シーケンシャル燻蒸インキュベーション・プロシージャを使用した土壌中の不安定な有機炭素の評価

サマリー

不安定な有機炭素(LOC)と潜在的な炭素代謝率は、土壌の栄養循環プロセスの変化の敏感な指標です。一連のサイクルで土壌を燻蒸およびインキュベートし、インキュベーション期間中に蓄積されたCO₂を使用してこれらのパラメータを推定する方法について詳細が提供されています。

要約

管理慣行と環境変化は、土壌養分と炭素循環を変更することができます。土壌不安定な有機炭素、容易に分解Cプールは、外乱に対して非常に敏感です。また、栄養循環の基本である土壌微生物のための主要な基板です。これらの属性に、不安定な有機炭素（LOC）は、土壌の健康の指標パラメータとして同定されています。 LOCの回転率を定量化することも、土壌の栄養循環プロセスの変化を理解するのに役立ちます。シーケンシャル燻蒸培養方法は、土壌LOCと電位C代謝回転速度を推定するために開発されました。この方法は、土壌サンプルを燻蒸や燻蒸インキュベーション一連のサイクルで10日間のインキュベーション期間中にCO ₂ -Cの呼吸を定量化する必要があります。不安定な有機Cおよび潜在的なCの離職率は負の指数モデルで蓄積されたCO ₂から推定されています。この方法を実施するための手順を説明していますD。

概要

炭素（C）と栄養循環や土壌の変化に対する感度におけるその重要な役割に、土壌のLOCは、土壌有機物の質の指標として測定するための重要なパラメータです。大規模な程度に森林や農業生態系は、栄養源として土壌有機物中の栄養素の鉱化作用に依存します。管理活動は、栄養供給¹の変更を伴う、土壌有機Cのプールサイズと離職率を変更することができます。土壌有機Cは数年^2,3,4に数週間から離職率を持って反抗数千年の離職率を持つC、およびLOC、2つの主要画分で構成されています。土壌に不安定なCは、このような植物リター^1,4,5から微生物バイオマスC、低分子量化合物（アミノ酸、単純な炭水化物）植物rhizodepositionから、分解副生成物や浸出水として容易に分解性の基材で構成されています。土壌に不安定なCは、容易に分解可能であるため、それがあります邪魔や土壌^6を変える経営慣行や自然現象に非常に敏感。土壌不安定なCは、有機物⁷の分解における土壌微生物のための一次エネルギー源として機能します。土壌有機C ⁸の安定な形態の場合よりも大きい程度に、このような、LOCの影響栄養素サイクリングなど。土壌微生物はまた、LOC ^9,10,11のプライミング効果によって容易に反抗土壌有機物の分解時に発生する従属栄養呼吸の大部分を担っています。土壌有機Cは約2倍、その大気のC ¹¹のであるため、この呼吸は、グローバルCサイクルにおける実質的な役割を果たしています。

陸上生態系におけるその重要性の結果として、いくつかの方法は、土壌LOCを推定するために開発されてきました。物理的、化学的、および生化学的なこれらの方法は、3つの一般的な分類に描写することができます。デンシトメトリーの分離方法は、物理メタあります重鎖または軽画分にまたは粗微粒子有機C ^12,13,14,15に土壌有機C分離で構成されてODS。分離方法は、実行するのが比較的容易であるが、これらの画分は、土壌型鉱物組成に応じて変化するので、それらは多くの場合、植物材料の大きさと密度、土壌凝集一貫^13,15、一貫した結果を生じません。分離方法はまた、LOC ¹⁵についてのみ定量的情報を生成します。

いくつかの化学的方法は、LOC推定のために用意されています。有機炭素の水性抽出を実行するのが比較的容易であり、方法は、多くの場合、容易に再現可能な結果を​​提供します。しかし、これらの抽出物は、微生物¹⁵のために利用可能な基板の全体のスペクトルを伴いません。土壌有機Cの化学的分別のためのいくつかの酸化方法が開発されています。酸化方法は、不安定な有機Cの量と質を特徴付けるという利点を有します、いくつかの方法が有害化学物質との仕事を必要とし、結果¹⁵の再現性の方法のうちのばらつきはあるものの。酸加水分解の抽出方法は、LOCの量および質を測定することができる化学的分画手順の別のタイプであるが、この方法の結果は、その生物学的特性^13,15の解釈を容易にしません。

