概日時計は、シロイヌナズナのトランスクリプトームの約3分の規制が、計時にフィードバックされる遺伝子の割合は不明のまま。ここでは、急速に一過プロトプラスト内で発現の概日レポーターの発光イメージングを使用して、シロイヌナズナのいずれかの変異体のラインに概日表現型を評価するための方法を視覚化します。
この記事について
サマリー
要約
植物の概日時計は、環境への日々の変化を予測させます。この予測は、時間的に予測可能な生物的および非生物的ストレスに対する反応を助けます。逆に、概日リズムのタイムキーピングが乱れると、植物の健康が著しく損なわれ、農作物の収量が減少します。したがって、転写時計仕掛け自体の動きに影響を与える要因を含む、植物の概日リズムの複雑な制御を理解することが不可欠です。 >jove_content<モデル植物であるシロイヌナズナ(シロイヌナズナ)の概日異常の検査は、伝統的に、特定の変異系統を交差させて、概日時計遺伝子プロモーターからホタルルシフェラーゼをリズミカルに発現する系統にすることを含みます。このアプローチは手間と時間がかかり、突然変異体が概日表現型を持っていない場合、実を結ばない可能性があります。ここで紹介する方法論により、概日表現型の迅速な初期評価が可能になります。変異型および野生型シロイヌナズナに由来するプロトプラストを単離し、リズミカルに発現した発光レポーターでトランスフェクションし、5日間恒常光条件下でイメージングします。発光トレースは、突然変異植物の自由走行期間が野生型植物と異なるかどうかを直接明らかにします。この方法の利点は、任意のシロイヌナズナ系統を効率的にスクリーニングできることであり、その変異体背景に安定してトランスジェニックな発光時計マーカー線を生成する必要がない。
概要
ほとんどの生物は、環境への日々の変化を効率的に交渉を支援するために、内因性のタイムキーパーを持っています。このタイムキーパー、概日時計は、外部環境の予測可能な変化を先取りするために、生物の代謝および生理学の多くの側面を規制しています。 4 -例えば植物では、時間的に予測可能な病原体や草食動物の攻撃の期待が強く、全体的な感受性1を低減します。デンプン代謝はしっかりと長いまたは短日条件5で成長したかどうかを夜明けまで、最後のその澱粉の埋蔵量を確保するために、体内時計によって制御されています。確かに、24時間の環境ショーに一致する概日時計を持つ植物は、ミスマッチ期間6のクロックを実行している植物に比べて成長率、炭素固定率と生存率を増加させました。すべてのこれらのプロセスにおける概日リズムの広範な影響が最大のリズミカルなレギュレーションから三番目に大きく発生しますシロイヌナズナ7の全トランスクリプトームの。これらのリズミカルな遺伝子産物は、代謝経路、ホルモンシグナル伝達、およびストレス応答7を含む細胞プロセスの広い範囲に関与しています。その上で、タンパク質機能の直接の概日調節は、リン酸化8の概日調節およびおそらく他の翻訳後修飾（PTMを）によって確立されています。
この毎日の転写再プログラミングを駆動する概日時計の中心に/翻訳フィードバックは朝発現遺伝子を含む（TTFLs）を、ループの転写のネットワークがある発現を抑制概日時計ASSOCIATED 1（CCA1）とLATE細長い胚軸（LHY）夕方の遺伝子のCAB 1（TOC1）のタイミング、GIGANTEA（GI）と夜の複合体（EC）のメンバーの、LUX不整脈（LUX）、早咲き3（ELF3）、およびELF4 9から11まで 。一緒にウィットH 疑似レスポンスレギュレーターの -genes（PRR3、5、7、および9）ECが正レギュレータ12として機能するのに対し、TOC1は CCA1 / LHYの発現を抑制する- 14。 TTFLネットワークコンポーネントの、フィードバック機構に追加の転写後及び翻訳後の調節は、チューニング概日リズムに重要な役割を果たしています。現在までに、概日時計タンパク質の同定された最も豊富なPTMは、リン酸化15です。カゼインキナーゼ2（CK2）によるCCA1のリン酸化は、そのは、プロモーター16と概日時計17の温度補償のために重要であるが標的への結合に影響します。 PRRタンパク質を差動概日周期の上にリン酸化され、TOC1のリン酸化は、その負の調節因子との相互作用に影響を及ぼしている、夜、段階的なクロック成分ZEITLUPE（ZTL）18。これらの例は示してどのように24時間へのPTMおよびタンパク質 - タンパク質相互作用のチューニングTTFLネットワーク転写発振器。転写クロック・ネットワークとその規制のより詳細な概要については、優れた最近のレビューは、（ 例えば 、15を参照）が使用可能です。
