対称Bihemispheric死後脳人間に健康と病理学的脳条件を研究するためにカッティング

サマリー

主催脳の切断手順は決定的な神経病理学的診断と特定の神経精神現象を相関させる必要があります。脳挿し木は、様々な臨床学術不測の事態に基づいて異なる方法で実行されています。このプロトコルは、ヒトの脳の病理における半球の違いを調査し、現在および将来の生体分子/ニューロイメージング技術を最大限にするために、対称bihemispheric脳切断手順を説明します。

要約

神経病理学者は、時々、脳の剖検が要求された人のために、これらの患者に説明し、複雑な神経精神現象の決定的な診断を生成するのに必要な知識の量におびえを感じます。生物医学科学とニューロイメージングの進歩は、神経精神分野に革命を起こしているが、彼らはまた、脳の解剖のみ確認値を持っていることを誤解を招くようなアイデアを生成しています。この偽のアイデアは、結果として、減少する可能性が人間の脳の未知の多数の正常および病的な側面を理解するために必要な、より詳細かつ広範な神経病理学的調査を実行するために、剖検率の大幅な削減を作成します。観測された神経精神現象とその可能性neurohistological相関の対応するローカリゼーション/特性評価との間の相関の伝統的な推論方法は、紛れもない価値を持ち続けています。 neuropsychiの文脈でそれは脳組織の直接の物理的な評価に特異的に依存しているので、atric疾患は、伝統的な臨床病理学的方法は、まだそれらに対応する神経病理学的基質にユニークな精神神経機能をリンクするため、可能な限り最高の方法論（および多くの場合のみ利用可能）です。死後脳の評価は、異なる神経病理学センター間で異なる脳の切断手順に基づいています。脳挿し木は、各施設に存在する様々な臨床的および学術不測の事態に基づいて、比較的広範かつ体系的な方法で行われています。より多くの解剖学的に包括的かつ対称双半球脳の切断方法は、少なくとも深さ、特定のための人間の脳（ すなわち 、半球専門と定位の特殊性と正常および病的状態で、コヒーレントに調査するために人間の神経病理学の研究目的のために使用されるべきです機能）。このような方法は、より包括的なコレを提供するであろう現在および将来のバイオテクノロジー及びニューロイメージング技術のための利用可能な神経病理学的によく特徴付けられた脳のction。私たちは、人間の脳の病理における半球の違いの調査のため、現在での使用だけでなく、将来の生体分子/ニューロイメージング技術のための対称双半球脳の切断手順を説明します。

概要

神経病理学者は、人間の脳を評価するための科学的な権限、知的名誉、および診断義務があります。何十年もの間、脳疾患と人間の死後脳におけるそれらの可能neurohistological相関を個別化するための主要な取り組みの詳細な臨床説明が行われています。歴史的に、これらの努力は、現代の時代に高度な、最も生産性の高い医学によるモダリティ、特に神経を表します。以前の著名な神経病理学者と献身、決意、奨学金、および（しばしば非常にルディメンタルツールを使用して）正常および異常脳組織とを区別するための驚異的な能力のおかげで、我々は今、このようなアルツハイマーPerusini病などの疾患を調査し、ターゲットすることができます（不当のみアルツハイマー病と呼ばれます疾患; APD / ^AD）1、パーキンソン病^（PD）2、クロイツフェルト・ヤコブ病^{（CJD）3、}ルー・ゲーリック病/筋萎縮性側索硬化Sclerosi^{S（ALS）4、}およびグアム病^5は 、いくつかを言及します。

