方法論記事

での感染の間に流入領域リンパ節へのマウスの皮膚樹状細胞の移動を研究するためにCFSEベースアッセイ

12.3K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/54620

⸱

2016年10月9日

 ,  , 
1Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology (MTC), Karolinska Institutet

この記事について

サマリー

皮膚からドレインリンパ節への細胞移動を追跡するためのマウスでのアッセイが説明されており、これにより、Bacille Calmette-Guérinによるフットパッド感染後にリンパ節に動員された皮膚樹状細胞の特性評価が可能になります。

要約

樹状細胞（DC）は、部分的には流入領域リンパ節（DLN）に抗原を獲得し、シャトル能力を介して、免疫応答を開始するために重要です。 DLNへのDCの動員は複雑であり、完全に感染の間にまだ解明されていません。ここでC57BLでウシ結核菌カルメット-ゲラン（BCG）とフットパッド感染の間にDCの移行を追跡するために、蛍光色素5-および6-カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE）に依存している革新的な、シンプルなアッセイの使用も記載されています/ 6マウス。このアッセイは、積極的にBCGに応じて排水、膝窩LNに移転皮膚DCサブ集団の特性評価を可能にします。このプロトコルは、遊走、皮膚DCは、フローサイトメトリーにより同定したBCGモデルに由来します。アッセイは、DCまたは微生物の接種後の膝窩LNに家庭、それらの代謝物または他の炎症他の細胞の研究および同定に親しみやすいですこれらの細胞の遊走を調節する因子を研究するために、結果として足蹠での刺激、および。

概要

体表面に局在したDCは、微生物またはその製品を感知し、そうすることで排水のLN（DLN）1,2にリンパ管を経由して動員します。この再配置は、DLNと侵入微生物に対する免疫応答の結果としてのプライミングに微生物抗原の輸送のために必要とされます。実際、DLNに感染した組織から移行するDCの封鎖や失敗は、T細胞応答3-5をミュートします。したがって、単一細胞レベルでの移行を追跡するように設計されたアッセイは、与えられたDCサブセットに帰渡り鳥の機能を助けるために有用です。

DLNに対する皮膚DCの動員上のデータの大きな体が存在します。炎症を起こしたか、感染したサイト2からのDC移行に関する知識のほとんどのため、後者のアカウント。皮膚はDCの大規模な人口を収容し、実験用マウスでの実験のための非常に接近可能な表面であるので、これは驚くべきことではありません。いくつかの技術は、このように評価するために開発されていますDLN 2の皮膚からネズミDCの移行。 FITCの皮膚の絵画は、これまでで最も一般的に使用されるアプローチです。このアッセイでは、蛍光色素フルオレセイン-5-イソチオシアネート（FITC）をアセトンと接触刺激との混合物中で調製されます。このカクテルは、脱毛又は剃毛皮膚に適用され、FITC標識細胞の蓄積は次にDLNに分析されます。移行はまた、皮膚に蛍光粒子を内在化している食細胞の追跡を可能にする蛍光色素でタグ付けされたナノまたはマイクロ粒子、で皮膚を注入することによって研究することができます。リンパ管は直接リンパからの移行DCを抽出するためにカニューレを挿入することができます。これは、特にマウスでは、しかし、技術的に困難です。その後の分析のために得られたDCの数も制限要因です。

皮膚DCの移行に関する多くの以前の研究にもかかわらず、DLN次vacciに皮膚DC動員に関する情報の不足が残っていますカルメット-ゲラン（BCG）、 マイコバクテリウム・ボビスの弱毒株による国家は、Mに対してワクチン接種するために使用しました結核 。 BCGは、Tヘルパー細胞1型応答を引き起こす限定感染を引き起こし、皮膚に接種します。 BCG感染皮膚からDLNに動員し、このプロセスの間の移行を調節する因子を十分に理解されていないDCサブ集団の両方。蛍光色素5-及び6-カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE）はDLN 3へのDCの移行を追跡するために、 その場で注入した場合、上記の光では、単純であるが新規な方法を開発しました。 C57BL / 6マウスはBCGの接種材料及び屠殺前日との後足蹠に注入され、動物は、CFSEの高濃度と同じ足蹠に注射します。 24時間後、動物を屠殺し、流入領域膝窩LN（PLN）を除去し、フローサイトメトリーのために調製されます。このアッセイは、IDEを有効にしますDLN（ 図1）にフットパッドの皮膚から一夜移動する細胞のntification。