土壌LOCの解釈のための生化学的方法が開発されています。 CO _2は、呼吸アッセイにおいて微生物によって放出されるように不安定な有機Cを測定することができます。これらのアッセイは、真の無機化有機物質の推定値を提供するが、典型的には、唯一の最も不安定な化合物は、アッセイ¹⁵中に鉱化されています。燻蒸インキュベーション¹⁶及び燻蒸抽出¹⁷によって測定された土壌微生物バイオマスCはLOCに関する推論を開発するために使用されてきました。しかし、これらの手順は、微生物バイオマスはなく、LOにCの推定値を提供しますC.燻蒸両方の手順は、微生物バイオマスCを決定するために、非燻蒸土壌からの値の減算を含むが、非燻蒸土壌を減算せずに得られた値は、微生物バイオマス¹⁸に加えて、Cの不安定な有機画分の測定値を与えることが示唆されています。

LOCを測定するためのシーケンシャル燻蒸インキュベーション（SFI）の手順¹³土壌微生物バイオマスC測定のための燻蒸インキュベーション手順¹⁶から適応生化学的な方法です。 SFI方法はLOCを推定する他の方法に比べいくつかの利点を有します。この方法のための概念的基礎は、LOCは、微生物の成長を支配する微生物分解性Cであり、そのLOCが物理的にアクセス可能と土壌微生物による化学的に分解可能であるということです。フィールド条件下で、微生物の増殖は、典型的には、炭素の可用性、栄養素利用可能性、利用可能な孔空間、及び/又は捕食によって制限されます。これらの要因は、ほぼelimiあります微生物の増殖のために妨げられない条件を作成し、燻蒸によっていますか。いいえ栄養素がメソッドのインキュベーション期間の間に除去されていません。複数の燻蒸およびインキュベーションのサイクルの間に、微生物の増殖は、C量と質（不安定性^）13によって制限されるようになります。インキュベーションのサイクル中に蓄積CO ₂呼吸は、単純な負の指数モデル^11,13,19とのLOCを推定するために使用されます。潜在的なCの代謝回転速度はまた、指数モデルの傾きから得ることができるので、SFI法が同時に濃度およびLOC ¹¹の潜在的な代謝回転速度を推定する他のほとんどのLOC方法に優る利点を有します。このような¹⁴ Cなどのトレーサーは^13を使用している場合は他の方法については、LOCの潜在的な離職率に関する情報のみを確認することができます。 SFI方法は、このようにLOCとその潜在的な離職率の両方の測定値を得るために、比較的簡単で安価な手法です。

