方法論記事

フローサイトメトリーによるラットの腎臓からのマクロファージの表現型の特徴

DOI：

10.3791/54599

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2016年10月18日

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1Renal, Vascular and Diabetes Research Lab, IIS-Fundaciòn Jiménez Dìaz, Autonoma University, 2Department of Physiology, Faculty of Medicine, Complutense University, 3Department of Immunology, Centro Nacional de Microbiologìa, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

この記事について

サマリー

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この原稿は、表現型とフローサイトメトリーによるラット腎臓からの常駐マクロファージの定量分析のための詳細なプロトコルを記述しています。得られた染色された細胞はまた、このように実験モデルで得られた情報を増加させる、細胞選別、遺伝子発現分析または機能的研究を含む他の用途に使用することができます。

要約

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炎症、そしてその後のマクロファージが腎疾患の発症と進行に重要な役割を果たすことを示唆する証拠が増えています。マクロファージは、腎障害に関与している不均一な細胞です。マクロファージは、2つの異なる表現型に分類できます:古典的に活性化されたマクロファージ(M1マクロファージ)は、炎症誘発性サイトカインを放出し、線維化を促進します。免疫調節および組織リモデリング機能に関連する代替的に活性化されたマクロファージ(M2マクロファージ)。これらのマクロファージ表現型は、腎障害への寄与を判断するために識別および分析する必要があります。しかし、炎症性腎疾患モデル、特にラットにおけるマクロファージのサブタイプに関する一貫した表現型および機能的情報を報告した研究はほとんどありません。この事実は、マウスとは対照的に、ラットで使用されるマクロファージマーカーが限られていることに関連している可能性があります。したがって、これらの浸潤細胞の腎含有量を信頼性の高い方法で定量化し、特徴付けるための新しい戦略が必要です。この原稿では、腎臓消化のプロトコルと、フローサイトメトリーによるラット腎臓からのマクロファージのさらなる表現型および定量分析について詳しく説明します。簡単に説明すると、腎臓をコラゲナーゼとインキュベートし、生細胞におけるCD45(白血球共通抗原)とCD68(PANマクロファージマーカー)の二重の存在に従って総マクロファージを同定しました。続いて、CD86(M1マーカー)とCD163(M2マーカー)の表面染色を行いました。ラット腹膜マクロファージは、フローサイトメトリーによるマクロファージマーカー検出のポジティブコントロールとして使用されました。私たちのプロトコルは、細胞死亡率を低く抑え、さまざまな細胞内および表面タンパク質マーカーの特性評価を可能にしたため、他のプロトコルで観察される細胞の完全性の損失を制限しました。さらに、この手順により、細胞選別やmRNAまたはタンパク質発現研究などのさらなる技術にマクロファージを使用することができます。

概要

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腎臓病は世界的な健康問題であり、有病率の増加と罹患率と死亡率の上昇に関連しています1。腎障害の進行と発症に関与する最も重要なメカニズムの1つは、主にマクロファージによって引き起こされる炎症です。マクロファージは、腎障害2を含む多くの炎症性疾患において極めて重要な役割を果たしています。したがって、急性腎障害(AKI)または慢性腎臓病(CKD)の患者の生検では、浸潤するマクロファージの存在が増加していることが報告されています3,4。最近の研究では、腎疾患の長期的な転帰はマクロファージによって制御できることが示唆されています5,6。局所的な微小環境に応答して、マクロファージは多様な生物学的機能を果たす異なる表現型に分化することがあります7。2つの明確に分化したマクロファージ表現型が確立されています:古典的に活性化されたマクロファージ(M1マクロファージ)と代替的に活性化されたマクロファージ(M2)8。M1マクロファージは炎症を促進しますが、M2マクロファージは抗炎症作用を持ち、組織修復に関与しています9。したがって、マクロファージの不均一性に関するより良い知識は、マクロファージの調節と腎臓病理への寄与を理解し、新しい治療アプローチを開発するために必要です。