さらに、遺伝子標的マウスは、DLNに動員するために細胞に必要な因子を特定するために使用することができます。このアッセイを用いて、この報告書の著者は、以前にインターロイキン1受容体と細胞内アダプター分子MyD88を3により規制プロセスにDLNにいるのEpCAM 低 CD11bの高回遊皮膚のDC輸送BCGを発見しました。フローサイトメトリーは、遊走皮膚DCを検出し、分析するために使用されたBollampalli ら 3によって上記レポート由来このCFSEベースの移動アッセイのためのプロトコルは、本明細書中に記載されています。このアッセイの長所と短所が議論されています。

プロトコル

注：C67BL / 6マウスは、この原稿に示す実験に使用しました。これらの動物は、MTCの動物施設、カロリンスカ研究所、ストックホルム、スウェーデンでの特定の病原体を含まない条件下で家でした。動物実験は、農業のスウェーデン委員会、スウェーデン動物保護庁、およびカロリンスカ研究所の指令およびガイドラインに従って行いました。実験はストックホルム北部の動物倫理委員会によって承認されました。

CFSE株式およびストレージの作製

  1. ジメチルスルホキシド中で5-および6-カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE）の5 mMストックを準備します。渦。滅菌に100μlのアリコートを分注し、0.5ミリリットルキャップマイクロチューブをねじ込みます。 -80℃で保存のアリコート。

2.マウス

  1. 生後8〜12週の間の近交系雄または雌のマウスを使用してください。性別と年齢をマッチさせた動物が好ましいです。必要な動物の倫理的な許可がarを確認してください実験開始前の代わりに電子。

イソフルランガス麻酔で動物の3.固定化

  1. イソフルランで麻酔ユニットをロードします。イソフルランで10ml気密性のガラスシリンジを埋めます。気泡を導入することは避けてください。供給チューブと注射器と液体入口を接続し、接続管内の液体が気化器に入ることが目に見えてちょうど約あるまで前方プッシャーを移動します。
    注：使用しないときに注射器でイソフルランを保管しないでください。
  2. 500ミリリットル/分、3.5％でイソフルランの濃度 - 約400で維持気流で、導入室でイソフルランで動物を麻酔。
    注：ユニットは、空気の流れがなくても動作しません。
  3. 動物が眠っているしたら、マスク片にルーティングするために麻酔ユニットにイソフルランガスをストップコックを回します。マスク片がガスの漏れを回避するために無傷であることを確認してください。気流400 ml /分、オルタナに維持することができますtively 200ミリリットル/ minに低下しました。 2.6パーセントにイソフルラン濃度を低下させます。
    注：麻酔効果を増加および/または流量を調整することによって減少させることができます。

4. BCG注射と回復

  1. 視覚的に確認し、そのマウスを確認するために、このようなつま先ピンチ反射テストなどのテストを実行注射を行う前に、イソフルランマスク片に/眠って固定化されます。
  2. 29 Gのx½インチの針を取り付けたシリンジを用いてPBSの30μlに、後肢足蹠にウシ結核菌カルメット-ゲラン（BCG）の1×10 6コロニー形成単位を接種します。
    注：マイコバクテリア株の生成が簡単にこの手順3の元の説明に記載されており、実質的な詳細に他の場所6。 BCGはまた、商業的供給源から容易に入手可能です。著者は、そのinoculati前に塊を破壊するために注射器を介して、BCGは、パルス超音波処理または合格することをお勧めしますマウスに上。 BCGは、このプロトコル3の元の説明で、その雇用与えられた微生物の刺激として、ここで改めて強調したが、著者は確かに他の微生物の刺激の試験を奨励されています。
  3. コントロールマウスにPBSを注射のための上記と同じ手順を実行します。
  4. 麻酔からの回復が成功し、動物が注射し、後肢足蹠に自分自身をサポートできることをことを確認するために、注射後、動物を監視します。

