方法論記事

核酸のポリアニリンベースのセンサ

DOI：

10.3791/54590

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2016年11月1日

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1Department of Biological Sciences, University of Southern Mississippi

この記事について

サマリー

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核酸は、生物学的システムを評価するための一般的な分析物ですが、酵素操作によるバイアスが懸念を引き起こす可能性があります。ここでは、ポリアニリンを用いた核酸のラベルフリー検出法について説明します。この高感度で費用対効果の高いセンサー技術は、分子間の一塩基の違いを区別することができます。

要約

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核酸の検出は、研究や臨床で使用される診断技術の中心にあります。これらの技術で使用される標準的なアプローチは、バイアスやアーティファクトを導入する可能性のある酵素修飾に依存しています。次世代の検出プラットフォームの重要な要素は、直接分子センシングであり、それによって増幅や標識の必要性を回避します。高度なナノマテリアルは、ラベルフリーセンサーを実現するための適切な化学的モダリティを提供する可能性があります。共役ポリマーは、生体分子と互換性のある特性を持ち、局所的な環境変化に対して高い感度を示すため、生物学的センシングに最適です。この記事では、導電性ポリマーポリアニリンを使用して核酸を検出する方法を紹介します。標的核酸に相補的な単純なDNA「プローブ」オリゴヌクレオチドがポリマーに静電的に結合し、標的分子の単一ヌクレオチドの違いを区別できるセンサーシステムを作り出します。このテクノロジーの特有で偏りのない性質を除けば、非常に費用対効果が高いです。

概要

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共役ポリマーは、分子センサーに多くの選択肢を提供します。これには、蛍光応答、電子応答、および比色応答が含まれます1。共役ポリマーを核酸センサーに組み込むための多くの取り組みが行われています。ただし、ほとんどのシステムでは二次検出が必要であり、検出オプション2が限られています。最近、ポリアニリン(PANI)上に構築された共役ポリマーベースのセンサープラットフォームを報告しました。このセンサーの特性を利用して、ラベルフリーシステム3を作成します。PANIは、蛍光や抵抗などの特性を持つ広範囲に結合した電気活性ポリマーで、生体システムの測定に適しています4。構造内の励起子は局在化せず、モノマーサブユニット間の正電荷の移動性につながります。これにより、DNA5,6の負に帯電した骨格と相互作用できる正電荷の柔軟な足場が提供されます。重要なことは、静電的に結合したDNAは、窒素含有塩基が塩基対形成に参加できるように配向されていることです。DNAとの結合はPANIの電子特性を変化させますが、この効果はUV照射によって増強されます(図1)3。このシステムを使用すると、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドをPANIに固定化できます。複数の研究により、ハイブリダイゼーション時に静電吸着されたオリゴヌクレオチドは、二本鎖DNA構造への切り替えによって引き起こされる立体配座の変化により、PANIまたは他のカチオン性マトリックスから解離することが実証されています3,5,7。

プローブの付着が共役ポリマーの特性を調節するセンサーシステムでは、プローブや標的核酸の標識や酵素修飾なしにハイブリダイゼーションイベントを形質導入することができます。共役ポリマーは、検出方法に大きな柔軟性を提供し、その1つが蛍光性です。PANI蛍光のモニタリングにより、10-11 M(10 pM)という低い標的核酸の濃度を検出できます3。検出は迅速で、ハイブリダイゼーションから15分以内に発生し、標的分子の単一のミスマッチを区別できる場合に特異的です3。

PANIセンサーの製造は簡単です。アニリンモノマー、界面活性剤、および酸化剤の制御された添加を含む標準的な合成手順を使用して、水に十分に分散した高分子量PANIを生成できます。収率は非常に高く、未反応の酸化剤を水で洗浄することで除去できるため、それ以上のPANI増殖がなくなります。PANIとプローブの会合は混合物に自発的に発生し、穏やかなUV曝露により複雑な形成が促進されます。ハイブリダイゼーションはすぐに行うことができ、短時間のインキュベーション後にPANI蛍光の変化をアッセイします。この技術のシンプルさは、多くの研究室にとって非常にアクセスしやすいものとなっています。