、機能的および形態学的磁気共鳴イメージング（ すなわち、fMRIの、拡散MRI、ラクト-MRI など ）、ポジトロン放出断層撮影法等の高精細コンピュータ断層撮影（CT血管造影、すなわち 、マルチセクションスパイラルCTスキャン）のような神経画像の高度な技術、 （PET）、超音波ベースのイメージング、および他のものは、確かに診断し、神経学的および精神病患者を治療する方法に関する私たちの一般的なアプローチを変更しました。それにもかかわらず、神経画像技術が生きている、彼らは直接ニューロンなどの細胞の高度に複雑な細胞および細胞内構造を分析するために、発生した瞬間に、機会を提供していないとき、人の脳を可視化することが可能であるものの、または、マークを視覚化し、細胞内の病変の特定のタイプを定量します。または正確に周回し、サブで彼らの神経解剖学や小地域局在を示すために周回解剖学的レベル。例えば、神経画像技術は、嗅内皮質でADの古典的な特徴を黒質（SN）、PDに関連する一般的な病理学的特徴、または神経原線維変化（NFT）の色素性ニューロンにおけるレビー小体（LB）を識別またはローカライズすることができず、他の脳の病理。高度なデジタル顕微鏡と組み合わせた神経病理学的研究は決定的な診断のために、このように、詳細な臨床病理学的相関関係をまだunreplaceableあると。

人間の脳の特異な解剖機能特性に、特にその解剖学的局在する（つまり、頭蓋骨、その内容を直接審査を許可していない自然保護システム内部）、in vivoでの神経画像技術の導入非常にこの複雑な組織の謎のいくつかに最初の答えを見つけるために臨床医や研究者を支援してきました。しかし、臨床的またはneuroimagiはありません直接剖検時に脳組織を分析するためのユニークな機会を置き換えることができますngの方法。組織的な収集、保存、および人間の脳の分類のみを変更、確認するために、神経細胞および非神経細胞、それらの細胞内成分、細胞内および細胞外の病変、および脳内部の異常のいずれかの種類の直接的かつ体系的調査を許可することができ、または臨床診断を再定義し、新しい臨床病理学的相関を発見します。剖検で脳の評価に関する明白な制限の1つは、この手順は、断面の方法であるという事実でした。常に継続的な神経病理学的プロセス（臨床的に明らかかどうか）とneurohistologicalレベルでそれを定義する機会があれば、間の遅延があります。これは主に自分自身を再生成するために人間の脳の無能力によるものです。 PEを作成せずに、in vivoでの脳組織を得ることが現在可能ではありませんrmanent損傷。これにより、縦方向および神経病理学的に同じ脳/人を評価することはできません。しかし、標準化された脳の銀行手続き、一般市民の間で脳の寄付のための意識向上が大幅に一貫して収集して分析するための例数を増やすことで脳剖検タイミング問題の解決に貢献することができます。このように、死後脳のより適切な数字は、各人間の脳疾患に関連した脳病変の各特定の種類の病理学的起源および進行の一定のパターンを定義するために得ることができました。これは、すべての年齢層全体で寄付し、できるだけ多くの脳のコレクション任意の神経精神障害に罹患した患者から、同様の健康な対照被験者を必要とするであろう。一つの可能​​な方法は、標準的なルーチンなどの一般的な、専門の医療センターからできるだけ多くの死後脳を集めることができました。脳の寄付の必要性は、最近、発現されています認知症と正常な老化^6を研究者たちによります。同じ必要性は全体として精神神経フィールドによって表現されるべきです。

上記および他の理由のために、継続的な脳の切断手順の更新が必要です。また、手続きを切断脳は普遍的にもアカウントに、より良いに調査し、うまくいけば、決定的に理解することは、脳疾患の原因やメカニズムするために、現在および将来のバイオテクノロジーの技術を採用する可能性を取って、世界中のさまざまな神経病理学研究センター全体で標準化されるべきです人間。

ここでは、主に研究目的のために、我々は、ヒトの死後脳の切断のための対称的な方法論を説明します。この手順は、正常に行わよりも多くの脳領域を収集し、大脳と小脳両半球から提案しています。対称双半球脳切断手順は、人間の私たちの現在の知識を持ってはるかに良いフィットします神経解剖学、神経化学、および神経生理学。また、この方法は、可能性が神経病理学的に、一般的または排他的に存在する私たちの種で高い認知および非認知機能と関連しているような半球専門や定位などの人間の脳のユニークな機能を、分析することができます。半球専門/定位脳病変の特定のタイプの間の特定の病原性の関係が存在するかどうか、または独特の精神神経病原性のイベントがあるかどうかを最初に、広く、または排他的に特定の半球に関連した機能は、現在知られていません。この対称的な脳の切断手順を記述することにより、私たちはより良い高度に専門的な組織における正常および病的状態、脳を理解するのに役立つ可能性があり、人間の脳の解剖の更新方法を提案することを目指しています。この方法も考慮に人間だけに存在したものモルフォ機能半球の側面を取ります。