5. CFSE注射

  1. 注射のためのCFSEの調製：
    1. -80℃から5 mMのCFSEストック溶液のバイアルを解凍します。 PBSでCFSE 10倍に希釈します。注射の準備のために注射器を充填する前に、溶液を十分に再懸濁します。
  2. CFSEインジェクションおよびリカバリ：
    1. 以前にBCGまたはPBSを受けた後肢足蹠に断面で0.5 mMのCFSEの3ジェクト20μLを、動物を麻酔するための手順を繰り返します。
      注：CFSEの注入は前日（24時間）の犠牲の計画日付を実行する必要があります。

膝窩リンパ節（PLN）の6.外科的除去

注：滅菌手術器具の使用、70％エタノールでその繰り返しの除染は、このステップ全体で奨励されています。

  1. マウスを安楽死させます。 70％エタノールで動物をスプレー。解剖ボード上、仰臥位で動物をピン。
    注：著者は頸椎脱臼を介して安楽死をお勧めすることができます。
  2. 慎重後肢大腿部の縦切開を行います。膝のくぼみに、脂肪ポーチに深い位置PLNを露出させ、結果的に切除するハサミやピンセットを使用してクリア筋肉と脂肪。
  3. 氷の上に、0.5ミリリットル滅菌PBSにPLNを転送します。

PLNからの単一細胞懸濁液の7世代

  1. 70ミクロンの細胞ストレーナーPLACを通じてPLNを均質化ED含む6ウェルプレート中に5 mlのPBSまたは蛍光活性化セルソーティング（FACS）緩衝液（PBSは含有し、2％ウシ胎児血清（FCS）、5mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、及び1mMのアジ化ナトリウム）。 3ミリリットルの注射器のバックエンドを使用して、ストレーナーを通して均質化します。
    注：アジ化ナトリウムは毒性があり、注意して取り扱ってください。
  2. PBSまたはFACS緩衝液の別の5mlでストレーナーを洗浄し、15mlチューブ内の材料を収集し、5分間277×gで（= 172ミリメートル1,200rpmで、R）で細胞をペレット化し、4°C。また、ポリプロピレンホモジナイザーを使用して、マイクロ遠心チューブに直接あるpInsを均質化します。
  3. 千μlの-ペレットサイズに基づいて、 例えば 、200、PBSまたはFACS緩衝液の適切な量でPLN懸濁液を再懸濁します。各LN懸濁液から得られた総細胞数を定量化するために計数チャンバーを使用します。死んだ/死細胞を除外するためにトリパンブルーを使用してください。

8.細胞染色およびフローサイトメトリー

  1. Trのansfer 1から10×10 6個の細胞から5ミリリットル丸底ポリスチレンチューブ。 FACS緩衝液で洗浄し、5分間、277×gで（= 172ミリメートル1,200rpmで、R）での遠心分離によってペレット、4°C。
  2. 非特異的Fc媒介をブロックするために、抗マウスCD16 / CD32（1μgの- （表面染色、 材料表に使用する樹状細胞[DC]は、マーカーを参照）0.5を含む抗体カクテル100μlの-上清を捨て、50でペレットを再懸濁氷上で45分、 - 30についてのFACS緩衝液中での相互作用）。光からサンプルを保護します。
  3. インキュベーション後、5分、4°Cのために277×gで（1,200rpmで、R = 172 mm）での遠心分離によって、FACS緩衝液及びペレットで細胞を洗浄します。
  4. FACS緩衝液100μl - 50で細胞を再懸濁します。 7-10フローサイトメーターのデータを取得。
    注：フローサイトメトリーに優れたレビューのために我々は、この方法での理論と実践の両方の情報を中継以下の資料を読者に参照してください。

