方法論記事

細胞の表面のガイダンスとBioprintingための自動ロボット調剤技術

DOI：

10.3791/54604

⸱

2016年11月18日

 ,  ,  , 
1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、エッチングされたトポグラフィーガイダンスキューとハイドロゲルバイオインクを持つ細胞の精密な堆積を組み込んだ自動ロボット堆積システムを使用したバイオプリンティング方法論を説明しています。印刷されたセルは、エッチングされた形状に直接送達され、それらを使用して感知し、方向付けすることができます。

要約

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この原稿は、自動ロボット分配システムを使用して、ヒドロゲルbioinkこれらの機能への細胞の直接送達に続いて、細胞ガイダンス機能の導入について説明します。それは、細胞が向かって沈降や機能を感知することを可能にするように、特定のbioinkを選択しました。分配システムは、背圧アシスト記録ヘッドを用いたヒドロゲルbioinks中の生存細胞をbioprints。しかし、尖ったスタイラスまたはメスでプリントヘッドを交換することによって、分配システムは、表面エッチングによって地形キューを作成するために使用することができます。スタイラスの動きは、X、Y及びZ方向に10ミクロンのステップでプログラムすることができます。パターン化された溝は、溝 '方向に整合した細長い形態を採用するように影響を与える、間葉系幹細胞を配向することができました。パターニングは、直線、同心円、及び正弦波にプロットソフトウェアを用いて設計することができます。以降の手順では、線維芽細胞および間葉系幹細胞は、背圧駆動押し出しプリントヘッドにbioprintingために、2％ゼラチンbioinkに懸濁しました。細胞軸受bioinkは、その後エッチングに使用したのと同じプログラムの座標を用いて印刷しました。 bioprinted細胞が感知し、エッチングされた溝の方向に沿った細長い配向によって実証されるようにエッチングされた機能に対応することができました。

概要

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セル配置の意図的なパターニングは、 インビボ細胞、組織1 で模倣文化の形成を可能にします。実際、複数の細胞型の間の相互作用の研究は、それらの空間配置2,3を編成することによって支援することができます。ほとんどのパターン形成システムは、後続の受動細胞沈着を伴う細胞接着を促進または防止するための表面修飾方法に依存しています。 Bioprintingは、細胞分布1以上の空間的および時間的な制御を提供しています。これらの機能に加えて、bioprintingは、幾何学的に複雑な足場4を生成するための技術的に、簡単迅速かつ費用効果的な方法であると記載されています。これは、コンピュータ設計ソフトウェアを利用し、製造プロセス4への細胞の導入を可能にします。

Bioprintingシステムは、レーザーベースのインクジェットベースまたは押出しベース4としての動作原理に基づいて分類されています。それは現実的な時間枠内4-6臨床的に関連するサイズの組織化構築物の製造を可能にするように、押出bioprintingは最も有望なものとして説明されています。これは、細胞担持ヒドロゲルbioinkの機械的または背圧補助押出のいずれかによって行われます。ここに提示された方法では、背圧を使用しました。前述したように、細胞は、細胞適合性bioinkで配信されます。このようなbioinkは、有害なせん断応力を生じることなく細胞の送達をサポートし、崩壊または7-10（「インクブリード」と呼ばれる）拡散することなく、印刷されたトレースの完全性を保持するのに十分な粘度であるべきです。

それらの接着面との細胞の相互作用は、細胞の挙動に影響を与えることが知られています。表面トポグラフィは、細胞の形状、方向11、さらに表現型を制御することができます。具体的には、溝およびチャネルの製造を誘導することが実証されています複数の細胞型に伸ばし、細長い形態。この形態を採用する多能及び多能性細胞の表現型に影響を与えることが見出されています。例えば、溝に整列させた場合、間葉系幹細胞（MSC）の合成10,14-17上に収縮性表現型を採用心筋12,13および血管平滑筋細胞への分化の証拠を示します。

チャネル又は溝を整列させる細胞は、例えば、ディープ反応性イオンエッチング、電子ビームリソグラフィ、直接レーザー印刷、フェムト秒レーザー、フォトリソグラフィおよびプラズマドライエッチング18、多数の方法を介してポリマー表面上に生成することができます。これらのアプローチは、多くの場合、時間がかかり、複雑な装置を必要とし、生成されたパターンの形状に限定することができます。また、彼らはbioprintingパターニングを同期しないと即時細胞化することができません。自動化の協調制御された動き分配システムは、ソリューションの堆積のための複雑なパターンに従うことができます。ここでは、マイクロ制御運動が細胞配向のためのチャネルを作成するために利用することができる方法を示しています。尖ったスタイラスまたはメス押出注射器の代わりに、プリントヘッドに取り付けられ、装置は、その後、描画ソフトウェアの指導の下でポリマー表面をエッチングすることができます。この方法は、パターン設計で汎用性を提供し、一般に、ポリスチレン、PTFE、ポリカプロラクトンなどの生物工学に使用されるポリマー材料にも適用可能です。エッチングに続いてのステップとして、細胞が傷の溝に直接bioprintedすることができます。ここで利用されるゼラチンbioinkは、トレースを維持し、堆積した細胞は、エッチングされた特徴を検出することを可能にするのに両方のことができました。エッチングされた溝にbioprinted間葉系幹細胞は、異なる行にそれらに沿って伸長することが実証されました。