しかし、どのようなそれほど明らか残っているのはリズミカルに戻って時計機構自体に細胞代謝フィードのプロセスや他の側面を規制する程度です。クロック欠陥のためのシロイヌナズナ変異体の大規模なスクリーニングはTTFLネットワークから24時間のリズムの生成に関与することができたメカニズムやシグナル伝達経路のさらなる理解を得ることができました。このため、Kimとサマーズは、以前に任意のシロイヌナズナライン19における時計機能の効率的かつ迅速な分析のためのブレークスルー方式を発表しました。プロトプラストにおける一過性発現の使用に基づいて、この方法は、安定したトランスジェニック系統の必要性を上回るまたは発光クロックマーカーラインに交差します。ここでは、高収量プロトプラストisolatioを可視化最適化されたプロトコルと組み合わせたn個の方法20は、96ウェルプレートリーダー中で一過性に発現クロックマーカーの蛍光イメージングによる概日欠陥をスクリーニングします。
我々は、変更された概日リズムを検出し、ここで正常に記載の方法を確認するために、十分に特徴づけクロック変異体に野生型Col- 0シロイヌナズナを比較します。 LUC 19：CCA1pro;これらの株由来のプロトプラストは、概日CCA1プロモーターからホタルルシフェラーゼを発現するレポーター構築物でトランスフェクトされています。ルシフェラーゼはルシフェリンを、これらのプロトプラストにおける転写リズムの周期、振幅及び位相を評価するために時間をかけて撮像される光21を出射する電子的に励起オキシルシフェリンに変換された多段階の反応を触媒します。
プロトコルは、三つの主要な部分で構成されています。レポータープラスミド、及び発光イムでプロトプラストをトランスフェクション、プロトプラストの単離エージング。これらの3つの部分が常に新たに調製した緩衝液および試薬を用いて、単一の日に行われるべきです。レポータープラスミドの十分な量の植物成長及び精製は、事前に行われるべきであり、このプロトコルで可視化されていません。
プロトコル
注：このプロトコルでは、記載の試薬およびボリュームがテストされるシロイヌナズナラインごとに表現され、その遺伝子型について6複製ウェルになります。複数の行を分析する場合、分析される行数を有する材料を掛けます。ビデオでは、野生型シロイヌナズナは、（追加の行からの代表的な結果が続いて提供されますが）概日時計突然変異体のラインZTLと比較されます。
| 酵素液 | |
| セルラーゼ | 0.5％（w / v）の |
| ペクチナーゼR10 | 0.25％（w / v）の |
| D-マンニトール | 400 mMの |
| CaCl 2 | 10 mMの |
| 塩化カリウム | 20 mMの |
| ウシ血清アルブミン | 0.1％（w / v）の |
| MES、pHは5.7 | 20 mMの |
| W5ソリューション | |
| NaClを | 150mMの |
| CaCl 2 | 125 mMの |
| 塩化カリウム | 5 mMの |
| MES、pHは5.7 | 2 mMの |
| グルコース | 5 mMの |
| MMGソリューション | |
| MES、pHは5.7 | 4 mMの |
| D-マンニトール | 400 mMの |
| MgCl 2 | 15 mMの |
| PEG溶液 | |
| PEG4000 | 40％（w / v）の |
| D-マンニトール | 200 mMの |
| CaCl 2 | 100 mMの |
| イメージングソリューション | |
| W5ソリューション | 最終容量 |
| ウシ胎仔血清 | 5％（v / v）の |
| ルシフェリン | 1.2 mMの |
| アンピシリン | 50 mg / mlで |
表1： ソリューションの一覧。
材料およびバッファの作製
- 植物材料
- シロイヌナズナコルを保つ-0水に種子を1.5mlチューブ中で4℃の暗所で4日間。ポットに土に種をピペットし、7日間21℃で長日条件下（16時間明8時間の暗）に移します。高湿度を確保するために、最初の3日間、鍋に蓋をしたままにしておきます。移植6新しい8センチメートルのx 13センチメートル×5センチポットに苗とanothため同じ条件で植物を成長を続けます21日えー。土壌は全体で湿っていることを確認してください。
