出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用

サマリー

特定のタンパク質の役割や突然変異の影響について、しばしば重要な洞察を得ることができます。この論文では、定量的蛍光顕微鏡法とフローサイトメトリーを使用して、生細胞のエンドサイトーシスイベントを定量化するためのツールとして、pH感受性GFPバリアントである超黄道pHluorinを使用する方法を示します。

要約

緑色蛍光タンパク質（GFP）およびその変異体は、広くタンパク質の局在や、細胞骨格の再構築と生きた細胞内小胞輸送などのイベントのダイナミクスを研究するためのツールを使用しています。キメラGFP融合物を用いた定量方法は、多くの用途のために開発されています。しかし、GFPは、タンパク質分解に対して多少耐性があるので、その蛍光は、エンドサイトーシス経路に貨物輸送の定量化を妨げる可能性がリソソーム/液胞に持続します。エンドサイトーシスとエンドサイトーシス後の人身売買のイベントを定量化するための別の方法はsuperecliptic pHluorin、酸性環境中で急冷されるGFPのpH感受性の変異体を使用しています。多胞体（MVBs）およびリソソーム/液胞の内腔への配信への貨物の取り込み時に蛍光の減衰における膜貫通貨物タンパク質結果の細胞質尾部にpHluorinのキメラ融合。このように、液胞蛍光の消光はquantifiを容易にエンドサイトーシスとエンドサイトーシス経路における初期の事象のカチオン。本稿では、フローサイトメトリーを用いて、蛍光顕微鏡を介したエンドサイトーシスの定量化のためのpHluorinタグ付き貨物だけでなく、集団ベースのアッセイを使用する方法について説明します。

概要

小胞輸送は、真核細胞内小器官の同一性および機能を維持する上で重要な役割を果たし、個々の細胞区画のタンパク質および膜組成を調節するための重要なメカニズムです。エンドサイトーシスを介して生成された小胞は、その後のリサイクルまたはリソソームに標的化するための表面から膜およびタンパク質を除去に対し、原形質膜で、エキソサイトーシス小胞の融合は、細胞の表面に新たなタンパク質や膜を実現します。このように、エンドサイトーシスは、栄養摂取のためおよび細胞外環境への応答のために重要です。エキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスは、形質膜の表面積を調節するため、および損傷を受けたタンパク質の代謝回転を可能にするようにバランスされています。

酵母および哺乳動物細胞での研究には、専用の様々なことに応答して、エンドサイトーシスに関与するタンパク質の大規模な数、ならびに特定の貨物の内在化を促進する複数のエンドサイトーシス経路またはその行為を同定していますvironmental条件。最もよく研​​究経路は、クラスリンおよびサイトゾルアクセサリータンパク質は、発生期のエンドサイトーシス小胞を安定化させるためにコート構造に集合したクラスリン依存性エンドサイトーシス（CME）、です。出芽酵母サッカロマイセス・セレビシエにおける実験は、力学と多くのエンドサイトーシスタンパク質^1-3のための募集のために重要な洞察が得られています。特に、CMEの機械は非常に進化の過程で保存されているような酵母におけるCME関連タンパク質の大部分は人間のオルソログを持っていること。このように、出芽酵母は、高等真核生物に保存されているエンドサイトーシスのメカニズムを理解するための重要なツールとなっています。例えば、出芽酵母を用いた研究では、追加のエンドサイトーシスのアクセサリーの動員に続いて、CME構造（酵母における皮質アクチンパッチと呼ばれる）の形成と成熟がクラスリンと貨物結合アダプタータンパク質で始まる、多くのタンパク質の順次募集を伴う決定しましたタンパク質、ARP2 / 3媒介アクチン重合の活性化、および小胞の切断の^1,2に関与するタンパク質の動員。皮質アクチンパッチにCME機械タンパク質の募集は、高度に秩序とステレオタイプのプロセスであり、多くのタンパク質のための募集の正確な順序は、CMEの機械の他の構成要素に関して確立されています。重要なことは、最近の研究では、哺乳動物細胞⁴でクラスリン被覆ピットでのCMEのタンパク質のための募集の同様の順序を確認しています。