プロトコル

1.実験エリア内および実験的ユニット²⁰内の条件のサンプルの代表を取得するために土壌を収集

1. テクスチャ、嵩密度、pHは、有機地平線の深さ、および/または栄養素の濃度を含む、このような斜面や土壌特性などのサイトの特性の違いを識別します。プロット内の植生タイプの違いを識別します。サイトの特性が予め指定された相対誤差を達成するために必要なサンプルの数を推定するための変動係数の既知の又は公表さ推定を使用。
2. サイトおよび実験装置の条件に基づいたパターンで、オーガまたは他の収集装置を使用して、サンプル土壌。
   1. 均質な条件については、それぞれの実験装置内でランダムサンプリングパターンを使用します。
      1. 実験的ユニット内またはジグザグパターンでは完全にランダムな位置のいずれかでサンプルポイントを割り当てます。
      2. 各ランダム点で、またはジグザグパタパタに割り当てられたポイントでサンプル土壌n個。土壌サンプルを掘削するためにオーガーまたは他の収集装置を使用する前に、鉱質土壌の表面から有機物を払いのけます。
         注：SFI方法はOAからと¹³以下の土壌層位を使用して開発されました。 Oaの上記視野のSFI法を用いて試験することができるならば、さらなる試験が必要です。
      3. 単一の容器に実験単位以内収集されたすべてのサンプルを組み合わせて、物理的に各実験装置用の複合サンプルを作成するために、容器内の個々のサンプルを混ぜます。
   2. はるかに一般的である異種の条件については、それぞれの実験ユニット内の系統的なサンプリングパターンを使用します。
      1. 横断中のサンプル点の間の距離は、実験単位内の変動性を表すために必要な距離よりも小さくなるように各実験装置の中央に横断沿ってサンプル土壌。
      2. 各EX内の複数のトランセクトに沿ってサンプルの土壌変動の複数のソースを持つ比較的大きな実験単位または実験単位のグリッドパターンを形成perimentalユニット。
      3. 単一の容器に各トランセクトに沿って収集したすべてのサンプルを組み合わせて、物理的に各トランセクト用の複合サンプルを作成するために、容器内の個々のサンプルを混ぜます。

2. SFIアッセイのための土壌を準備

1. アイスパックに入れサンプルは、現場で収集した後、クーラーすぐに満たされました。
2. 施設に到着するとれる試料は、試料調製及びSFI手順が実施されるまで、4℃の冷蔵庫に分析箇所サンプルまで格納されます。
3. 6.4ミリメートルX 6.4ミリメートルメッシュのふるいを通してふるい土壌サンプル。サンプル間の汚染を防ぐために、各サンプル間の水とメッシュを清掃してください。
4. 各サンプルについて、3 100グラムのサブサンプルを測定し、250ミリリットルのビーカーに100グラムのサブサンプルを配置します。 EACをカバーパラフィルムで時間ビーカー、25℃で10日間カウンターにそれらを残します。

3.オーブン乾燥重量決意のための副試料を取ります

1. 土壌サンプルの10日のプレインキュベーションの終わりに、各試料からパラフィルムを除去します。
2. アルミボートの重さの重量を記録します。計量ボート内のすべてのサンプルと場所から土壌1グラムを取ります。
3. 湿った土の重量を記録し、ボートの重量を量ります。
4. 105℃のオーブンで土壌とボートの重量を量る置きます。サンプルは、48時間後に、典型的には、一定重量、計量ボートや土壌のレコードの重みに到達した後。
5. しっとりと乾燥土壌の重量を得るために計量ボート内の湿った土壌や乾燥土壌を撮影した重量からボート重量を量る引きます。湿った土の重量で乾燥土壌の重量を割ることによって湿った土壌比：乾燥を求めよ。

4.土壌サンプルを燻蒸

1. （MOR少なくとも二つの底に湿ったペーパータオルを置きeは磁器プレートと10.5 Lガラス真空デシケーター）サンプルの数に応じて必要であり得ます。
2. すべてのサンプルについて、3つの別個のガラスバイアルに土壌30gの重量を量ります。 5章で説明した培養容器のデザインが使用されている場合、40ミリメートルの開口部内に収まるように土壌の40グラムを保持するのに十分な大きさと十分に狭いバイアルを使用してください。
3. 各30グラムの土壌のサブサンプルを識別するための標識テープを使用している場合は燻蒸は、インクが低下するため、鉛筆を使用しています。
4. 燻蒸や燻蒸を行いません真空デシケーター中に1サブサンプル用の真空デシケーターに各土壌サンプルのための3つの30グラムのサブサンプルのうちの2つを配置します。
5. 100ミリリットルのビーカーでは、ビーカーの底をカバーするのに十分な沸騰石の層を配置します。
6. 沸騰石の層で100ミリリットルのビーカーにエタノールフリーのクロロホルム（CHCl ₃を）の50ミリリットルを注ぎます。 30グラムの土壌を詰めデシケーターの中央に沸騰石、CHCl ₃で100ミリリットルのビーカーを置きサブサンプル。ヒュームフードの下で、この工程を行います。
7. ヒュームフードの下では、土壌サンプルあたりのサブサンプルの2セットを燻蒸するため_の CHCl _3を沸かすために真空を使用しています。
   1. 真空管と真空デシケーターに真空を接続します。真空を起動し、CHCl _3が沸騰し始めると見ます。
   2. CHCl _3を 30秒間沸騰し、空気が戻ってデシケーターに流れることを可能にするためにデシケーターから真空管を切断することができます。このステップでは、土壌試料へのCHCl ₃ガス進入を促進します。二回繰り返します。
   3. それは2分間沸騰することを可能にする、のCHCl ₃最後の第4沸騰を実行します。
   4. デシケーター内で真空が維持されるように真空がまだ実行中で、真空デシケーターにシールを閉じます。真空の電源をオフにして、デシケーターから真空チューブを外します。
8. デシケーターの蓋を置き、真空ストッパーを封止することにより、非燻蒸サンプルを含むデシケーターを密閉します。 P24時間（例えば、キャビネットなど）暗くなった地域にデシケーター（燻蒸および非燻蒸）をひもで締めます。非燻蒸サンプルを含むデシケーターにサブセクション4.7の真空手順を繰り返さないでください。