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プロトコル

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注：このプロトコルは、表面エッチング（ 図1B）および押出によるbioprinter（ 図1C）10などの背圧アシストロボット分配システム（ 図1A）の使用を記載しています。

ポリスチレン表面の1.修正

  1. ポリスチレン組織培養プレートはエッチングや印刷の両方の高さの一貫性を台無しに、中央に上向きにお辞儀をする傾向があるので、1ミリメートルのポリスチレンシートを使用してください。
    注：ポリスチレンシートは、細胞接着のために変更されないように、プラズマ処理が行われます。
  2. 酸素プラズマ処理。
    1. まず、プラズママシンに接続された酸素ボンベのレギュレータに2バールの圧力を選択します。その後、マシンのコントロールパネルに以下の条件にし、入力プラズママシンを切り替える：150 W、酸素の30 SSCM、10分（電力、ガスの流れと時間のために、それぞれが）。
    2. ポリスチレンsubstratを配置プラズマチャンバ内に電子、ドアをシールし、コントロールパネル上のスタートボタンを押してください。ウシ胎児血清中の酸素プラズマ処理したポリスチレン基板を浸漬し、三回、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄する前に、2時間37℃でインキュベートします。

2.プログラミングプリントパターン

  1. スタイラスまたはメスで第1のエッチングにサーフェスをプログラムを使用してください。
    1. スタイラスを使用している場合、それはくさび止めして固定されるまで、（5または10ミリリットル）、分注シリンジのノズルに（細心の注意と内側から）1.5ミリメートルの直径の繊維の針を挿入します。メスを使用している場合、それは印刷アームのクランプ機構に固定することができるように、メスを取り扱うラウンドを選択します。
      注：スタイラスは、より良い手術用メスの刃よりも湾曲したパターンをエッチングします。
    2. 最初bioprinted配置を作成しようとすると、XY座標を生成するために、番号軸とグラフ用紙上に所望のパターンをスケッチ。その後私は表計算ソフト（ 図2）にエッチング/ bioprintedパターンの座標NPUT。
      注： "所望のパターン」とは、直鎖状、S字状、または円形のような多くの形状であってもよいです。選択は、ここに示されたように心筋細胞へのMSCの分化のための平行線状の線として、必要な実験モデルに依存します。散布グラフ機能は、提案されたプロットパターンの可視化を可能にします。
    3. 印刷/ディスペンシング・ソフトウェアを開きます。 「プログラムを>プログラムの追加」を選択し、続いて「編集>ポイントの追加」プログラムを設定します。 Xをエクスポートし、yは関数を使用してソフトウェア/分配プリントにスプレッドシートから得られた座標値を「コピー＆ペースト」。
    4. 表面にスタイラス/プリントノズルを配置するために、各ランの前にロボットの「Z」の高さを調整します。
      1. 印刷/分配するソフトウェアでは、「ロボット」オプションを選択して変更モード＆ "をクリックしてください＃34;そして「ティーチングモード」オプションを有効にします。選択すると、ソフトウェアは、ロボットの「ジョグ」機能を有効にします。
      2. ジョグするには、最初のメニューバーから次のコマンドを選択することで、デフォルトの位置にロボットを初期化します。 「ロボット> Mecaの初期化」は、その後、「ロボット>ジョグ」を選択します。入力パターンの起源に正確にスタイラスを配置するために必要な「XとYスロット」で（単位mm）の数値。
      3. 次に、「Zスロット」で入力（単位mm）の数値は、表面に接触し、スタイラスや印刷ノズルを配置したが、フレックスないか、表面をインデントします。この点は、「Z」の開始値として指定されます。
        注：各溝の深さは、システムのZ高さを使用して容易に変更することができます。 40、80、および170ミクロンの溝は1mm厚のポリスチレンシート（ 図4および表1）の表面にカットすることが実証されています。
    5. Pを選択終了するためにロボットに知らせるために中間点と「ラインディスペンスの終了」を指定するために、「ラインの受渡し」を最初のポイントと印刷の開始を定義するための座標点、 すなわち 、「ラインディスペンスのスタート」のそれぞれについて、RINT命令プリントラン。
    6. 上部のメニューバーから次のコマンドを選択することで、ロボットにプログラムを通信：「ロボット> C＆Tのデータを送信します」。
    7. 「ファイル名を指定して実行」モードにロボットを変更することにより、エッチング/プリントランを開始します。上部のメニューバーから ">実行モードを切り替えるモードの変更>ロボット」を選択することによってこれを行います。
    8. ロボットディスペンサーコンソール上に緑色の「スタートボタン」を押すことにより、印刷手順を開始します。