結果

CFSEベースの移動アッセイ（ 図1）は 、足蹠におけるPLN BCG感染後に表示されるCFSE標識細胞を検出し、特徴づけるために、フローサイトメトリーと一緒に使用されました。 PLNにおけるCFSE標識の大部分は、皮膚DLN 11に移行した皮膚のDCと一貫性のMHC-II 高およびCD11c + / low細胞（ 図2A）、に記載されています。周波数とCFSE標識、MHC-II 高のCD11c + / low細胞は、BCGは、これらの再配置を強化することを示唆し、PBSを注射した対照（ 図2B-C）と比較して、BCG感染マウスからあるpInsに増加しているの合計数の両方DLNへの細胞。 24時間の期間中に、このアッセイは、移行するので、その皮膚のDCがまだ感染5日（ 図2C）の後にDLNを入力している確立することが可能でした。これは、よく初期activatiためのタイムラインを超えて、現在のモデルでは、DCの遊走を拡張しますPLN 3における抗原特異的CD4 + T細胞上で。また、渡り鳥の皮膚DCは、共刺激分子CD80およびCD86（ 図2D）の上昇したレベルを発現します。これは、皮膚の外植片培養およびFITCの皮膚、11を塗る渡り鳥DCが活性化した細胞であること概念をサポートするから以前の観察と一致しています。重要なことは、両方のLN-常駐したDC（MHC-II +のCD11c high細胞）と形質のDC（MHC-II 低 CD11cの低い PDCA-1 +細胞）を、高内皮細静脈を介して炎症を起こしたのLNを入力しないで輸入リンパ管12、負のためCFSE（ 図2EF）は 、確かに示唆CFSE標識がフットパッドを中心に発生したこと。

追加の表面マーカーCD103、EpCAMの（C、13 MHC-II 高のCD11c + / low細胞が1にない表現することを考えるが、複数のDCサブ集団D326）とのCD11bをさらに遊走したDC（ 図3）の集団を特徴づけるために、フローサイトメトリー検出（ 材料表 ）に使用される抗体染色のパネルに含まれていました。そうすることで、EpCAMのローのCD11b high細胞の亜集団は、BCG感染に応答して主遊走皮膚DCサブセット（ 図3）と同定しました。

ここに示したフローサイトメトリーデータは4レーザ（488、532、640および405 nm）を装備フローサイトメーター上で取得しました。データは、細胞分析ソフトウェアを用いて解析しました。 材料表に指定以外のマルチカラーフローサイトメーターは、そのことについては、他の細胞型に、上記の研究に記載されたマーカーを正常に検出、または他のマーカーの検出のために使用することができます。本明細書に記載されたプロトコルのために、6つの異なる蛍光色素を検出することが可能なサイトメーターはneceありますssary。重要なのは、使用される各抗体のためのクローンは（ 材料表 ）に指定されています。蛍光色素結合体の選択は、これが利用可能なフローサイトメーターのレーザーおよび検出チャネルに依存することができるように考慮する必要があります。同様に、抗体染色のために最も適切な希釈を決定するために滴定される必要があります。

人口BCG-の周波数およびPBSを注射したサンプルは、DCの定義され、ゲートされたサブセットの絶対数を計算するために、全細胞数と一緒にグラフ化し、使用しました。データグループの平均の差の有意性は、p <0.05のカットオフで、スチューデント検定またはANOVA適切で分析しました。外れ値は、外れ値グラブスのテスト以下の分析から除外しました。