5.土壌サンプルのインキュベーションのためのコンテナを組み立て

1. 中央にドリル穴でサイズ10ゴム栓を介して長さ15cmのガラス棒を押してください。ロッド径はぴったりの穴を通り抜けるのに十分であるべきです。
2. 燻蒸および非燻蒸サブサンプルの識別に対応する識別情報と0.5 L半透明の広口ポリプロピレン瓶にラベルを付けます。

ヒュームフードの下でデシケーターから6.避難クロロホルム

1. デシケーターに空気の流れを可能にするために、真空デシケーターにストッパーを開きます。デシケーターから蓋を外し、デシケーターからサンプルや湿ったタオルを取ります。
2. 土壌サンプルからのCHCl ₃ガスを排気するために真空を使用してください。
   2. 真空ポンプの電源をオンにし、ポンプは5分間実行することができます。デシケーターに空気の流れを可能にするために、デシケーターから真空チューブを外します。
   3. 繰り返しステップ6.3.2 4回。

7. 10日間のインキュベーションを実施するインキュベーション容器（図1）に各土壌サブサンプルを移動

1. ピペット培養容器に脱イオン水1ml。ゴムバンドを使用して、サイズ10のストッパーから伸びるガラス棒に空のガラスバイアルを接続します。ガラスバイアルの開放端は、ストッパのベースに直面している必要があります。ガラスバイアルは、流体の40ミリリットルまで保持するのに十分な大きさであるべきです。
2. 培養容器に30グラムの土壌のサブサンプルを含むバイアルを置きます。
3. inoculuとして（燻蒸および非燻蒸）、それに対応するサブサンプルのそれぞれにオリジナルの土壌サンプルから非くん蒸土壌1グラムを追加メートル。
4. ピペットストッパー/ガラス棒に接続されたガラスバイアルに2 M NaOHを1ミリリットル。培養容器の上部にストッパー/ガラス棒を押してください。パラフィルムで培養容器の上部をカバーしています。
5. 何の土壌を含まない培養容器を作成します。 3〜5個の無土壌の培養容器を組み立てます。
   注：無土壌コンテナのサンプルを滴定するために使用される酸は、サブセクション9.3に説明されたインキュベーション時間、中のCO ₂鉱化作用の決意に不可欠です。このように、複数の無土壌の容器はすべてのサンプルについて、CO ₂鉱化作用の計算に誤りを作成し、無土壌培養容器の誤った取り扱いや滴定に対する保護手段として作成されます。無土壌容器から試料を滴定するために使用される酸は、値の近くなければなりません。無土壌コンテナサンプル間で高度に異種の酸値が正しくない可能性がサンプル処理または滴定の結果です。
   培養容器を組み立てるためにセクション5の手順に従ってください。
6. 7.1と7.4の手順に従ってください。

