核酸のポリアニリンベースのセンサ

サマリー

核酸は、生物学的システムを評価するための一般的な分析物ですが、酵素操作によるバイアスが懸念を引き起こす可能性があります。ここでは、ポリアニリンを用いた核酸のラベルフリー検出法について説明します。この高感度で費用対効果の高いセンサー技術は、分子間の一塩基の違いを区別することができます。

要約

核酸の検出は、研究や臨床で使用される診断技術の中心にあります。これらの技術で使用される標準的なアプローチは、バイアスやアーティファクトを導入する可能性のある酵素修飾に依存しています。次世代の検出プラットフォームの重要な要素は、直接分子センシングであり、それによって増幅や標識の必要性を回避します。高度なナノマテリアルは、ラベルフリーセンサーを実現するための適切な化学的モダリティを提供する可能性があります。共役ポリマーは、生体分子と互換性のある特性を持ち、局所的な環境変化に対して高い感度を示すため、生物学的センシングに最適です。この記事では、導電性ポリマーポリアニリンを使用して核酸を検出する方法を紹介します。標的核酸に相補的な単純なDNA「プローブ」オリゴヌクレオチドがポリマーに静電的に結合し、標的分子の単一ヌクレオチドの違いを区別できるセンサーシステムを作り出します。このテクノロジーの特有で偏りのない性質を除けば、非常に費用対効果が高いです。

概要

共役ポリマーは、分子センサーに多くの選択肢を提供します。これには、蛍光応答、電子応答、および比色応答^{が含まれます1}。共役ポリマーを核酸センサーに組み込むための多くの取り組みが行われています。ただし、ほとんどのシステムでは二次検出が必要であり、検出オプション²が限られています。最近、ポリアニリン(PANI)上に構築された共役ポリマーベースのセンサープラットフォームを報告しました。このセンサーの特性を利用して、ラベルフリーシステム³を作成します。PANIは、蛍光や抵抗などの特性を持つ広範囲に結合した電気活性ポリマーで、生体システムの測定に適しています⁴。構造内の励起子は局在化せず、モノマーサブユニット間の正電荷の移動性につながります。これにより、^DNA5,6の負に帯電した骨格と相互作用できる正電荷の柔軟な足場が提供されます。重要なことは、静電的に結合したDNAは、窒素含有塩基が塩基対形成に参加できるように配向されていることです。DNAとの結合はPANIの電子特性を変化させますが、この効果はUV照射によって増強されます(図1)³。このシステムを使用すると、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドをPANIに固定化できます。複数の研究により、ハイブリダイゼーション時に静電吸着されたオリゴヌクレオチドは、二本鎖DNA構造への切り替えによって引き起こされる立体配座の変化により、PAN....

プロトコル

1.加工可能PANI合成

1. 250mL丸底フラスコ中で完全にクロロホルム60ml中のアニリン（1 mlの11ミリモル）に溶解します。 5分間600rpmで撹拌し、氷で0〜5℃に冷却します。これは通常、15〜20分（ 図2A）を取ります。
2. 600rpmで攪拌しながら、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（NaDBS）（て7.44 gの21ミリモル）丸底フラスコ中のアニリンの溶液に加えます。
3. 20ミリリットルの水に過硫酸アンモニウム（APS）（3.072グラム、13.5ミリモル）を溶解し、ドロップワイズ30分かけて反応の過熱を防ぐため、それのすべてを追加します。
4. 24のための時間0-5℃で反応を行い、それがさらに24時間室温に到達させます。
5. この反応混合物は、最初は15分後に乳白色を回して観察し、2時間後、最終的には24時間（ 図2B-F）の後に暗緑色に暗褐色。
6. ブフナー漏斗とPANI-NaDBSソリューションをフィルタリングします。 80 mLのクロロホルムと120ミリリットルの水と混合eparation漏斗（ 図2G）。
7. 水性の上清中の未反応NaDBSとAPSを残して、室温で24時間のためのソリューションをインキュベートし、分離漏斗から暗緑色PANIを集めます。

結果

図2Aは、APSの添加前に、 すなわち 、重合プロセスの開始時に反応セットアップを取り込みます。ミセル形成は、ミセル界面におけるプロセス-PANI合成が起こる反応の最初のステップである。 図2Bは、5分後に乳白色の解決策を示しています。 APSの30分後、反応はやや褐色に変わり追加されます。 図2Cは、オリゴマーの形成に伴う色の変化を示している。 図2Dはと一致し、短鎖PANIの高濃度を示し、4時間後に暗褐色を示し、とても遅い反応。最後に、クロロホルム-水（ 図2E）中に分散された高分子量のPANIの暗緑色の溶液が観察できる48時間後。 図2Fは無い相分離と分離漏斗中に十分に分散、均質PANIソリューションを示しています。

ディスカッション

核酸のPANIベースのセンサーは、DNAやRNAと相互作用するために、水中でのポリマーの可溶化を必要とします。水中のPANI分散物は、以前⁸報告されているように、ミセルを形成する界面活性剤を使用して達成されます。 4-スルホフタル酸ドデシルエステルなどの他の陰イオン界面活性剤ここで用いられるNaDBSに加えて、ノニルフェノールエトキシレート、またはセチルトリメチルアンモニウムブロミドのようなカチオン性界面活性剤などの非イオン界面活性剤はまた、加工PANI ^9,10の合成のために使用することができます。ここに記載した合成は、アニオン性界面活性剤NaDBSの一定の割合で始まる2で単量体アニリンに追加：1のモル比。界面NaDBSミセルポリマー油滴と水との間の平衡を確立することにより、クロロホルム - 水に乳化アニリンモノマーの重合を可能にする高親水性 - 親油性バランス（HLB）を有します。 GRのミセルを生成するために1.5のモル比：酸化APSを1で添加します内部コアは、核剤として作用するPANIを、による。さらに、周囲の溶媒^11,12と動的平衡にPANIを維持しながら、これ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アニリン	フィッシャーサイエンティフィック	A7401-500	ACS, 液体, 冷蔵
ペルオキシ二硫酸アンモニウム	フィッシャーサイエンティフィック	A682-500	ACS, 結晶性
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム	ファルツ&バウアー	D56340	95%ソリッド
クロロホルム	フィッシャーサイエンティフィック	MCXの10601	液体
DNAプライマー	MWGオペロン	n/a	カスタムDNA配列 ~20 bps
マイクロプレート	USAサイエンティフィック	〒1402-9800	96ウェル、ポリプロピレンはクロロホルムに反応しないため
マイクロプレート接着フィルム	USA Scientific	〒2920-0000	ウェル間の汚染、サンプルのこぼれ、蒸発を低減
顕微鏡カバーガラス	フィッシャーサイエンティフィック	12-544-D	UV照射カバーガラスにPANIコーティング
UVクロスリンカー	UVP	HL-2000	エネルギー:X100 μJ/cm2;時間:2分
ハイブリダイゼーションオーブン	VWR	01014705 T	温度:400 °C;15分間のロッキング付き
ガラス器具	フィッシャーサイエンティフィック		反応用3ネック丸底フラスコ;滴下漏斗、ストッパー、コンデンサー、分離漏斗
顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	ライカIMC S80	倍率20倍。疑似カラー536nm;ばく露86ミリ秒;1.0倍獲得。Gamma 1.6
マイクロプレートリーダー	分子デバイス	89429-536