- レポータープラスミド
- 製造業者の説明書に従ってDNA単離キットを使用して、事前に細菌の培養物からLUCレポータープラスミド19：CCA1proを精製します 。
注：20μgのレポータープラスミドをトランスフェクションのため（のdH 2 O中に2μg/μlので10μl）を必要とされます。
- 製造業者の説明書に従ってDNA単離キットを使用して、事前に細菌の培養物からLUCレポータープラスミド19：CCA1proを精製します 。
- ソリューション
注：このプロトコルのための5つのソリューションが必要とされる：酵素液、洗浄5（W5）溶液、マンニトール、マグネシウム（MMG）溶液を、ポリエチレングリコール（PEG）溶液、及び撮像溶液（ 表1）。プロトプラスト単離工程に進む前に、これらを準備します。- 表1のとおりの酵素溶液10mlを調製し、最後の酵素を追加し、フィルタは、0.22μmのシリンジフィルターを通して溶液を滅菌します。
- 次のボリュームに残っている溶液を調製：15ミリリットルW5ソリューション、10ミリリットルMMG秒表1のとおりolution、1ミリリットルPEG溶液と1.5ミリリットルのイメージングソリューション。
注：これは、PEG溶液は、PEGが完全に溶解していることを確認するために、トランスフェクション前に時間未満何を準備されていないことが重要です。フィルターは、0.22μmのシリンジフィルターを通してイメージング溶液を滅菌します。
図1：プロトプラスト単離成人シロイヌナズナ植物（A）の葉を（B）に上向き下部表皮層でオートクレーブテープで固定されています。 （C）マジックテープを穏やかに15ミリリットルコニカルチューブの先端と下側の表皮層に押し付けられます。 （D）マジックテープは葉肉細胞（E）を露出させます。 （F）休暇でオートクレーブテープのストリップ添付の溶液にプロトプラストを放出し、セルラーゼおよびペクチナーゼを含む酵素液に浮いています。 （G）は、葉の骨格は、酵素溶液（H）でプロトプラストを残して、酵素消化後、オートクレーブテープ上に残り、廃棄されます。 （I）の最終結果の葉肉プロトプラスト（スケールバー=50μm）を。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
2.プロトプラストの単離
- シャーレにラベルを付け、10ミリリットルフィルター滅菌酵素溶液を加えます。
- きれいなラボの表面に粘着面を上にしてオートクレーブテープの4ストリップを修正し、ストリップ上のペトリ皿のサイズをマーク。
- （4週齢の植物（ 図1a）の葉をカットし、オートクレーブテープに表皮上層を押してください（上を向いすなわち低い表皮面図1b））。
- ゆっくり15ミリリットルコニカルチューブを使用して、下側の表皮表面にマジックテープのストリップを押してください。葉組織（ 図1c）を鎮圧しないように注意してください。慎重に下表皮（ 図1D）を除去し、葉肉細胞（ 図1eの）を露出するためにマジックテープをやってのけます。
- ペトリ皿にテープを移動し、酵素液（ 図1F）上に浮遊するように、使用ピンセットをペトリ皿に合うようにオートクレーブテープをカットし、下向きに残します。プロトプラストを溶液中に放出される時に60分のためのプラットフォームシェーカー上で60rpmで回転させます。
- オートクレーブテープ片を除去し、廃棄するためにピンセットを使用します（ 図1グラム ）と50mlコニカルチューブにプロトプラスト（ 図1H）を含む溶液をピペット。 （端を切断して、このようなP5000チップまたはP1000チップとして）ワイドボアピペットチップを使用してください。
- 遠心分離機100 xにおけるプロトプラスト4℃で3分間グラムとピペットで上清を除去します。ペレットは非常に緩んでいるとして、注意してください。
- チューブを穏やかに渦巻くことにより、10ミリリットルのW5プロトプラストに対する解決策と再懸濁を追加します。
- 30〜60分間氷上でプロトプラストを休ま。このステップの間、血球計数器（ 図1I）にプロトプラストをカウントすることにより、歩留まりを評価します。
- 4℃で3分間、100×gでの遠心分離によってプロトプラストを収集し、ピペットで上清を除去します。ペレットは非常に緩んでいるとして、注意してください。