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プロトコル

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1.加工可能PANI合成

  1. 250mL丸底フラスコ中で完全にクロロホルム60ml中のアニリン（1 mlの11ミリモル）に溶解します。 5分間600rpmで撹拌し、氷で0〜5℃に冷却します。これは通常、15〜20分（ 図2A）を取ります。
  2. 600rpmで攪拌しながら、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（NaDBS）（て7.44 gの21ミリモル）丸底フラスコ中のアニリンの溶液に加えます。
  3. 20ミリリットルの水に過硫酸アンモニウム（APS）（3.072グラム、13.5ミリモル）を溶解し、ドロップワイズ30分かけて反応の過熱を防ぐため、それのすべてを追加します。
  4. 24のための時間0-5℃で反応を行い、それがさらに24時間室温に到達させます。
  5. この反応混合物は、最初は15分後に乳白色を回して観察し、2時間後、最終的には24時間（ 図2B-F）の後に暗緑色に暗褐色。
  6. ブフナー漏斗とPANI-NaDBSソリューションをフィルタリングします。 80 mLのクロロホルムと120ミリリットルの水と混合eparation漏斗（ 図2G）。
  7. 水性の上清中の未反応NaDBSとAPSを残して、室温で24時間のためのソリューションをインキュベートし、分離漏斗から暗緑色PANIを集めます。

2. PANI-プローブ混合とUV照射

  1. クロロホルム - 水でPANI液10倍に希釈（1：3 V / V）および微量遠心管中で15分間穏やかに振動することにより、プローブDNAオリゴヌクレオチドの6.4μmolので希釈したPANIの200μLを混ぜます。
  2. 2分間架橋剤中のUVの1200μJ/ cm 2のPANI-DNA溶液を照射します。 UV露光が示された量に制限されていることが重要です。紫外線に長時間さらさは、PANIとDNAの共有結合架橋に起因する可能性が高いPANI中の蛍光変化を、損ないます。
  3. 6分間の17000×gで遠心分離によってペレット錯体、およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄します。再びペレット化し、PBS中に再懸濁します。

3. HPANI-プローブのybridization

  1. PANI-プローブ複合体の200μlに核酸を100μMの相補的なDNAオリゴヌクレオチドを8μlを添加またはターゲット。
  2. 40で15分間混合液をロッキングすることによりハイブリダイゼーションを行います °C。
  3. 6分間の17000×gで遠心分離することによってPANI複合体をペレット化。 PBSで洗浄し、水に再懸濁します。

4.排出定常の蛍光測定

  1. 250 nmで励起することにより、96ウェルマイクロプレートに異なる処理からPANIを追加し、270から850 nmの範囲の発光蛍光を測定します。 PANIのための発光ピークは、500nm付近に観察されるべきです。

ハイブリダイズした二重の5蛍光顕微鏡測定

  1. 48時間、40℃でホウケイ酸ガラスのカバースリップとドライにコートPANIをドロップします。
  2. 乾燥したPANI膜の上にプローブ（100μMの8μl）を追加し、UV光（1200μJ/ cm 2のそれを照射）。
  3. 48時間40℃でPANI-プローブPBSでフィルムや乾燥を洗ってください。
  4. 標的核酸を添加することにより15分間ハイブリダイゼーションを行います。これは生物学的サンプルまたは制御目標オリゴヌクレオチド（100μMの8μL）である可能性があります。 PBS洗浄に従ってください。
  5. 500 nmのロングパスフィルタを用いて、40X倍率で蛍光画像を取得します。