3.細胞含有ゼラチンBioinkの調製と印刷

  1. 最小必須培地アルファ培地（αMEM）中の2％ゼラチンを溶解させ（10％FBSおよび2％の抗生物質/ antimycotを補充2時間60℃でIC）はbioink溶液を調製しました。
  2. 前培養赤色蛍光タンパク質は、αMEM/ 10％FBSを用いて、10cmの組織培養皿中で70％コンフルエンスまで間葉系幹細胞（RFP-MSCの）を発現します。 37℃で5分間、1×トリプシン-EDTA溶液を用いた培地およびコーティングを除去することにより、サスペンションに付着した細胞を解放します。
  3. 5分間の千×gの遠心分離により細胞をペレット化し、上清を除去します。 1×PBS 0.5 ml中に細胞ペレットを再懸濁し、血球計を用いて細胞密度を計数します。
  4. bioinkを室温に冷却した後、穏やかに5×10 6細胞ml -1の最終濃度を達成するためにbioinkにRFP-MSCの懸濁液に十分な量で混合します。
  5. 密封されたノズルを有する印刷シリンジに細胞ベアリングbioinkを注ぎます。印刷可能な粘度を達成するために、4°Cにロードされた注射器を冷やします。
  6. 自動でロードされた注射器を置きますロボット分配システムは、空気圧ラインを取り付けます。シリンジルアーシールを外し、プリントノズルを取り付けます。
  7. 予めプログラムされた堆積以下、ポリスチレンフィルム表面に27 G針/ノズル（円筒上推奨テーパ）を介して、10mLの注射器から5mm /秒の書き込み速度で、0.05メガパスカルに背圧を用いて細線に細胞化bioinksを押し出しますステップ2.1で説明したパターンは、事前にエッチングされた溝の上に細胞化bioinkを配置します。
  8. 室温で1時間インキュベートした後、倒立蛍光顕微鏡を用いて観察する前に24時間（細胞が感知し、エッチングされた特徴に対応することを可能にする）ために細胞を（10％FBSおよび抗生物質を補充した）を10 mlの増殖培地を添加し、インキュベート10X倍率で。

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結果

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代表的な結果は、背圧支援ロボット分配システムは、表面エッチング及びbioink印刷（ 図1 A）の両方を実行するための押出によるbioprinterとして使用することができることを示しています。これは、ポリマー表面にエッチングされた溝の生成のために使用することができ、その後、機能（ 図1 B及びC）に直接bioinkを有する細胞を印刷します。

エッチングと印刷の両方がアプリケーション（ 図3 AC）に必要な線形、湾曲した放射状のパターンの印刷を可能にするソフトウェアを分配/印刷にプログラム座標（ 図2）入力によって決定されます。 Z軸の設定は、エッチングされた溝の深さ（ 図4および表1）の制御を可能にします。

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ディスカッション

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この手順の重要なステップは、プロセスが、機能に細胞沈降を可能に出血/ bioinkが広がることなく印刷し、せん断応力の細胞死せずに細胞を送達し、不要な系統への分化を誘発してはならないように、幹細胞の実際のbioprinting配信です。

期待されるセルの配置が発生し失敗した場合は、bioink粘度は、印刷のためのその適合性について評価すべきです。 bioink細胞がパターン化されたポリマー表面に沈降することを可能にすることが重要です。 bioinkポリマーの濃度を低減することができるか、その温度は、粘度を低下させ、細胞の沈殿を促進するために、（37℃の最大値まで）増加しました。しかし、これらの減少は、/ブリード印刷後を広めるためにbioinkを引き起こす可能性があります。ここでは、（w / v）の1×PBSに溶解した2％のゼラチンを使用することをお勧め。細胞濃度印刷後の減少表示された場合、その後の印刷により誘導されるせん断応力は妥協していることができます印刷されたセル7の生存率。前にこのようなレサズリンfluoresence 7の活性化と...

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

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ここで紹介する作業は、シンガポール国立研究財団のCREATEプログラム（NRF-Technion（心臓修復治療研究プログラムにおける再生医療イニシアチブ）と、科学技術研究庁（A*STAR）の科学工学研究評議会）（SERC）の公共部門資金）（PSF)2012の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Equipment
Robotic ディスペンシングシステムJanome2300N
プラズママシンフェムトサイエンスコーヴァンス
USB 顕微鏡
光学顕微鏡オリンパスIX71
Name会社名strong<>カタログ番号コメント
ソフトウェア
スプレッドシートExcelExcel 印刷
座標ソフトジャノメJR Cポイント
イメージングソフトウェア国立衛生研究所(NIH)ImageJ
名会社カタログ番号コメント
装備
スタイラス(刃)OLFAAK-5
5ml印刷シリンジ三栄テックSH10LL-B
30 G印刷針サンエイテックSH30-0.25-B
1 mm ポリスチレンシート現地
ウシ胎児血清Invitrogen 10270-098
リン酸緩衝生理食塩水Invitrogen
ゼラチン、ゲル強度 300、タイプ ASigma Aldrich9000-70-8
αMEMInvitrogen41061-029
抗ビオクト系抗真菌薬Sigma AldrichA5955-100ML
赤色蛍光タンパク質間葉系幹細胞 (RFP-MSCs)サイヤジェンバイオサイエンス株式会社RASMX-01201
購入 豚皮からの

参考文献

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