25℃で暗くなった記憶領域の全ての培養容器を置きます。 10日間の記憶領域内の全ての培養容器のままにしておきます。

8.インキュベーション期間中に微生物の呼吸によって生成されるCO _2を定量化するために、各サブサンプルに滴定を行います

1. 培養容器から2 M NaOHを含むガラスバイアルを取り外します。
2. ピペット2 M NaOHを含むガラスバイアルに1 MのBaCl ₂を2ml。
3. （C ₂₀ H ₁₄ O _4）ピペットや薬スポイトからのBaCl ₂およびNaOHの混合物を含むガラスバイアルにフェノールフタレインの一滴を追加します。ガラス瓶に磁気攪拌棒を置き、撹拌プレート上ガラスバイアルを置きます。
4. 攪拌プレートが作動すると、ゆっくりと再までビュレット0.1 N塩酸を追加ガラスバイアル中の混合物のd着色が明確になります。
5. ガラスバイアル中の混合物の着色を変更するために必要な塩酸の量を記録します。

まず燻蒸インキュベーションサイクル^16,21,22の間に収集されたデータから微生物バイオマスCを決定

1. ステップ3.8で得られた湿潤重量比：乾燥することにより、その湿潤重量を乗じて、各サブサンプルの土壌の乾燥重量を決定します。
2. 無土壌の培養容器を滴定するために使用される塩酸の平均量を決定します。
3. 式を用いて10日間のインキュベーション中のCO ₂鉱化を計算します。
   
   10日間のインキュベーション中のどこにCO ₂ = CO ₂鉱化
   NS =酸は、無土壌の培養容器内のサンプルを滴定するために使用しました
   S =酸は、培養容器内の土壌を含まれるサンプルを滴定するために使用しました
   M番目の=モル濃度電子塩酸
   E = 6、当量
   培養容器に含まれる土壌のW =乾燥重量
4. 式を用いて微生物バイオマスCを計算します。
   
   ここBIOC =微生物バイオマスC
   燻蒸された土壌のサブサンプルからF = CO ₂鉱化
   非燻蒸した土壌のサブサンプルからNF = CO ₂鉱化
   K =微生物バイオマスCの鉱化の割合は_{、CO 2}に
   1. 土壌または公表値²²と予備試験における¹⁴ Cの鉱化作用の直接測定のいずれかによって、Kの値を決定します。 0.45の値は、一般的に、このアッセイの²³ Kのために使用されます。
5. 最初の燻蒸インキュベーションサイクルで燻蒸された土壌のサブサンプル用のセクション4-8 7回繰り返すことによって、順次燻蒸およびインキュベーションのサイクルを実行します。

10. Determ伊根不安定Cと八燻蒸およびインキュベーションサイクルのコース上でのCO ₂石灰を使用して潜在的なCの回転率

1. 各燻蒸後の試料に加え、土壌接種のための補正係数を決定するには、次の式を使用します。
   
   ICは、接種材料のための補正係数=どこ
   C '= CO ₂の量非燻蒸サブサンプルから最初の10日間のインキュベーション中
   最初の燻蒸インキュベーションサイクルにおける燻蒸土壌への接種土壌のR =重量比
   Cの_T =インキュベーションサイクル（1、2 ... 8）、例えばT = 1 C _T-1 = 0という
2. 各サブサンプル用の各インキュベーションの間に放出されたCO _2を推定するために、次の式を使用します。
   
   Ct = CO _2は、インキュベーション中に放出場所
   NS =酸試料を滴定するために使用しました無土壌培養容器内
   S =酸は、培養容器内の土壌を含まれるサンプルを滴定するために使用しました
   ICは（ステップ10.1において決定された）接種材料のための補正係数=
   E = 6、当量
   培養容器に含まれる土壌のW =乾燥重量
3. 非線形回帰を使用して不安定な有機Cを導出します。
   1. サンプル用の各サンプル識別子に含まれるスプレッドシートを整理し、インキュベーション中に放出され、インキュベーションサイクル数（1、2 ... 8）、およびCO _2は、（ステップ10.2で得られます）。
   2. 非線形回帰することのできるソフトウェアを使用して、データセットに次のようなモデルに適合：
      