CMEに加えて、多くの細胞型は、原形質膜^5-7の小胞形成および内在化を促進するための代替メカニズムに頼る一つ以上のクラスリン非依存性エンドサイトーシス（CIE）の経路を有します。酵母では、我々は最近、低分子量GTPase Rho1とその活性化グアニンヌクレオチド交換因子（GEF）、ROM1 ^8,9を利用CIE経路を同定しました。 Rho1は、アクチン重合^1を促進するためにformin Bni1を活性化させます酵母¹²でクラスリン非依存性エンドサイトーシスは、このフォームに必要とされる0,11、。また、タンパク質のα-アレスチンファミリーは、CME ^13-17を通じて貨物のユビキチン化およびその後の内在化を促進し、またおそらくCIE ¹⁸に関与するタンパク質との直接的な相互作用を介して、CIE経路を介して貨物の内在化を促進するために、ユビキチンリガーゼRSP5を募集します。 CIE経路の様々なもRho1オルソログ、RhoAの^9,19に依存しているクラスリン依存せず、食作用経路を含めた哺乳動物細胞、中に存在します。哺乳類CIEにおけるRhoAの役割は十分に理解されていません。従って、出芽酵母での研究は、哺乳類のCIEに適用可能な追加の機械的な洞察を提供してもよいです。

エンドサイトーシス事象の正確な定量は、エンドサイトーシスを調節する特定のタンパク質の役割に関する重要な情報を提供することができ、および貨物の内在またはprogressio上の変異の影響を明らかにすることができますエンドサイトーシス経路を介して、n個。この目的のために、生化学的方法は、リガンドの取り込みを監視するために、またはエンドサイトーシス積荷タンパク質の分解の速度を測定するために利用することができます。生細胞において、関心対象の貨物に緑色蛍光タンパク質（GFP）及びその変異体の融合は、貨物輸送の直接可視化を可能にします。 GFPは、（酵母または液胞）リソソームでの分解に耐性があるのでしかし、GFPタグ貨物は、エンドサイトーシスの定量化のための使用が制限されています。また、GFP蛍光は、pHの変化に部分的にのみ敏感であり、液胞ルーメン^20,21内で検出可能なままです。その結果、GFPタグの蛍光は、貨物の残りの部分が劣化したずっと後に液胞に固執し、貨物の強度の全細胞ベースの定量化が原因液胞の長期的なGFP蛍光に不正確になることがあります。

液胞GFP蛍光の欠点を克服するために、我々は、以前にsuperecliptic pHを使用しましたluorin、中性pHで明るく蛍光を発するが、そのようなリソソーム液胞/ ^20,22,23の内腔などの酸性環境下で蛍光を失うGFPのpH感受性変異体です。エンドサイトーシス貨物の細胞質尾部にpHluorinタグを配置することは、原形質膜でとpHluorinタグが細胞質（ 図1A）に露出したまま初期エンドソーム、上の荷物の可視化を可能にします。初期エンドソームが成熟するにつれ、エンドソームは、多胞体^{（MVBs）24を}生成^し 、エンドソームの内腔に出芽小胞への輸送のために必要な複雑な（ESCRT）機械パッケージ表面局在貨物を仕分け。内部MVB小胞に組み込まれている貨物については、pHluorinタグは小胞内腔に向いています。内部MVB小胞が酸性化されています。彼らはMVBs ²⁰に成熟としてこのように、pHluorinタグ付きカーゴは、初期エンドソームの蛍光を失います。液胞とMVBのその後の融合は、MVB腔の内容を提供します分解のために、とpHluorinタグは液胞内腔の酸性環境中で急冷したまま。