プロトコル

死後のヒト組織を含む手順は、倫理審査委員会により審査し、45 CFR（連邦規則集）の下で免除されています。

注：このプロトコルは、ヒトにおける神経病理学的研究のために確定死後脳の評価のための対称bihemispheric脳切断手順を説明します。装置、器具、材料、人間の脳の切断を実行するために必要な消耗品の詳細な説明は除外されます。脳の解剖のための材料および消耗品は、単一の治験責任医師の裁量で選択され、各研究機関で許可または承認された剖検ツールに基づいています。この手順に必要な工具と材料の最小セットは、材料/機器表に記載されています。例えば、ヒトCJDなどの疑いが伝染脳疾患に特異的な切断手順や注意事項は、この原稿の目的外であり、他の情報源⁷から入手可能です。

1.対称のBi半球脳切削

注：脳はperiagonal、代謝（ すなわち、pH値）に応じて、2〜3週間の期間のために必要な組織固定（使用して、例えば、中性緩衝10％ホルマリン）を受信したことを確認し、組織保存（ すなわち、温度）の条件。しかし、撮像病理相関研究、固定の長期間（> 5.4週^）8が提案されています。

1. 研究者に対して反対方向に向け前頭極と、研究者が直面している平らな面に脳を置きます。
2. すべての皮質脳回と全体の大脳（ 図1a）の脳溝の完全かつ明確な可視化を可能にするような方法で脳を置きます。
3. 髄膜異常をまず見て、巨視的な半球非対称性（焦点、大葉、または萎縮の一般半球現象の可能性指標）、肉眼tissutal病変（ すなわち、tumoRSまたはヘルニア）、先天性奇形、血管の異常、および他の可能性のある異常や脳表面の異常なプレゼンテーション。
   注：人間の脳を評価する方法の詳細については、市販の神経病理学の教科書と剖検マニュアル^9,10を参照してください。