どちらも、マウスとラットのモデルは、腎障害に関与する分子的および細胞的メカニズムを理解するために広く使用されています10。ただし、これらのげっ歯類間でマクロファージの表現型を特定するために使用される多様なマーカーには大きな違いがあります。したがって、F4/80やLy6Cなどのいくつかのマウスマーカーはラットでは使用されず、これらの種間の所見の外挿が制限されます。さらに、ラットのマクロファージ表現型を説明するマーカーの数は限られており、マウスと比較してこれらの動物のマクロファージの不均一性を分析する研究が乏しいことを説明しています。したがって、ラットの腎疾患モデルにおけるマクロファージの役割を理解するためには、マクロファージサブセットの特性評価のための新しい戦略が必要です。

この原稿は、フローサイトメトリーによるラット腎臓からのマクロファージの表現型および定量的分析のためのプロトコルを説明しています。この手法に続いて、細胞選別やmRNAまたはタンパク質発現研究など、いくつかのアッセイを行い、腎疾患におけるマクロファージの役割を詳細に評価することができます。

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プロトコル

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このプロトコルは、指令欧州議会の63分の2010 / EUと国家ガイドライン2013分の53以下のローカル施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

試薬およびソリューションの作製

  1. 無菌条件下で全ての試薬と解決策を準備し、層流フードの下で使用しています。 4℃でのソリューションをしてください。
  2. 染色バッファー（1×ダルベッコPBS中の2％ウシ胎児血清（FBS））を準備します。
  3. 生理食塩水の各mlにコラゲナーゼ0.5mgのを追加することで、コラゲナーゼ溶液を準備します。
  4. （2：1 v / v）をケタミン/キシラジン麻酔の溶液を調製します。

2.腎臓灌流および抽出

  1. ケタミン/キシラジン（75mgの/ 12ミリグラム/キログラム体重）の腹腔内注射により、ラットを麻酔。慎重に動物が十分に麻酔されていることを確認するために、皮膚の小さな倍をつまみます。その後、麻酔下ながら乾燥を防ぐために、獣医軟膏で目をカバーしています。注：4月第齢のWistarラットを、このアッセイで使用されています。
  2. ラットが完全に麻酔された後、仰臥位で手術台の上に置きます。
  3. 腹部に70％エタノールを適用します。
  4. 胸膜および腹腔を露出させるために、恥骨から胸郭に、腹部皮膚及び腹膜を介して中央切開を行います。
  5. 全ての血液は腎臓から除去されるまで灌流システムを使用して腎臓を灌流するために腹部大動脈に生理食塩水（0.9％）を注入します。血液を解放するために役立つ腹部レベルで大動脈をカットします。
  6. 腎門部（腎静脈、動脈および尿管）から切断することにより、ラットから両方の腎臓を削除してください。腎臓をデカプセル化するには、慎重にカプセル11を分離し 、指を使って腎臓の端を押してください。
  7. ハンクス平衡塩溶液中に腎臓を置きます。

3.腎消化し、細胞懸濁液

  1. 小片にハサミで腎臓の半分をカットして入れて1.5mlチューブに個。
    注：すべての次の濃度は、1サンプル（1/2ラットの腎臓）のために計算されています。
  2. コラゲナーゼ溶液1mlを加え、37℃で30分間インキュベートします。コラゲナーゼ溶液は、組織全体にアクセスすることを確認するために、5分毎に転倒混和します。
  3. ソリューションを収集し、プランジャーの助けを借りて、ストレーナ（40ミクロン）に通し、そして染色緩衝液10mlでそれを再懸濁します。
  4. 15分間400×gで遠心分離します。
  5. 1ミリリットルACK（塩化アンモニウムカリウム）ライジングバッファーでペレットを再懸濁します。室温で1分30秒後に、反応を停止する染色緩衝液10mlを加えます。
  6. 10分間400×gで遠心分離します。
  7. 再懸濁染色緩衝液（1ミリリットル）の十分なボリュームでペレットをストレーナ（30μm）を用いて、細胞懸濁液をフィルタリングします。
  8. 血球計数器で、トリパンブルー排除を用いて細胞の数をカウントし、STA用1.5mlチューブに200万セルを追加ining。