本稿では、酵母における細胞質pHluorinタグで貨物を用いた定量的エンドサイトーシスアッセイの詳細な説明を提供します。 pHluorinタグ貨物を発現する株は、特定の貨物の性質および輸送の挙動に応じて、運動及び/又はエンドポイントアッセイに使用することができます。さらに、いくつかのpHluorinタグ貨物は、フローサイトメトリーなどのハイスループット分析法に適しています。重要なことは、pHluorinタグは、野生型と変異株におけるエンドサイトーシス機能のエンドサイトーシスとの比較の定量化を可能にする、生きた細胞内のエンドサイトーシス事象を研究するための汎用性の高いツールです。

プロトコル

1.ソリューションとメディア

1. 続いて株式、メディアやプレートを準備します。
   1. 10×YNBを調製するために、水1Lにアミノ酸を欠く酵母窒素塩基、67 gで溶解します。 0.22μmのニトロセルロースフィルターを通して濾過することにより滅菌します。
   2. （無菌の50％のw / vのストックから）2％デキストロースで（10×ストックから）1×YNBを使用して、YNB培地を準備し、1×アミノ酸/栄養混合物（100×ストックからは、ステップ1.1.4を参照してください）。必要に応じて、プラスミド選択のために、個々のアミノ酸や栄養分を省略します。 Mup1発現の誘導のために、追加的なアミノ酸/栄養混合物からメチオニンを省略します。
   3. 1×YNB（10×ストックから）、（無菌の50％のw / vのストックから）2％デキストロース、0.7グラム/ Lのアミノ酸/栄養混合物（ステップ1.1.5を参照）、および2.5％寒天を使用したYNBプレートを準備します。寒天の25グラム、水の860ミリリットルあたりのアミノ酸/栄養混合物の0.7グラムをオートクレーブで平板培地を準備します。その後、100 10×YNBのミリリットルと40ミリリットルOを追加し、混合物を55℃に冷却させます50％グルコースF。 4℃でプレート（約30ミリリットル10cmディッシュあたり媒体の）、媒体が室温で固化することを可能にする、と店のプレートを注ぎます。
   4. 脱イオン水100mlに、以下溶解することにより（液体培地の場合）100Xアミノ酸/栄養ストック溶液を調製：0.1グラムのL-メチオニン、0.3 gのL-ロイシンおよびL-リジン、および0.2 gのL-ヒスチジンのそれぞれの各、L-トリプトファン、アデニンおよびウラシル（特定の株について、必要に応じて他のアミノ酸および栄養素が含まれていてもよいです）。必要に応じて溶解し、そして0.45μmのニトロセルロースフィルターを通して滅菌するために穏やかな熱を使用してください。光から保護して室温で保管してください。プラスミド選択のために、必要に応じて特定のコンポーネントを欠くストック溶液を準備します。
   5. 以下を組み合わせることによって（プレート用）アミノ酸/栄養混合物を準備し、アデニンを0.5g、L-ロイシンを4g、2 G〜Lヒスチジン、L-リジン、L-メチオニン、L-トリプトファン、L-各チロシンとウラシル。乳鉢と乳棒で挽く、そしてプロで保存光からtection。プラスミド選択のために、必要に応じて特定のコンポーネントを欠いた混合物を製造し、（ステップ1.1.3を参照）平板培地1リットル当たりのアミノ酸混合物の0.7グラムを使用します。
2. コンカナバリンA（ConAを）とスライドの表面をコーティングすることにより、顕微鏡検査のための8ウェルチャンバースライドを準備します。チャンバースライドの各ウェルに、水に溶解した2 mg / mlでのConAの25μlを添加します。ピペットチップを使用して、その後、少なくとも4-8時間室温で空気乾燥さスライドを可能にする、井戸の底表面を横切ってのConAを広げます。理想的には、ConAをコーティングの24時間以内にチャンバースライドを使用しています。
3. ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）Longtine らベース積分法を用いて、関心のエンドサイトーシス貨物にGFPまたはpHluorinのインフレーム融合物を有する酵母株を生成します。そして、ゴールドスタインとマッカスカー^25,26。
   注：pHluorinを含むプラスミドは、カナマイシン（KANMX6）とヌーセオスリシンのための抵抗性遺伝子とのカセットをタグ付け（ NATMX4）は、以前に²⁰に説明されました。
   1. ゲノム組み込み^20,25のサイトに固有の付加的な配列を含むプライマーを用いて選択マーカーを含むGFPまたはpHluorinカセットを増幅します。
   2. 酢酸リチウム法^27を用いて、所望の酵母株に得られたPCR産物を形質転換します。
   3. 適切な薬物を含有するYPDプレート上で細胞を増殖させることによって、カセットの組み込みのために選択します。プレートを、オートクレーブ10gの酵母エキス、20gのペプトン0.1グラムのトリプトファン960 mlの水における25gの寒天を調製しました。プレートを注ぐ前に、混合物は、次いで、グルコースとKANMX6選択のために200μg/ mlの最終濃度のG418か、ヌーセオスリシンを100μg/ mlの最終濃度のために、40 mlの50％追加し、55℃に冷却しますNATMX4選択 。
   4. 抗GFP抗体を用いたPCRおよび/またはウェスタンブロッティングにより個々のコロニーでGFPまたはpHluorinタグの統合を確認し、同様に、蛍光顕微鏡²⁰によりタグ付けされたタンパク質の検出によって。
      注：この研究で使用される特定の酵母株およびプラスミドを、それぞれ、 表1および2に記載されています。

