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方法論記事

傾斜孔サイズを有するポリ（乳酸）スキャフォールドを製造するために簡便かつ環境に優しいルート

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DOI:

10.3791/54595

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2016年10月17日

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1Department of civil, environmental, aerospace, and materials engineering (DICAM), RU INSTM, University of Palermo

この記事について

サマリー

この研究では、溶融混合と選択的浸出の組み合わせを使用して、ポリ(乳酸)/ポリエチレングリコール(PLA/PEG)の足場を調製しました。ここで論じた方法は、気孔率と細孔サイズの両方を高度に制御することにより、3層の足場を開発することを可能にした。機械的特性も生理学的環境で評価されました。

要約

近年、機能的に等級付けされた足場(FGS)は、組織工学のための機器の製造において重要な役割を獲得しています。この新しいバイオマテリアル研究分野の重要性は、ある構造や組成物から別の構造や組成への連続的な変化など、さまざまな組織の複雑な機能を模倣できるインプラントを開発する必要性によるものです。この後者の文脈では、骨-軟骨界面組織のための適切な足場の設計に関する主要な関心事の1つが関係しています。この研究では、ポリ(乳酸)(PLA)、塩化ナトリウム(NaCl)、ポリエチレングリコール(PEG)を溶融混合することにより、細孔径が傾斜した3層の足場が達成されました。細孔径分布は、NaCl粒度法とPEG溶媒和法によって制御されました。足場は、形態学的および機械的な観点から特徴付けられました。調製方法、細孔構造、および圧縮力学的挙動との間に相関関係が見出された。界面接着強度は、カスタム設計の界面強度試験を使用して定量的に評価されました。さらに、人間の生理機能を模倣するために、37°Cのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液で機械的試験も行われました。ここで提示する方法は、多孔性、細孔サイズ分布、および機械的性能を高度に制御するため、シンプルで環境に優しいルートをたどることにより、カスタマイズされた特性を持つ3層構造の足場を製造する可能性を提供します。

概要

プラスチック廃棄物に対する懸念の高まりと再生不可能な資源の使用削減により、ここ数年で学界と産業界の両方で生分解性ポリマーへの関心が重要性を増しています1-7。特に、生体適合性および生分解性の合成ポリマーは、薬物制御放出8,9、吸収性縫合糸8,10、バイオプロセス強化11、組織工学12など、いくつかの生物医学的応用分野で広く普及している。

組織工学は、病気や傷ついた組織の正常な機能を回復し維持できるデバイスの開発に焦点を当てています。ほとんどの天然組織は、特定の空間階層にあるさまざまな種類の細胞と細胞外マトリックス(ECM)で構成されています。例えば、関節軟骨(AC)は、コラーゲン繊維とコラーゲン結合タンパク質の種類と向きが異なるさまざまなゾーンで構成されています。さらに、軟骨と骨は大きく異なる階層構造を示しています。これに関連して、各層に工学的特性を有する多層足場の調製は、これらの複雑なシステム13,14のすべての局所微小環境を考慮に入れることにより、不均一な組織を置き換えることを可能にする可能性がある。

足場の細胞的/生物学的および/または物理化学的特性に基づいて、組織工学によって採用される主な戦略は、単相性、二相性、および三相性に分けることができます。二相性および三相性アプローチ(BTA)は、2つまたは3つの異なる細孔構造、材料、またはフィラーを使用して、多層機能デバイスを調製します。さらに、単一の材料を使用して、その物理的特性12に勾配を作り出すことが可能である限り、二相性または三相性デバイスを達成することができる。

細胞の移動は、形態形成、炎症、創傷治癒、腫瘍転移において重要な役割を果たします。細胞の移動は、デバイスの表面からコアまでの化学的物理的特性の勾配の存在によって促進されます。したがって、上記の要件を満たす生体材料は、細胞移動の研究に役立ちます。細胞の移動(走化性)を引き起こす化学的勾配に加えて、細胞培養基質の機械的特性も細胞の移動(機械化性)につながる可能性があります15。

多層構造は、ポリマーマトリックス内に組み込まれた特定の薬物の調整可能な放出を提供することもできます。これは、層の特定の領域またはロードされた薬物の量を変更することによっても

可能になります。

過去10年間で、多孔性や細孔サイズなどの形態学的特性の離散的または連続的な勾配を持つ足場を開発するために、いくつかのアプローチが提示されてきました16-31。最新の論文は、粒子浸出12,28,32、ガス発泡技術16、エレクトロスピニング17-19、層ごとの鋳造技術20、ラピッドプロトタイピング21,22、熱誘起相分離(TIPS)22、遠心分離凍結乾燥24,25、三重周期最小表面(TPMS)26、凍結鋳造27-30を採用することにより、BTAの調製に焦点を当てました。