4.細胞染色およびフローサイトメトリー分析

  1. 5分間100×gで遠心分離した細胞。
  2. Fc受容体をブロックするために4℃で10分間：ラット血清を100μlでペレットを再懸濁（100 1希釈）。
  3. 5分間染色緩衝液および遠心分離100×gでの1ミリリットルを追加することにより洗浄します。
  4. 生細胞（：千3）を検出すると、ソリューションCD45 APC-Cy7の（1：：：100）、CD163 A647（100 4）各条件のための染色緩衝液100μlの細胞表面染色のための抗体を混ぜます。
  5. 暗所で4℃で20分間、抗体混合物で細胞ペレットを再懸濁します。
  6. 5分間100×gで染色緩衝液遠心分離機を1ml添加することにより洗浄します。この手順を繰り返します。
  7. 暗所で4℃で20分間固定/透過処理溶液を600μlのを追加します。
  8. 5分間170×gで1ミリリットル透過化/洗浄緩衝液および遠心分離で2回洗浄します。
  9. intracelのために：CD68 FITC抗体（千35）を追加各条件のための透過化/洗浄バッファー100μlにlular染色。
  10. CD68抗体溶液中でペレットを再懸濁し、暗所で4℃で50分間インキュベートします。
  11. 5分間170×gで1ミリリットル透過化/洗浄緩衝液および遠心分離で洗浄します。
  12. 再懸濁、透過化/洗浄バッファー100μlでペレットをCD86PE抗体（35：1,000）を追加し、暗所で4℃で20分間インキュベートします。
  13. 5分間、100×gで透過化/洗浄緩衝液および遠心機の1ミリリットルを追加することにより洗浄します。
  14. 透過化/洗浄バッファー100μlでペレットを再懸濁し、チューブ、フローサイトメトリーに渡します。
  15. フローサイトメトリーによってサンプルを分析します。側方散乱光/前方散乱光（SSC / FSC）ウィンドウにゲーテッド生細胞におけるCD45染色を決定します。第2段階では、CD68 +細胞におけるCD86およびCD163発現を分析。

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結果

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私たちは、腎臓に浸潤マクロファージの存在の増加に関連した腎障害の炎症実験モデルにおけるマクロファージの不均一性を分析しました。以前に12報告されているように、このモデルでは、腎臓の損傷は、Wistarラットでの3週間の飲料水中アルドステロン（1ミリグラム-1キロ-1日）に加えて、塩（塩化ナトリウム1％）の投与によって誘発しました。

実験のスケジュールは、図1に示されている。まず、腎臓細胞をコラゲナーゼ（ 図1A）との機械的方法、さらに酵素消化を用いて単離しました。その後、赤血球を溶解し、腎臓マクロファージは、フローサイトメトリーを用いて検出しました。細胞は膜の検出および細胞内染色のためのCD68（ 図1B）のためのCD45、CD86及びCD163のための抗体と共にインキュベートしました。...

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ディスカッション

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マクロファージは、腎疾患を含む種々の炎症性疾患において重要な役割を果たしている異種の細胞です。糸球体腎炎、糖尿病性腎症や腎がん14-16で報告されているように、各マクロファージ亜集団は、腎障害の開発に異なる方法で寄与するため、腎疾患におけるマクロファージのサブセットの特性評価への関心が高まっています。急性腎損傷の初期段階では、M1マクロファージの優位性は、尿細管壊死および炎症を促進し、観察されました。しかし、後の段階でM2マクロファージのより高い含有量は、炎症を解決し、組織リモデリングに関与することが観察されます。 M1は、支配的であること、したがって増加し、炎症性腎障害を永続かもしれないが慢性腎臓病では、M1とM2マクロファージの両方が、同時に共存します。したがって、腎疾患におけるマクロファージの亜型の病態生理学的役割についての知識を増加させることが重要です。免疫組織化学的研究は、堅牢な方法17におけるマクロファージのサブセットの割合を決定することはできません。したがって、定量的に異なったマクロファージの表現型を決定するために腎炎症反応のこれらの細胞の役割を理解するための新しい技術を開発する...