2.プロトコルシーケンス

1. 研究者が直面している半球（終脳）の表面的な側面と、離れた研究者から前頭極に直面しています。可能なマクロ異常を文書化すると可能な臨床神経解剖学と切断後の考慮事項を考慮するために、それぞれの特定の場合には、必要な限り多くのデジタル写真を撮ります。研究助手は、全体の皮質表面をキャプチャするために脳に垂直（ 図1a - c）のデジタル写真を撮影しています。
2. マークの前と脳を切断する前に、インクまたは着色針を使用して、中心後皮質脳回（ 図1b ）。
   注：この手順は、切断後、モータと体性感覚の一次皮質のより多くの即時認識を容易にします。
3. それが同じ方向を向いて維持しながら180度の脳を回転させる（ すなわち、研究者から反対側前頭極）。慎重に脳の基底部を点検します。その脳幹出口/入り口レベルでの脳血管系（ すなわち、脳底および椎骨動脈とウィリスのサークル）と脳神経の条件に特別な注意を払ってください。その極端な弱さに起因するtissutal裂傷を避けるために特別な注意を払って嗅球とトラクトを管理します。
   1. 可能なマクロ異常を文書化すると可能な臨床神経解剖学と切断後の考慮事項を考慮するために、それぞれの特定の場合には、必要な限り多くのデジタル写真を撮ります。研究助手が、皮質および脳幹の表面の全体をキャプチャするために脳に垂直にデジタル写真を撮る必要があります。
4. 脳の基底部に直面し、メスを用いて、（大脳のベースにできるだけ近い）橋の上部のレベルで脳幹の横方向をカット。慎重SN（ すなわち 、蒼白用^）11と隣接する他の構造体^12を検査^します 。正常な脳¹³と比較して、脳の異常な外観の、おそらくオーディオレコーダーデバイスを使用して、注意してください。
5. 再び180度の脳を回転させると、鋭いナイフを使用して、内側縦裂の中心を通って脳梁を切断し、前頭後頭方向に従うことによって、2つの半球を分離します。可能な異常（ 例えば、心室拡大、奇形、組織の軟化、腫瘍など ^）13のための各半球の各側面を点検します。 図2aを参照してください。
   1. 可能なマクロの異常を文書化するためにそれぞれの特定の場合には、必要な限り多くのデジタル写真を撮ると、可能な臨床神経解剖学と切断後の考慮事項を考慮します。研究助手が全体皮質表面をキャプチャするために脳に垂直にデジタル写真を撮る必要があります。正常な脳と比較して、脳の異常な特徴をメモしておいてください。
6. 図2bに示すように、離れた研究者から直面して前頭葉と、その内側の面の上に横たわって、平らな2つの半球を置きます。その中心は、（マークされた半球非対称の場合にも）に触れるような方法でそれらを配置します。
7. 鋭いナイフを使用して、手動で両方の大脳半球を切って、前頭極から始まり、半球の全長にわたって後頭部の極に向かって移動します。 （各半球のための18のスラブの周囲に）脳組織の厚さ1cmのブロックの2つのシリーズを取得します。
8. 別々の平らな面に、解剖学的に組織（前頭後頭方向）の順序で脳のスラブを配置します。白いsurfaを使用してください撮影良好なコントラストのためにそれに印刷された定規とCE。彼らの冠状面が直接眼の検査とデジタル写真（ 図3a）のために表示されていることを確認して、解剖学的に対称的な方法（前頭後頭方向）における脳スラブの2つのシリーズを表示します。より正確に脳構造、大きさ、および可能な異常をローカライズするために両面に印刷ミリグリッドで切断面を使用してください。
   1. 可能なマクロ異常を文書化すると可能な臨床神経解剖学と切断後の考慮事項を考慮するために、それぞれの特定の場合には、必要な限り多くのデジタル写真を撮ります。研究助手が全体皮質表面をキャプチャするために脳に垂直にデジタル写真を撮る必要があります。正常な脳と比較して、脳の異常な側面の、（おそらくオーディオレコーダーデバイスを使用して）メモを取ります。
9. 鋭いメスを使用して、手動でのより小さな矩形ブロックを分析確立された各脳領域に対して脳組織。 表1に記載の提案脳領域コレクションスキームに従ってください。
   1. 別々に標識されたhistocassettes内の各組織ブロックを置きます。
      注：脳組織の各ブロックは、可能な限り、標準histocassette最大量（30×20×4 mm ³で^）を適合するように切断される必要があります。
   2. （;むしろ、 表1に示すように、常に、同じ地域の解剖学的名称または対応する番号を使用し、異なる脳のために、ランダムな文字や数字を使用していない）各ケースのデ識別コードを使用して、特定の神経解剖学的識別子を使用してhistocassettesにラベルを付けます。例えば、それぞれの場合のために、ランダムまたは半ランダムな数字を生成することにより、脱識別コードを作成します（ すなわち 、Bは脳のためにとどまりBRC 130は、Rは、リソースのためにとどまり、Cはセンターのためにとどまり、130プログレッシブアクまたはAD160001ですADは、16である」、アルツハイマー病研究」を表します剖検が行われた年（2016年）、そして0001プログレッシブアク検体番号）。
      注：この手順は、将来の研究のために非常に便利です。伝説を維持し、半球（L =左半球、R =右半球）を指定します。各半球のための特定の色を確立し、histocassettesの2つの異なる色を使用してください。
   3. 可能macroanomaliesを文書化すると可能な臨床神経解剖学と切断後の考慮事項を考慮するために、それぞれの特定の場合には、必要な限り多くのデジタル写真を撮ります。研究助手が全体皮質表面をキャプチャするために脳に垂直にデジタル写真を撮る必要があります。正常な脳と比較して、脳の異常な特徴をメモしておいてください。
10. デジタル写真を撮る全体カット脳および関連histocassettesの（必要または所望のように多くのように）。
11. （アキュパンチにより例えば、）パンチDNA抽出と遺伝子解析のための組織の小片。つかいます直径5ミリメートル - 2のパンチ。
    注：ゲノム物質の含量が高いため、小脳が好ましい選択肢です。しかし、他のどの地域で結構です。
12. 以前に組織処理の次のステップまで使用されるような固定液（ 例えば、10％中性緩衝ホルマリン）の同じタイプで脳組織のブロックを含むすべてのhistocassettesを再浸します。
13. 人間のホルマリン固定組織処理¹⁴のための標準的な手順に従ってください。