- MMG溶液中の5×10 5個のプロトプラスト/ mlの濃度にプロトプラストを再懸濁します。
3.プロトプラストトランスフェクション
- 15ミリリットルコニカルチューブに10μlのレポータープラスミド（2μgの/μl）を追加します。
- チューブに400μlのプロトプラストを追加します。
- 1ボリューム（410μl）をPEG溶液を追加し、プロトプラストをトランスフェクションするためにチューブを穏やかに12回転倒混和します。
- 8-15分INC後室温でubationは、4つのボリューム（1640μL）W5溶液でプロトプラスト-DNA-PEG混合物を希釈し、軽く6回転倒混和します。
- 室温で2分間100×gで遠心分離することによってトランスフェクトされたプロトプラストを収集し、ピペットで上清を除去します。ペレットは非常に緩んでいるようにもう一度、注意してください。
- 1250μlのイメージングソリューションでプロトプラストを再懸濁します。
- 6へのアリコート200μlを、96ウェルプレートのウェルを複製W5溶液で任意の空のウェルを満たし、及び発光イメージングに適した接着剤明確な蓋でプレートをシール。
4.イメージング
- 植物イメージングに適した任意の発光イメージングセットアップにプレートを転送します。撮影を開始し、その後、ウェル間の凝縮および圧力の違いを回避するために、転送した後、プレート上に接着剤の蓋に10〜15分を変更します。室温で5日間のプレート毎〜45分（ウェル当たり3秒）を読みます。
注記：プレートの頻度は、読み取り、ウェルあたりのリードタイムは、撮影設定によって異なります。
5.データ解析
- 任意の解析ソフトウェア（例えば、生体リズム解析ソフトウェアシステム（BRASS）22）を用いた発光結果を分析します。概日の欠陥を明らかにするために、野生型コントロールに変異体のラインを比較してください。
結果
野生型シロイヌナズナのプロトプラストは、既知のクロック突然変異体CCA1 / LHY（短周期変異体2）、ZTL（長周期変異体23）、および過剰発現ラインCCA1 -OX（24不整脈）と比較しました。すべては一過CCA1proにトランスフェクトした：LUCレポーターと5日間にわたってプレートリーダー上で一定の光で画像化。
ここでは、CCA1 / LHYの変異体では、概日制御遺伝子発現の自走期間は発光クロックの安定したトランスジェニック発現が2,9マーカーによって分析公開期間に合わせて、（ 図2a）を短縮することを示しています。 ZTL変異体のプロトプラストにおける概日振動の周期は、野生型に比べて長くなっている（ 図2b）、苗から以前に発表された結果に応じて、細胞懸濁液のcultu解像度およびプロトプラスト19,23,25。
CCA1の過剰発現は午前位相でクロックをロックし、グローバルな転写は不整脈24になります 。一貫して、我々はCCA1proに全く振動を観察されない：CCA1 -OX プロトプラストにおけるLUC発現 （ 図2c）。
図2：Col- 0のプロトプラスト概日リズムプロトプラスト、CCA1 / LHY、ZTL、とCCA1 -OX 一過CCA1proで形質転換した：LUCは、構築し、発光の概日リズムは、5日間で画像化した（A - C）。 （D）コル-0、CCA1 / LHYとZTL（A - B）での発光トレースに基づいて概日周期を推定。私に±SEM、nは3-5、t検定のp値示されているように。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 遺伝子型 | 期間（プロトプラスト） | 期間（トランスジェニック） | によって報告されました： | リファレンス |
| Col- 0 | 23.0±0.21 | 24.4±0.09 | pCCA1：コルでLUC -0 | （2） |
| CCA1 / LHY | 20.6±0.13 | 19.9±0.11 | pCCA1：コルでLUC -0 | （2） |
| 〜18 | L 小胞体のバックグラウンドでのRNA | （9） | ||
| ZTL | 25.1±0.12 | 27.4±0.5 | CAB2：C24生態型でLUC | （22） |
| CCA1 -OX | 不整脈の | 不整脈の | pCCA1：LUC（LDデータのみ） | （2） |
| 不整脈の | コル-0バックグラウンドでRNAとタンパク質 | （23） |