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開示事項

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著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

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この作業は、FIS/FEDER(Programa Miguel Servet: CP10/00479, PI13/00802 and PI14/00883)、スペインアテローム性動脈硬化症学会、スペイン腎臓学会、およびFundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT)からの助成金によって支援されました。FIS/FEDERはPI14/00386とInstituto Reina Sofìa de Investigaciòn NefrològicaからJesús Egidoに資金を提供しています。Fundaciòn Conchita Rabago to Melania Guerrero Hue.Fundaciòn Renal Iñigo Alvarez de Toledo (FRIAT) から Alfonso Rubio Navarro まで。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
層流フードFasterまたは同等の機器
CentrifugeHettichまたは同等の機器
フローサイトメーター (FACSAria)BD Biosciences
ウシ胎児血清BioWestS1820-500
PBS 10xLONZABE17-515Q
コラゲナーゼSigma-Aldrich12/1/9001
ACK Lysing BufferThermo Fisher ScientificA10492-01
フローサイトメトリーストレーナーBD Biosciences340626
Falcon 細胞ストレーナーサーモフィッシャーサイエンティフィック352340
フローサイトメトリーチューブFalcon3520525 ml ポリスチレン丸底チューブ
遠心分離チューブコーニングcentristar430791
ウォーターバスMemmert GmbH + Co. KGWNE 737 °C
固定/透過処理液または透過処理/洗浄緩衝液BD Biosciences554714
Rompum (キシラジン)Bayerまたは同等の
ケタラー (ケタミン)ファイザーまたは同等の
ハンクスの平衡塩水Sigma-AldrichH8264-500ML
生理食塩水ブラウン
抗CD45 (クローン:OX-1) APC-Cy7Biolegend2022161:100
希釈 抗CD68 (クローン:ED1) FITCBio-RADMCA341F希釈 35:1,000
抗CD86 (クローン:24F) PEバイオレジェンド20030735:1,000
抗CD163 (クローン:ED2) Alexa Fluor 647Bio-RADMCA342R4:100
生死染色 分子プローブL349553:1,000
622415 希釈 希釈 希釈

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gansevoort, R. T., et al. Chronic kidney disease and cardiovascular risk: epidemiology, mechanisms, and prevention. Lancet. 382, 339-352 (2013).
  2. Kon, V., Linton, M. F., Fazio, S. Atherosclerosis in chronic kidney disease: the role of macrophages. Nat. Rev. Nephrol. 7, 45-54 (2011).
  3. Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Exp. Nephrol. 128, 21-29 (2014).
  4. Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26, 1363-1377 (2015).
  5. Kinsey, G. R. Macrophage dynamics in AKI to CKD progression. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 209-211 (2014).
  6. Lech, M., et al. Macrophage phenotype controls long-term AKI outcomes--kidney regeneration versus atrophy. J. Am. Soc. Nephrol. 25, 292-304 (2014).
  7. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  8. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8, 958-969 (2008).
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  17. Blackbeard, J., et al. Quantification of the rat spinal microglial response to peripheral nerve injury as revealed by immunohistochemical image analysis and flow cytometry. J. Neurosci. Methods. 164, 207-217 (2007).
  18. Strobl, H., Scheinecker, C., Csmarits, B., Majdic, O., Knapp, W. Flow cytometric analysis of intracellular CD68 molecule expression in normal and malignant haemopoiesis. Br. J. Haematol. 90, 774-782 (1995).

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