3.特別なアプローチ：交互冷凍と固定対称Bihemispheric切削

注：セクション2で説明した対称bihemispheric脳の切断プロトコルは同じ体系的かつ対称に未固定、新鮮な脳（使用可能な場合）からの組織スラブを切断する可能性を提供しています。

1. 中で10分間-80℃のフリーザー脳組織を強化するためにwithou - 逆さまに（好ましくは半球状の椀状のプラスチック表面上の）8のための全体の新鮮な脳を置きますtは、生化学的損傷を誘発し、手動切断を容易にします。
2. 鋭いナイフを使用して、交互に連続するようにして両半球をカットし、第2節で説明した脳の切断プロトコルに従うが、（両半球からと前頭後頭解剖学的な方向に沿って）他のすべてのスラブを凍結して修正。
   1. この時点で、 表1に記載したように、各脳領域をカットしようとしません。即時RNAまたはタンパク質の抽出（ すなわち、ゲノムやプロテオーム研究のため^）15のために必要な場合にのみ、特定の新鮮な脳領域をカットします。
3. 切断した後、すぐに各新鮮な組織を、ラベルを凍結し、そして数。全体スラブシリーズのデジタル写真を撮ります。単一ビニール袋に各スラブを詰めます。独立した、1 - 脳専用容器にスラブを集めます。そして専用の-80°Cの冷凍庫で容器を保管します。
   注：冷凍庫は唯一のヒト脳組織専用にする必要があります。唯一の後に歌います各特定の実験に必要なレ凍結脳領域を切断します。
4. 十分な固定液の量（固定液/組織ブロック比の3/1量）を含む別々の袋で固定（10％中性緩衝ホルマリンまたは他の固定剤）のために選択された他のすべての組織のスラブを浸し。連続前頭後頭シーケンスに続く、それらを番号付けすることにより、各袋にラベルを付けます。各袋を密封、デジタル写真を撮って、そしてプラスチック容器に保管してください。
5. 組織固定の2週間後に、固定剤含有袋を開き、 表1に記載されているように、各脳領域をカット。

4.組織染色剤および免疫組織化学

注：脳領域の集合が提案方式に基づいてカット（ 表1）は AD ¹⁶のために最も、全てではないが、現在確立合意に基づく病理学的基準を満たすのに十分である、PD ^17、レビー小体^（DLB）18認知症、前頭側頭型認知症（FTD / MND） ^{19、プログレッシブSuprabulbar麻痺（PSP）20、多系統萎縮症（MSA）21、 などの慢性外傷性脳症（CTE）22、。}

1. 各脳領域のため、両半球のために、histostainsの次の最小セットを実行：ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）、クレシルバイオレット（CV;定量的形態学的研究は、例えば計画されている場合）、および銀染色（もし「探索」の分析があります必要に応じて）。
2. 各脳領域の場合と両半球のために、免疫組織化学プロトコルの次の最小セットを実行します（βA）、リン酸化タウ（pTau）、リン酸化αシヌクレイン（Pα-SYN）アミロイドβ、およびリン酸化-TDP43（pTDP43） ^{14について}記載^しました 。
   注：（両半球からのすべての脳領域が利用可能な場合）、このプロトコルに従って各脳を評価するために、組織切片の総数は46です。

