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany Sanyo MIR553
Squirt bottleVWR, Darmstadt, Germany215-8105
BD Clay Adams Nutator MixerVWR, Darmstadt, Germany15172-203
ELMI Digital Rocking ShakerVWR, Darmstadt, GermanyDRS-12
5 PRIME Isol-RNA Lysis ReagentVWR, Darmstadt, Germany2302700このプロトコルは、他のTRIzolベースの試薬、例:、SigmaのTRIreagent(Cat.Nr.T9424)、サーモフィッシャーのTRIzol試薬(カタログ番号15596)。
ジエチルピロカーボネート/ DEPCSigma-Aldrich、Deisenhofen、ドイツD5758ミリポアH2OでDEPC 1:1,000を希釈し、一晩攪拌してオートクレーブします。
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1)ThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany15593-031
ChloroformMerck, Darmstadt, Germany102445
TURBO DNase (2 U/µl)Thermo Scientific, Schwerte, GermanyAM2238
Invitrogen UltraPure GlycogenThermoFischer Scientific, Invitrogen, Karlsruhe, Germany10-814-010
Sodium acetate trihydrateVWR, Darmstadt, Germany27652.232DEPC-H2Oで3 M酢酸ナトリウム溶液を調製し、pHを5.2に調整
2-PropanolMerck, Darmstadt, Germany
EthanolMerck, Darmstadt, Germany100983DEPC-H2O で 75% EtOH 希釈液を調製します。
UV/Vis-Spectrophotometerre NanoDrop ND-8000Thermo Scientific, Schwerte, GermanyND-8000
Eppendorf Microcentrifuge (Refrigerated)Thermo Scientific, Schwerte, Germany5417R
Experion RNA StdSens Analysis KitBio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany7007103
Experion Automated Electrophoresis StationBio-Rad Laboratories GmbH, München, Germany7007010
SuperScript III Reverse TranscriptaseThermo Scientific, Schwerte, Germany18080044
Oligo d(T) PrimerIntegrated DNA Technologies, Leuven, Belgium100 µDEPC-H2OのMストック溶液で、-20°Cで保存します。C
dNTP混合物タカラバイオヨーロッパ/クローンテック、サンジェルマンアンレー、フランス403025のアリコート&マイクロの店のアリコート。l at -20°C;C
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad Laboratories GmbH, München, ドイツ1855195
iQ SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories GmbH, München, ドイツ170-8882
Hard-Shell PCR Plates 96-well, thin wallBio-Rad Laboratories GmbH, München, ドイツHSP9601
Microseal 'B' FilmBio-Rad Laboratories GmbH, München, ドイツMSB1001
rp49 フォワードプライマーIntegrated DNA Technologies, Leuven, Belgium5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'
rp49 リバースプライマーIntegrated DNA Technologies, Leuven, Belgium5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'
mmp1 フォワードプライマーIntegrated DNA Technologies, ベルギー、ルーヴェン5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'
70% EtOH Drosophila フライフードバイアルします します 109634 Prepare リバースプライマー Integrated DNA Technologies、ベルギー、ルーヴェン 5' ACG TCT TGC CGT TCT AGG TGA 3'

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