構成的に内在化エンドサイトーシス貨物の定常状態蛍光2.エンドポイントアッセイ

1. （該当する場合）プラスミド維持のために必要とされるアミノ酸または栄養素を欠くYNB培地5mlで細胞（〜3小コロニー）を接種します。 250 rpmで振盪しながら、30℃で軌道振盪インキュベーター中で16-24時間細胞を増殖させます。また、アミノ酸またはプラスミド選択のための栄養素を欠くYNBプレート上に細胞のストリークA〜1〜2ミリメートルのコロニーと30℃で一晩細胞を増殖させます。
2. 分光光度計を使用して各一晩培養物の密度（OD _600）を測定_します 。 PLAのためのアミノ酸または栄養素を欠いたYNB培地中で0.35から0.4 OD ₆₀₀ / mlで5mLの希釈物を調製しSMIDメンテナンス、そして振盪しながら30℃で約3時間成長します。使用した細胞は、プレート上にストリークした場合、このステップをスキップし、ステップ2.4（下記参照）に進みます。
3. 今0.6から1.0 OD ₆₀₀ / mlの間であるべきである細胞の密度（OD _600）を 、測定します。 2分間8,000rpmで（6800 XG）で1.5マイクロチューブに培養物1ml、ペレット細胞を転送します。上清の1475μLを削除します。
4. 蛍光顕微鏡に細胞を持参してください。各サンプルを画像化する前に、残りの培地中で細胞を再懸濁することにより、スライドを準備し、カバースリップの下で細胞懸濁液の3μLをマウントします。プラスミドの選択のための適切なYNB培地を用いて、手順3に下記のように代替的に、8ウェルチャンバースライドを準備します。 100X、1.4以上の開口数（NA）の油浸対物レンズ、12または16ビットのカメラ、およびGFP蛍光のために最適化された励起/発光フィルターを有する理想的には、画像セル。
   注：使用して、細胞がoストリーキングによって成長させた場合ナプレートは、カバースリップ上で新鮮なYNB培地の3μLを配置することによって、スライドを準備します。ピペットチップを使用して、プレートから細胞の小コロニーを収集YNB培地に細胞を分散し、撮影直前にスライドガラス上に得られた懸濁液をマウントします。
5. 画像実験内のすべての画像に対して同じ取得パラメータ（ すなわち 、フィルタセット、および露出時間）を使用して、各条件についての細胞の4-6ランダムフィールド。
   注：各フィールドの明視野またはDICの画像を収集することpHluorin信号がMVBと液胞のコンパートメント中で急冷された細胞のために役立つことができます。
6. 各条件について、少なくとも30-50細胞の蛍光強度を定量化（プロトコル5参照）。