結果

プロトコルの長さ

単一の対称bihemispheric固定脳切断手順のために費やされた時間は1時間と推定されている（;ラベリング;表面を解剖テーブル、ツールを設定し、切削費やした時間を除く。 など ）。単一の対称双半球交互凍結固定脳切断手順に必要な時間は2時間を要すると推定されます。単一のヒトの脳/主題のための決定的な組織学的診断を得るために6週間 - それは、少なくとも4の間に取ることができます。頭蓋骨からの死後脳を除去した後、組織固定の適切な期間（2 - 少なくとも3週間）が発生しなければなりません。そして、対称bihemispheric脳切断、組織の処理、組織包埋ブロック切片、および染色および免疫組織化学を実施しなければならないなどのプロトコルの一連。半球ごとの各領域の最後に、微視的評価、共同の使用nsensus確立病理基準及び分類、臨床記録のレビュー、そしておそらくclinicopathologyの相関は、神経病理学的な結論の前に行...

ディスカッション

この脳の切断方法は、依然として、その主な機能の一つとしてbihemispheric対称な切断手順を維持しながら（例えば、各半球のために評価する脳領域の数を減らすことによって）それぞれの神経病理学研究室の特定のニーズに適合させることができます。この提案されたプロトコルは、日常的な手順（研究指向の神経病理学的中心）または、必要な場合にのみ（特定の臨床的指向の研究）を使用することができます。これは、選択的にのみ調査の特定のタイプ（ すなわち、免疫組織化学）または分子分析（ すなわち 、ゲノムまたはプロテオーム解析）のために使用することができます。技術的な観点からは、（特に免疫組織化学で）いくつかの病理学的な違いは、免疫組織染色強度の可能な人工的な変動に起因することができることを言及するのに有用です。これらは、劇的に人工染色効果aの可能性を低減する、自動染色機を使用することによって最小にすることができますNDバリエーション。これは、技術的に信頼性の高いロボット染色機を用いて技術的アーティファクトによる交絡因子の大部分を最小化するために、実際には、現在可能です。 、例えば2つの同一の被験者から大脳半球、または複...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
研究使用のための剖検と脳提供を許可する署名されたインフォームドコンセントのコピー。
-神経学的および精神医学的症状および徴候の詳細な説明を含むべきである被験者の詳細な病歴。
利用可能な場合、医療または非医療のビデオ録画(特に運動障害の分野で有用)。近親者の同意が必要です。
神経イメージング、神経生理学、神経精神医学および評価または臨床測定スケール。
遺伝的および家族歴データ。神経遺伝性疾患が診断された場合の遺伝報告のレビュー。
組織学容器	電子顕微鏡科学	64233-24
組織学カセット	VWR	18000-142 (オレンジ)
組織学カセット	VWR	18000-132 (ネイビー)
ナイフハンドルと使い捨てブレード	電子顕微鏡科学	62560-04
ロングブレード	電子顕微鏡SCIENCES	62561-20
使い捨てブレード ナイフ ハンドル	電子顕微鏡 SCIENCES	72040-08
メス ブレード	電子顕微鏡 SCIENCES	72049-22
Accu-Punch 2	mm 電子顕微鏡 SCIENCES	69038-02
ポリスチレン容器 –滅菌電子	顕微鏡科学	64240-12
解剖板	電子顕微鏡科学	63307-30
ホルマリン溶液、中性緩衝、10%	シグマアルドリッチ	HT501128シグマ
ヘマトキシリン溶液、ギルNo.2	シグマアルドリッチ	GHS280 SIGMA
Eosin Y溶液、シ	グマ・アルドリッチ	HT1102128 SIGMA
anti-beta-amyloid	Covance, Princeton, NJ	SIG-39220	1:500
anti-tau	Thermo Fisher Scientific	MN1020	1:500
anti-alpha-synuclein		Abcam ab27766	1:500
anti-phospho-TDP43	Cosmo Bio Co.	TIP-PTD-P02	1:2000
デジタルカメラ	任意の
ヘッドインパルスシール機	グレイン	ジャー5ZZ35