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結果

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図2Aは、APSの添加前に、 すなわち 、重合プロセスの開始時に反応セットアップを取り込みます。ミセル形成は、ミセル界面におけるプロセス-PANI合成が起こる反応の最初のステップである。 図2Bは、5分後に乳白色の解決策を示しています。 APSの30分後、反応はやや褐色に変わり追加されます。 図2Cは、オリゴマーの形成に伴う色の変化を示している。 図2Dはと一致し、短鎖PANIの高濃度を示し、4時間後に暗褐色を示し、とても遅い反応。最後に、クロロホルム-水（ 図2E）中に分散された高分子量のPANIの暗緑色の溶液が観察できる48時間後。 図2Fは無い相分離と分離漏斗中に十分に分散、均質PANIソリューションを示しています。

図2）またはドロップコーティングされたフィルムの表面上に（

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ディスカッション

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核酸のPANIベースのセンサーは、DNAやRNAと相互作用するために、水中でのポリマーの可溶化を必要とします。水中のPANI分散物は、以前8報告されているように、ミセルを形成する界面活性剤を使用して達成されます。 4-スルホフタル酸ドデシルエステルなどの他の陰イオン界面活性剤ここで用いられるNaDBSに加えて、ノニルフェノールエトキシレート、またはセチルトリメチルアンモニウムブロミドのようなカチオン性界面活性剤などの非イオン界面活性剤はまた、加工PANI 9,10の合成のために使用することができます。ここに記載した合成は、アニオン性界面活性剤NaDBSの一定の割合で始まる2で単量体アニリンに追加：1のモル比。界面NaDBSミセルポリマー油滴と水との間の平衡を確立することにより、クロロホルム - 水に乳化アニリンモノマーの重合を可能にする高親水性 - 親油性バランス（HLB）を有します。 GRのミセルを生成するために1.5のモル比：酸化APSを1で添加します内部コアは、核剤として作用するPANIを、による。さらに、周囲の溶媒11,12と動的平衡にPANIを維持しながら、これ...

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開示事項

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この研究は、南ミシシッピ大学科学技術大学、ミシシッピ科学技術大学、およびミシシッピINBREプログラム(国立総合医科学研究所からの賞番号P204M103476)によって支援されました。

謝辞

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著者は何も開示していません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アニリン フィッシャーサイエンティフィック A7401-500 ACS, 液体, 冷蔵
ペルオキシ二硫酸アンモニウムフィッシャーサイエンティフィック A682-500 ACS, 結晶性
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムファルツ&バウアー D56340 95%ソリッド
クロロホルムフィッシャーサイエンティフィック MCXの10601 液体
DNAプライマーMWGオペロンn/aカスタムDNA配列 ~20 bps
マイクロプレート USAサイエンティフィック 〒1402-9800 96ウェル、ポリプロピレンはクロロホルムに反応しないため
マイクロプレート接着フィルムUSA Scientific 〒2920-0000 ウェル間の汚染、サンプルのこぼれ、蒸発を低減
顕微鏡カバーガラスフィッシャーサイエンティフィック 12-544-D UV照射カバーガラスにPANIコーティング
UVクロスリンカー UVP HL-2000 エネルギー:X100 μJ/cm2;時間:2分
ハイブリダイゼーションオーブンVWR01014705 T温度:400 °C;15分間のロッキング付き
ガラス器具 フィッシャーサイエンティフィック反応用3ネック丸底フラスコ;滴下漏斗、ストッパー、コンデンサー、分離漏斗
顕微鏡ライカマイクロシステムズ ライカIMC S80倍率20倍。疑似カラー536nm;ばく露86ミリ秒;1.0倍獲得。Gamma 1.6
マイクロプレートリーダー分子デバイス 89429-536

参考文献

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  1. Hahm, J. I. Functional polymers in protein detection platforms: optical, electrochemical, electrical, mass-sensitive, and magnetic biosensors. Sensors (Basel). 11 (3), 3327-3355 (2011).
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