この作業の枠組みの中で、溶融混合、圧縮成形、塩浸出を組み合わせることにより、PLAベースの3層多孔質足場(TLS)を達成するための迅速で簡単な方法を提示します。足場製造に一般的に使用されるほとんどの技術とは異なり、ここで採用される戦略は、環境および生細胞および組織32に対して潜在的に危険な有毒な溶媒を必要としないため、完全に環境に優しいと見なすことができる。 本研究で、作製デバイスの形態学的特徴と機械的挙動の両方を解析することにより確立された基本的な処理-構造-特性の関係は、特定の標的特性を持つ多機能傾斜足場の設計における将来の進歩への指針となります。

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プロトコル

1.足場製作

  1. 20分間実験室ブレンダー中のNaClを粉砕し、100℃のヒーターでそれを乾燥させます。
  2. 共振で発生することなく、利用可能な最高周波数で30分間ふるい機で乾燥させたNaClを（一度に45グラム）を入れてください。 500ミクロン〜1000ミクロン（M 500）に至るまで、6塩画分を収集します。 300ミクロンから500ミクロン（M 300）へ。 100μmから200μmの（M 100）。 90ミクロンから100（M 90）へ。 図1に図式のような塩の粒子と45ミクロン〜65ミクロン（M 45）から、最終的にM 10は、45ミクロンよりも小さいサイズ。
  3. 真空は、処理中に加水分解切断を回避するために、一晩、すべての材料を乾燥させます。ガラス転移 - ポリマーの場合に - 各材料については、克服することなく、乾燥の程度を最大化するために温度を選択します。したがって、PEGのためのPLAのためのT = 90℃、T = 25°C、T = NaClを105℃を選択します。
  4. フィード通常、約後、次にそれぞれ20/5/75の重量パーセント組成を有するPLA、PEGおよびNaCl、T = 190°Cで動作するバッチミキサーおよびN = 60回転数とトルクの一定値を達成するまで、それらを処理し、 10分。その後、急速に得られた材料を集めます。
  5. 10ミリメートルの直径と3ミリメートルの高さと適切な円筒状の金型でブレンドを入れて、周囲圧力で60秒、3分の180バーでのためにそれらを保つため、210℃で動作する実験用プレスを用いて、単層を準備します。その後、180バールの圧力を維持し、室温でブレンドを冷却します。
  6. 圧縮成形を介した三層の組立
    1. 10mmの直径および1mmの高さを有する同一（1.5）に記載されているような方法が異なる金型を用いて、すなわち、各単層を調製します。最後に、6つのディスクは、6つの異なる粒子サイズを含む、10mmの直径および1mmの高さを有し得る：M 500、M 300、M 100、
    2. フォーR 3層足場A（TLS A）を組み立て、M 500、M 300を積み上げるとM 100、円筒状金型内および周囲圧力で60秒間、210℃で動作する実験用プレスでそれらを圧縮成形し、3分でその後、180バーとは、180バールの圧力を維持し、室温で冷却しました。
      注：相互M 90上に積層してTSL Bを準備M 45とM 10と同じ金型及びTLS Aに用いたのと同じ手順に従って、圧縮成形作業を行います
  7. 円筒型からディスクを削除し、攪拌せずに、沸騰脱塩水浴に入れます。 3時間後、浴から得られた多孔質構造体を除去し、化学フード中、室温で12時間のためにそれらが乾燥してみましょう。

2.形態素解析

  1. 走査型電子顕微鏡により、足場の形態を評価します。
    1. 取り付け後、液体窒素下で試料を分解し、接着剤カーボンテープを使用したアルミニウムスタブ上のサンプル。最後に、スパッタcoateを金で撮影前にアルゴン雰囲気下で90秒間の試験中に静電放電を回避するために。

3.足場孔径

  1. 足場の孔径分布を認識することができる画像処理ソフトウェアを用いてSEM分析によって得られた画像を精巧。
    注：この研究では、細孔径分布分析は、MATLABベースのソフトウェアを用いて行った以前33に記載