規制エンドサイトーシスを受けるようにして貨物のエンドサイトーシスの定量化のための3キネティックアッセイ

1. メチオニンを欠くYNB培地5ml中の酵母細胞（コロニーあたり直径約2mm）の2~3コロニーを接種し、追加プラスミドの選択を維持するためitionalアミノ酸または栄養。振盪しながら30℃で16〜24時間培養を成長させます。
   注：この論文では、規制のエンドサイトーシス貨物タンパク質を研究するためのプロトコルは、メチオニン透過酵素、Mup1を利用します。規制エンドサイトーシスを受ける他の貨物もpHluorin（例えば、ウラシルは、ウラシルの非存在下で細胞膜に蓄積FUR4を、パーミ、外部ウラシル印加に応答して内在）でタグ付けするのに適しています。これらの貨物のために、培地条件は、その貨物のための特異的な発現、誘導および内在化の条件を反映するように変更する必要があります。
2. 約3時間イメージング前に各一晩培養物の密度（OD _600）を測定_します 。プラスミドの維持のためにメチオニンおよび追加のアミノ酸や栄養分を欠くYNB培地で0.35から0.4 OD ₆₀₀ / mlで5ミリリットル希釈を準備し、そして振盪しながら30℃で成長します。
3. マイクロを事前に平衡化ステップ3.2の3時間のインキュベーションの間に30℃までの環境室や加熱されたステージを（使用可能な場合）も対応。
4. 2分間8,000rpmで（6800 XG）で微量遠心管に移し、細胞培養物の1ミリリットルを、ペレット細胞。上清の975μLを削除します。
5. イメージングのためのConAで処理し、8ウェルのガラス底のチャンバースライド（プロトコル1.2）を準備します。
6. 各ウェルにプラスミド選択のためのメチオニンおよび追加のアミノ酸や栄養分を欠くYNB培地200μlのを追加します。残りの上清のステップ3.4から細胞ペレットを再懸濁し、そして各ウェルの中央に細胞懸濁液の2.5μLをドロップします。上下にピペッティングによりウェルの表面を横切って細胞を分散し、細胞は5〜10分間沈降することを可能にします。
7. 30°C（ステップ3.3参照）に平衡化した倒立蛍光顕微鏡上のチャンバースライドを置きます。明視野照明を用いた細胞のフィールドを探します。
8. 100μg/ mlのメチオニンを含むYNB培地50μlのを追加20μg/ mlの最終メチオニン濃度を得るために、ウェル中の培地200μlに（30℃に予め温めておきました）。底から浮いから細胞を防止するために、ウェル中の培地を中断することは避けてください。
9. 細胞は撮影を開始する前に2分間平衡化することができます。すぐに最初の画像をキャプチャする前に、所望の焦点面に顕微鏡を調整します（一般的に、赤道焦点面が最適です）。
10. 45〜60分間、5分間隔でGFP及び明視野（またはDIC）画像を取得し、GFPフィルターを用いた時系列内のすべての画像に対して同一の取得パラメータを用いて（例えば、100×1.4 NA油浸対物レンズおよび500ミリ秒の取得時間、100ミリ秒の取得時間DICフィルタを使用して）。
    注：顕微鏡のステージとイメージングソフトウェアは、焦点面のずれの自動補正を可能にしない場合は、手動で各撮像時点の前に焦点を再調整する必要があるかもしれません。また、取得時間はなります照明やフィルタの違いに顕微鏡の間で変動し、最適な条件は、実験を開始する前に手動で決定されるべきです。 Mup1以外のエンドサイトーシス貨物が使用される場合、その貨物の内在化動態を反映するように、取得時間と撮影間隔、ならびに実験の持続時間を変更する必要があるかもしれません。
11. 各時点における個々の細胞の蛍光強度を定量化（プロトコル5参照）、第1の画像の最初の強度の割合として値を表します。