表2：トランスジェニック苗に比べてプロトプラストにおける概日リズム pCCA1の概日期間：期間最初の変異について報告長さと、利用可能な場合と比較してプロトプラストにおけるLUC発現 、pCCA1と：コル-0でLUC式 。
ディスカッション
ここでは、プロトプラストの分離、トランスフェクション、およびluminecentイメージングを含むシロイヌナズナ系統における概日周期欠陥をスクリーニングするための迅速なアッセイを、提示します。野生型シロイヌナズナとクロック突然変異体CCA1 / LHY、ZTL、及びCCA1 -OXにおける概日周期はCCA1proからの発光の測定値から算出した：LUCレポーター、よりタイムを使用して、全体の植物から生成された公開されたデータと一致することが見出されかかるトランスジェニックアプローチ（ 表2）。シロイヌナズナ変異体をスクリーニングするために、このアッセイを使用することは時間がかかり、かつ、特定の変異体は、野生型のリズムを示すことを明らかにする可能性がある、トランスジェニック輝線を生成するための初期要件を回避します。このプロトコルの明確な利点は、植物における計時に影響を与える複数の遺伝子の同定を助けるであろう、任意のシロイヌナズナラインが変更された概日転写リズムのために短時間でスクリーニングすることができるということです。
プロトプラストの単離は、変異体のラインが矮小化表現型を表示する場合は特に、面倒なことができます。プロトプラストを生成するために、以前に報告された方法は、酵素が細胞壁26,27に到達させるために、酵素溶液でストリップを浸潤薄いストリップと真空中に葉や苗を切断することを含みます。その後の消化酵素溶液にプロトプラストを解放するために暗闇の中で、少なくとも3時間のインキュベーションを必要とします。真空浸潤を適用しない場合は、18時間のインキュベーション時間アップをお勧めします。酵素に対する不透過性上皮細胞層がテープによって除去されるので、ここに提示プロトコルでは、真空浸潤は不要です。植物材料を切断してプロトプラストを生成する際には、消化後に細胞壁の破片からプロトプラストを分離する必要があります。これは、典型的には、溶液を濾過または糖勾配27,26上で精製することにより行われます。ここでは、任意の未消化の組織は、後にオートクレーブテープ上に残ります消化ので、プロトプラストの濾過および糖勾配精製を省略することができます。長時間のプロトプラストの手順に起因するストレスが細胞生存率と概日時計に影響を与える可能性があります。ここで可視化し、テープベースのプロトプラスト法20は、プロトプラストの高い数を出します。概日、時系列上での細胞の生存能力を与えられ、プロトプラスト全体実生（ 表2）のマッチング期間の長さは、ここで説明する方法は、プロトプラストを生成するための代替方法よりも好ましいです。
プロトコルのトランスフェクション工程は、そのプロトプラストの生存率に影響を与える重要なステップです。 PEG溶液は、この溶液（段階3.4）で細胞に送達されるDNA、および両方のインキュベーション時間を可能にし、PEGの比率は、経験的に決定されるべきです。標準濃度が低い形質転換効率を低下させる濃度以上では、20％であり、生存能力28を減少させる濃度。 5分ほどの短いインキュベーション時間は、プロトプラスト27の効率的なトランスフェクションをもたらす可能性があります。
プロトプラストは、任意の発光イメージングプラットフォーム上に結像することができます。このビデオでは、我々はハイスループットスクリーニングおよび頻繁な測定を可能にします（〜20μEの複合強度で、それぞれ、赤と青のLED、630および470 nm）の外部ライトを搭載した発光プレートリーダーを、使用しています。照明は、光合成のために利用可能であるような電荷結合素子（CCD）カメラをベース代替プレートリーダーやセットアップなどの発光を検出する他の撮像装置は、長いように等しく良好に適用することができます。制御キャビネットに搭載されたCCDカメラを使用することの利点は、軽量で、温度をプログラムすることができます。欠点は、混乱させるに加えてプロトプラストにストレスを引き起こす可能性が暗闇の長期間を導入し、より長い捕捉時間です内因性の計時をる。かかわらず、実験プラットフォームが選択された、設定の調整は、苗や成熟植物の設定に比べて必要である可能性が高いです。我々の経験では、イメージング・バッファ内のトランスフェクションおよび/またはルシフェリン中にレポータープラスミドの濃度を増加させると、初期の実験で発生する可能性のある不規則なまたは迅速湿リズムを解決する可能性があります。