      CSUMは8インキュベーションサイクル中に放出されたCO ₂の合計を=場所
      LOC =土壌不安定な有機C
      K =潜在的な回転時間
      T =インキュベーションサイクル（1、2 ... 8）
4. 潜在的な売上高のトンを変換します10日間のインキュベーションサイクルを10によるkの逆数を乗じて日にステップ10.3.2からIME。

結果

米国南東部^24,25,26,27で行われた一連の実験で、この論文に記載されているようにSFIの方法が用いられてきました。一緒に、これらの実験は、テーダマツの松（ アカマツタエダ L.）、スイッチグラス（ キビvirgatum L.）、ハコヤナギ含め、植生タイプのさまざまな包含（ ポプラdeltoidesバートラム元マーシュ。）、及び大豆（ ダイズ L. MERR。）。この方法は、受精の間でLOCおよび/または潜在的なCの離職率の差を決定し、すべての試験で練習トリートメントをトリミングに感受性でした。 LOCとの研究（ 図2）のこのシリーズで報告された潜在的な離職率の範囲内の重複がありました。これらの研究で報告されたLOCの範囲の変動が不安定なCおよび潜在的なCの離職率の違いを検出する際にSFI法の感度を強調表示します。テーダマツの松とスイッチグラスの路地作付システムは、グラムを持っていました植生タイプ間のLOCのreatest範囲;この植生タイプ...

ディスカッション

SFI法は、さまざまな管理方法(施肥、耕うん、植生制御、収穫方法など)および土壌条件にわたる土壌LOCおよび潜在的なC代謝回転率の違いを検出するための効果的なプロトコルです。土壌LOC含有量とC代謝回転率を使用して、栄養循環の変化を理解できます。SFI法は、最初の燻蒸インキュベーションイベントからの微生物バイオマスCの測定も提供します。土壌LOC、C代謝回転、微生物バイオマスCを同時に測定できるため、SFI法は比較的費用対効果の高い分析法となっています。

SFI法で収集されたものとともに追加の土壌パラメータを測定することで、LOCの変化とそれに関連する変数が養分循環に及ぼす影響をより広く理解することができます。土壌の全C濃度は、全^C29に対する土壌LOCプールのサイズの変化を決定する能力を提供します。土壌酵素のアッセイを含めることで、土壌の栄養形態と量の変化につながる不安定なC基質の微生物利用の理解が容易になります。たとえば、デヒドロゲナーゼは有機物の分解において重要な機能を果たし、全体的な微生物の活性の有用な指標です³⁰。ウレアーゼと...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ソイルオーガーサンプリングキット	JMC	PN039	パンチオーガーの他のいくつかのメーカーが利用可能です
パラフィルム	カーウッド	PM999
アルミニウム計量ボート	フィッシャーブランド	08-732-103
汎用乾燥オーブン	フィッシャーサイエンティフィック	15-103-0511	汎用実験室オーブンの他の多くのメーカーが利用可能です
10.5 L真空乾燥器	コーニング	3121-250
ガラスシンチレーションバイアル	ートン	968560
ガラススレッドバイアル、41 ml	フィッシャーブランド	03-339-21N
クロロホルム、アミレンで安定化	シグマ・アルドリッチ	67-66-3
ボイリングチップス	フィッシャーサイエンティフィック	S25201
ガラス棒	フィッシャーブランド	S63449
サイズ10 ラバーストッパー	フィッシャーブランド	14-130P	ゴム製のストッパーは、ガラスロッドを取り付けるために中央に穴を開けて固体として購入することも、ガラスロッドを挿入するための穴付きで購入することもできます
広口PPCOボトル、0.5 L	ThermoScientific	3121050016
水酸化ナトリウム、試薬グレード	Sigma-Aldrich	S5881
塩化バリウム	Sigma-Aldrich	202738
フェノールフタレインインジケーター	Fisher Scientific	S25466
塩酸溶液、0.1 N	フィッシャーサイエンティフィック	SA54-4