規制エンドサイトーシスを受けるようにしてエンドサイトーシス貨物の定量4.エンドポイントアッセイ

1. プロトコル3で説明したようにイメージングのための細胞を調製（3.6を通じて3.1ステップ）。
2. 画像直ちに明視野およびGFPフィルターセットを使用して、メチオニンを添加する前に、各条件のための細胞の4-5ランダムフィールド。
3. 100μg/ mlのメチオニン（戦前を含むYNB培地50μlのを追加20μg/ mlの最終メチオニン濃度を得るために、ウェル中の培地200μlに、30°C）に対してMED。底から浮いから細胞を防止するために、ウェル中の培地を中断することは避けてください。
4. 0分の時点（ステップ4.2）と同じ取得パラメータを用いて、メチオニンの添加後の細胞の画像4-5ランダムフィールドは、30分、。
5. 各時点で少なくとも30〜50細胞の蛍光強度を定量化（プロトコル5参照）。式を使用して30分後に内在Mup1-pHluorinの割合としてエクスプレス値は： - X 100％[0分で平均強度] / [30分で強度を平均0分で強度の平均します]。
   注：それは同時に各アッセイの開始時間をずらすことにより、8エンドポイントアッセイまで行うことが可能である。表3は、8つの同時アッセイのためのワークフロー例を提供します。

5.買収後の分析

1. 1として収集ソフトからエクスポート画像6ビットのタグ付きイメージファイル形式（.tifまたは.tiffの形式）。
   注：他のファイル形式も好適であり、理想的には可逆圧縮アルゴリズムを使用する必要があります。 8ビット画像は、一般的に定量化目的には適していません。
2. 存在する場合「ファイル」メニューの「開く」オプションで自由に利用可能なImageJソフトウェアを使用して、開いているファイルには、（。（細胞の位置を同定し、死細胞を排除するための基準として定量化のために蛍光画像を使用し、明視野/ DICイメージ）、DICが表示およびGFPの励起/発光フィルターを見たときに自家蛍光されている生きた細胞よりも暗く表示されます。
3. 蛍光画像の背景減算を実行します。不均一なバックグラウンド信号の画像については、「Processメニュー」に見られる「背景差分」アルゴリズムを使用します。一般的に定量化の目的のために十分である、デフォルトの設定（50ピクセルのボール半径をローリング）を使用します。
   注：代替backgro均一な背景を持つ画像のためウントサブトラクション法は、ステップ5.3.1.-5.3.2に記載されています。しかし、上記の方法はまた、均一なバックグラウンドで動作します。
   1. 均一な背景を持つイメージの場合（ すなわち 、バックグラウンド強度は、すべてのエッジで、画像の中心にほぼ一定である）、手動バックグラウンド減算を行います。メインImageJのウィンドウで見つかった「フリーハンドの選択」ボタンをクリックして、細胞を含まない画像内3-5ランダムな領域を選択します。
   2. 「分析」メニューにある「設定測定」機能を開き、「平均グレー値」パラメータを選択し、（また、「分析」メニューにある）「メジャー」機能を使用して強度値を測定します。 3-5測定領域からの平均値を計算し、そのイメージ内のすべての後続の測定値から減算します。
4. 動的アッセイ（プロトコル3）の定量化のために、ティムのための単一の、積み重ねられた画像を生成Eシリーズ。時系列順に各時点から蛍光画像を開き、（スタックのサブメニューの下で、「イメージ」メニューにあります）機能 'をスタックにイメージ'を使用してスタックを生成します。
5. 可能性として細胞の外側細胞全体が、わずか面積を含まれていることを確認し、フリーハンド選択ツールを使用してセルの輪郭を描きます。
6. 次のパラメータを測定します： 'エリア、統合密度」と「平均グレイ値'。 「分析」メニューにある「設定測定」機能を、使用してパラメータを選択します。
   注：統合密度は、選択された領域内のすべての画素強度の和に相当し、平均グレー値[集積密度/エリア]に対応し、セルサイズの輝度値を補正します。
7. 「ツール」サブメニューの下で、「分析」メニューにある「ROI Manager」を開きます。 ROIマネージャウィンドウで、ハイライトされレジオを入力して「追加」ボタンをクリックしてください関心領域（ROI）の新しい領域としてのn。
8. 繰り返しは、画像内の残りのセルのために5.6を介して5.4を繰り返します。明/ DICおよび蛍光（死んだ細胞はDIC画像では暗く表示され、GFPの励起/発光で見たときの自家蛍光細胞質シグナルを持っている; 図2Fを参照）によって評価されるように任意の死細胞を除外し、画像のエッジに触れる任意の細胞。 「ROIマネージャ」ウィンドウの「詳細」ボタンをクリックすることで、.zipファイルとして選択されたROIを保存し、スプレッドシートや統計解析ソフトウェアにすべての測定値をエクスポートします。
9. 動的アッセイ（プロトコル3）の定量のために、概要と手順5.4と5.5で説明したように最初の時点からセルを測定します。実験では、後続のすべての時点の測定に同じROIを使用してください。
10. エンドポイントアッセイ（プロトコル2および4）については、各条件について30-50細胞の最小値を測定します。少なくとも2-3の画像について定量化を行い、各内のすべてのセルが含まれます分析のステップ5.8に概説された基準を満たすイメージ。
11. 事後解析のためのTukeyの多重比較検定に続く一方向ANOVAを使用して、サンプル間の統計的有意性を評価します。