4.気孔率

  1. 浸出の前にサンプルを秤量し、次式により理論的な多孔性を評価します：
    figure-protocol-1
    注：NaClを 、 メートルPEGおよびm PLAを M、均質なブレンドを仮定することにより、それぞれのNaCl、PEG、およびPLAの理論上の質量です。 T彼は（ρ）のNaCl、PEG及びPLAのは、それぞれ2,16グラム/ cm 3であり、1,12グラム/ cm 3の電子1,24グラム/ cm 3である密度。
  2. 試料（ρ 骨格 ）の見掛け密度を評価するために浸出し、乾燥後の試料を秤量し、次に足場の見掛け密度との比とすることにより、非多孔質PLAの濃度の逆数として実際の多孔性を評価します式（2）を使用。
    注：これは、足場の空のボリュームと（空+フル）足場のフルボリュームとの間の比率を表しています。
    figure-protocol-2

5.機械的性質

  1. 1 kNのロードセルを装備した引張機を使用して、圧縮モードでサンプルをテストします。分-1 1mmの一定の歪み速度を設定します。
  2. 生理学的環境におけるサンプルの機械的性能を調べるために、dynamometeを装備37℃で含有する浴（PBS）、（でpH = 7.4）とrと点5.1で説明したものと同じ設定でテストを行います。
    1. 湿潤環境内の各測定の前に、PBSは、全ての孔を埋めるようにするために5分間の真空フラスコ中で、PBSでサンプルを浸します。その後、足場は設定点温度に到達するために15分間37℃でPBS中に残存することを可能にします。
  3. 文献32,34に記載の方法以下の機械的試験機に接続されたカスタムデザインの界面強度試験装置を用いてTL AとTL Bの層の間の界面接着強度（IAS）を決定します。
    1. リグ上の足場を修正して、マシンのロードセルとベースプラテンとの正確な位置合わせを確保します。高粘度の接着剤を用いてアルミニウム試験スタブに足場サンプルを取り付け、テストのための機器に入れます。
    2. 湿潤状態の試験では、1時間のpri PBS中のサンプルを水和または試験へ。分-1 1mmのひずみ速度で適用される引張荷重の下で、1 kNのロードセルを使用してください。
      注：障害がいずれかの層の一つの極限引張強さでため、または界面での剥離の発生する可能性があることを考慮してください。応力 - ひずみ曲線の最大強度としてIASを評価します。

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結果

足場の孔のアーキテクチャ上のNaCl粒子サイズの影響は、それぞれ、試料の形態を調査し、画像解析により細孔サイズ分布を計算することによって定性的および定量的に評価した図2a - 。fは 、得られた単層足場のSEM顕微鏡写真を示します別のNaCl粒子サイズを含む材料の塩浸出から。

より詳細には、M 500（ 図2a）は、おそらく溶融混合中に500ミクロンよりも大きい直径を有する塩粒子の破壊に、500μmの平均直径を有する細孔を示しました。同図から明らかなように見える、細孔構造は、約10μmの壁に囲まれ乏しい相互接続された不規則な気孔、、の数が少ないことを特徴としている。 図2bは、このでM 300の形態を報告しますケースは、細孔は、このように何も粒子破壊が溶融混合プロセス内で発生していないことを確認し、溶融混合（300~5...

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ディスカッション

最初の重要なステップは、効率を篩い分けの最適化です。 NaClの粒径の高い制御は、所望の細孔サイズ分布を有する足場を調製するための基本です。もう一つの重要なステップは、金型からサンプル抽出の際に薄いPLA単層の破壊を回避されています。画像処理解析は、装置全体の代表ではないかもしれません。

引張試験中、サンプルは機器から離れて引き裂くことができます。

ステップをふるい分けする前に、塩をよくのNaCl粒子サイズのより高い制御を得るために乾燥されていることを確かめます。この問題は、その非常に高い吸湿性に起因し、特に最小の塩の粒子サイズのために重要です。圧縮成形工程の前に、金型からのサンプルの除去を容易にするために、金型の上に薄いテフロンスプレーコーティングを施します。画像処理解析を採取異なる画像を考慮して行わなければなりません足場の異なる領域から、彼らは装置全体の代表的なものであることを確認します。最後に、引張試験（湿潤環境で行わ特に）の前に、慎重に密着をサンプリングする接着剤を検証します。

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この作業はINSTMによって財政的に支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ポリ(乳酸)ネイチャーワークスPLA 2002D
ポリ(エチレングリコール)Σ83797-1KG-F
クロライドナトリウムΣ793566-5KG-D
リン酸塩緩衝液Σ P5368-10PAK
ラボミキサーBrabenderPLE 330 - Plasticorder
Laboratory PressCarver
走査型電子顕微鏡Phenom-worldProX
万能試験機Instron3365(英国)
BioPulsバスインストロン、ノーウッド
ふるい分け機EndecottsE.V.F.1。
真空オーブンISCONSV9035
精密天びんザルトリウスAX224

参考文献

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