将来の実験では、ここで説明する方法は、任意の変異シロイヌナズナ線の概日表現型を研究するために適用することができます。軽微な変更では、計時上など様々な薬物の効果は、このセットアップで研究することができました。さらに、トランスフェクションは、さらに、このプロトコルの汎用性を拡大する、19遺伝子サイレンシングのための人工マイクロRNAを含むように修飾することができます。イネプロトプラストを生成するためのプロトコルは、29十分に確立されており、ここで紹介する撮像プロトコルは、均等に私たちのUを促進するために適用することができます経済的に重要な単子葉作物植物におけるクロックのnderstanding。
開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
ルシフェラーゼレポータープラスミドと初期メソッド開発について、David Somers教授とJeongsik Kim博士に感謝します。Karen Halliday教授は、この研究で使用されたすべての概日突然変異株を提供してくれました。この研究は、Royal Society Research Grants RS120372 and RS140275 の支援を受けました。GvOは、ロイヤル・ソサエティ大学のリサーチフェロー(UF110173)です。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| セルリシンセルラーゼ、Trichoderma viride | メルクミリポア | 219466 | |
| ペクチナーゼR10 | シグマアルドリッチ | P2401 | |
| D-マンニトール | シグマアルドリッチ | M4125 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P3911 | |
| ウシ血清アルブミン | Sigma Aldrich | A4503 | |
| MES | Acros Organics 327765000 | ||
| NaCl | Acros Organics | 327300010 | |
| Glucose | Fischer Scientific | G/0500/60 | |
| MgCl<サブ>2 | シグマアルドリッチ | M2670 | |
| ポリエチレングリコール(PEG)4000 | アクロスオーガニック434630010 | ||
| ウシ胎児血清 | Sigma Aldrich | F4135 | |
| D-Luciferin, Firefly | Biosynth AG | L-8200 | ルシフェリン粉末を0.1 M三リン酸緩衝液pH 8.0に50 mM |
| アンピシリン | Sigma Aldrich | A9618 | |
| 蒸気インジケータテープ | 3M | 1222 | |
| マジックテープ | 3M | 819-1460 | |
| ペトリ皿 | 科学研究所用品 | SLS2002 | |
| マイクロプレート、96 ウェル、平底、白色 | Greiner Bio-One | 655075 | |
| TopSeal-A、96 ウェル プレート用接着蓋 | Perkin Elmer | 6050195 | |
| シリンジ、10 ml、針なし | BD Plastipak | 302188 | |
| シリンジ フィルター 0.22 & マイクロ;m | メルクミリポア | SLGP033RS | |
| 生物学的リズム分析ソフトウェアシステム(真鍮) | amillar.org で無料ダウンロード | ||
| QIAfilter Maxiprepキット | Qiagen | 12262 | |
| 修正フックローゼンタール計数室、ダブルセル | ホークスリー | AC6000 | |
| 明視野顕微鏡 | Optika 顕微鏡 | B-150POL-B | |
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参考文献
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