フローサイトメトリーによるMup1-pHluorinエンドサイトーシスの6人口分析

1. メチオニンおよびプラスミドの選択を維持するための付加的なアミノ酸または栄養素を欠いたYNB培地0.5mlに、酵母細胞（コロニーあたり直径約2mm）の2~3コロニーを接種します。ローラードラム上で30℃で16〜24時間、5 mLの丸底チューブに細胞を増殖させます。
2. プラスミドの維持のためのメチオニンおよび追加のアミノ酸や栄養分を欠くYNB培地の1.5ミリリットルを追加し、ローラードラム上でさらに3時間、30℃で成長します。
3. 転送2 5ミリリットル丸底チューブの各々への細胞の1ミリリットル。第1のチューブ（-Met状態）にYNB -Met媒体の0.25ミリリットルを加え、および100μgを含むYNB培地の0.25ミリリットル第二の管/ mlのメチオニンを20μg/ mlの（+ Metの条件）の最終メチオニン濃度を得ました。ローラードラム上で45分間、30℃で細胞をインキュベートします。
4. 貨物の内在性の尺度として、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）フィルターから細胞の大きさの尺度、およびMup1-pHluorin蛍光強度として前方散乱（FS）を選択、フローサイトメトリーにより細胞を分析します。
5. 使用されている酵母細胞の大きさの範囲と蛍光強度を検出を最適化するためにFSとFITCチャンネルの電圧を調整するスライダボタンを使用します（これらの実験のために、使用される設定は、FS用の50 VおよびFITC用400 Vでした）。
   注：両方のチャネルの電圧が使用されているフローサイトメーターによって異なります。このステップは、メチオニン（ステップ6.3）で45分処理の前または中に行われるべきです。
6. 高流量設定を使用して、各条件から10,000個の細胞のためFS及び蛍光強度を測定します。 FLUOに対するFSの散布図を生成しますrescence強度：（ソフトウェアは10,000個の細胞を測定したにも関わらず、1,000個の細胞のための値が表示されます）1,000ポイントを、「グラフの追加」をクリックし、FITC（x軸）およびFS（y軸）を選択し、グラフ。
   注：最大の一貫性を保つために、メチオニンを添加した後、細胞を45から50分を分析します。多数のサンプルを伴う実験のために、フローサイトメトリー分析のために必要な時間に対応するために、メチオニンの付加をずらします。
7. 対照として、野生型（WT）細胞について-Metと+ Metの条件を含みます。ゲート機能を使用して、最も明るい細胞の約5％は、ゲートの右に落ちるように、WT + Metの条件を用いた縦型ゲートを割り当てます。実験では、他のすべての条件については、このゲーティングを使用してください。

結果

構成的に内在化エンドサイトーシス貨物タンパク質STE3の定常状態の局在化および定量化

生きている細胞、STE3、酵母におけるA因子フェロモン受容体の細胞質C末端テイルを有するキメラGFPとpHluorin融合の局在化pHluorinタグ貨物はエンドサイトーシスの定量化のために利用できることを実証するために、比較しました。 STE3は、構成的分解²⁸液胞に、原形質膜に輸送内在化、および標的化されるGタンパク質共役受容体（GPCR）です。 STE3-GFP（ 図2A）を発現する野生型（WT）細胞に見られるようにこのように、定常状態の条件下で、STE3の大部分は、液胞の内腔に局在します。これとは対照的に、4クラスリン結合アダプタータンパク質ENT1、ENT2、Yap1801とYap1802をコードする遺伝子を欠く細胞（ENT1...

ディスカッション

酵母細胞におけるエンドサイトーシスイベントの定量化のためのpHluorinのアプリケーションは、蛍光タグは、タンパク質（ 図1A）の細胞質尾部に融合された貫通貨物を利用します。ここに記載のアッセイのために、貨物はpHluorinタグがニュートラルな環境にさらされたときに明るく蛍光であるが、pHluorinタグは酸性条件に遭遇したときに急冷になります。したがって、pHluorinタグ付きエンドサイトーシス貨物は容易に形質膜の細胞質面で、早期エンドソーム上で検出されたが、管腔MVB小胞または液胞の内腔への配送時に組み込まれた場合、「暗く」となります。一般的には、新たに合成されたエンドサイトーシス貨物は、おそらく、小胞体（ER）のままとGFPとその変異体の多くは完全に成熟する前に、原形質膜に達します。 ERまたはゴルジからの出口が私でない限り、このように、まだ細胞表面に達していないpHluorinタグ付き貨物は検出不可能なままであると予測されますmpaired。

このようなSTE3とMup1などpHluorinタグ付きエンドサイトーシス貨物の使用は、酵母...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アデニン	シグマ	A8626-25G	アミノ酸混合物および原液の調製に使用
バクト寒天	フィ	ッシャーBP1423-2	プレートメディアの調製に使用
BD Difco 酵母 窒素塩基(アミノ酸なし)	BD	291920	液体およびプレートメディアの調製に使用
コンカナバリンA	Σ	C5275-5MG	チャンバーのコーティングに使用スライド
デキストロー	ス フィッシャー	BP350-1	液体およびプレート媒体の調製に使用
L-ヒスチジン	フィッシャー	BP382-100	アミノ酸混合物および原液の調製に使用
L-ロイシン	アクロス	125121000	アミノ酸混合物および原液の調製に使用
L-リジン	フィッシャー	BP386-100	アミノ酸混合物および原液の調製に使用
L-メチオニン	フィッシャー	BP388-100	アミノ酸混合物および原液の調製に使用
L-トリプトファン	フィッシャー	BP395-100	アミノ酸混合物および原液の調製に使用
L-チロシン	アクロス	140641000	アミノ酸混合物の調製に使用
Nunc Lab-Tek チャンバーカバーガラス (8ウェル)	Thermo Scientific	155411	Mup1-pHluorinの内在化の動力学およびエンドポイントアッセイに使用
ウラシル	シグマ	U0750-100G	アミノ酸混合物およびストック溶液の調製に使用
Axiovert 200倒立顕微鏡	カールツァイス	カスタムビルド
100X/1.4 プランアポクロマート油浸対物レンズ	カールツァイス		対物レンズは100倍にする必要があります、1.4NA以上
Sensicam	Cooke Corporation		カメラは12ビット以上のダイナミックレンジを持つ必要があります
X-Cite 120PC Q 照明源	Excelitas Technologies
Slidebook 5 ソフトウェア	Intelligent Imaging Innovations
ImageJ ソフトウェア	国立衛生		http://imagej.nih.gov/ij/