figure-results-1
図1.概要：BCGフットパッド感染モデルとCFSEベースの移行アッセイ。BCGは、C57BL / 6マウスの後肢足蹠に接種されます。異なる時間感染後点、および屠殺前の24時間後に、蛍光色素CFSEは、以前にBCGを受けた同じ足蹠に注入されます。排水、膝窩リンパ節を、フローサイトメトリーによって特徴づけられる細胞を単離し、CFSE標識されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-2
図2. 移動性皮膚DCは、BCGフットパッド感染後DLNに再配置する主な集団である。C57BL / 6マウスを、足蹠におけるBCGの1×10 6 CFUを感染させました。 24時間屠殺前に、動物は、同じ足蹠に0.5mMのCFSEを注射しました。膝窩LNをは、収穫ホモジナイズしました単一細胞懸濁液にし、フローサイトメトリーに供しました。 BCGの1日後に行われた測定のために、CFSEはBCG後2時間注入しました。 （AとB）PLN感染3日後にBCG-排水にMHCII 高およびCD11c + / low細胞にCFSEの優勢な発現を示すゼブラプロットを。 BCG-からPLNにおけるCFSE標識MHCII 高のCD11c + / low細胞とPBSを注射したマウスの（C）周波数及び総数は、異なる時点でグラフ化しました。 CD80およびCD86のための（D）の平均蛍光強度（MFI）は3日目のBCG感染後PLNにCFSE +とCFSE 陰性 MHC-II 高のCD11c + /低皮膚DC上で決定しました。 （E）皮膚のDC内のCFSE式（MHC-II 高のCD11c + /低 ）、LN-常駐したDC（MHC-II + CD11cの高い ）及び（F）形質のDC（MHC-II 低 CD11cの低い PDCA-1 +）3日BCG後にフローサイトメトリーによって決定しました。各実験について、少なくとも5匹のマウスを、PBS注射コントロールのBCG感染群および3に使用しました。バーは平均の標準誤差を示しています。各サブセット内のCFSE標識細胞の総数はBollampalli らに与えられている、PLoSのPathog 2015、11：e1005206 3。 * BCG感染し、PBS対照との間の統計的有意差を示します。 2つの独立した実験の一つを示します。 Bollampalliから適応図ら 、PLoSのPathog 2015、11：。。。e1005206 3、出版社の許可を得て、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-3
図3のEpCAM 低 CD11bの高い DCはメインスキンDCサブセット入稿されていますBCGフットパッド感染。C57BL / 6マウスは、 図2のようにBCGとCFSEを注射した後DLNにる。ゲーティングを採用戦略（上のパネル）および各内のCFSE +細胞の頻度を示す（A）ゼブラプロット、異なるでサブセットを定義しましたBCG感染（下のパネル）後の時点。各サブセット内の周波数は、感染後の時点に依存して変化し得ます。 BCGの1の3日後にすべてのLN細胞の間で約0.2％のMHC-II 高のCD11c + / low細胞を見つけることを期待することができます。これらのうち、約6％がCD103 +細胞です。 MHC-II 高 CD103 負のゲート内で見つかったサブセットの場合、1は、約42％のCD11b 高のEpCAM 低細胞、27％のCD11b 低 EpCAMの低い細胞と7％のLCを見つけることができます。 （B）BCG感染後の異なる時点におけるCFSE +細胞のそれぞれ内では、定義されたサブセットの合計数が示されています。各experimeのため塩基、少なくとも5匹のマウスはBCG感染群とPBSコントロールの3に使用しました。バーは平均の標準誤差を示しています。 * PBSを注射した対照と比較して統計的に有意な差を示します。 3つの独立した実験の一つを示します。図の再印刷Bollampalli らから、PLoSのPathog 2015、11：e1005206 3、出版社の許可を得て、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

noDCsは、微生物抗原を取得し、リンパ管を経由してDLNに移行することにより、体表面での微生物の課題に対応できる専門的な抗原提示細胞です。そこに、DCは、一次T細胞応答を駆動するようにしてT細胞にこの抗原を提示します。組織からDLNへのDC移行のプロセスは、したがって、生産性のT細胞応答が開始される方法を理解するために非常に重要です。 DCの遊走を測定するための方法は、結果として、上記の展開に非常に有用です。

マウスモデルは、BCG、皮膚に臨床的に注入される生ワクチンによる感染後のDLNに皮膚DCの遊走を研究するために使用されました。ラインでは、BCGワクチン接種のこの皮膚経路を模倣するために後肢足蹠に注入されます。単純なアッセイを開発し、その結果、排水PLNへの足蹠皮膚におけるBCGの接種部位から皮膚DCサブ集団の移行を調査するために、このモデルに組み込まれました。このプロトコルRELI以前にBCGを受けた同一の足蹠に蛍光色素CFSEを注入した後、フローサイトメトリーによりCFSE標識細胞の存在を分析するために、後に排出PLN 24時間の単離にエス。プロトコールに記載されていないが、この設定からLNSはまた、LN 3における遊走細胞の位置決めとしてマイグレーション・プロセスを研究するために、共焦点顕微鏡による分析のために調製することができます。また、BCG-トリガー皮膚DC遊走に対する同様の結果は、BCGパスツール1173P2 3とBCG SSI 1331年14両方を使用して得られています。

CFSEは、一般的に、インビトロで細胞を標識するために、セル転送15の後に、インビボでのそのような標識された細胞を追跡するために使用されます。しかし現在のプロトコルでは、直接インサイチュで皮膚細胞を標識するために使用しました。 CFSE標識の分子基盤はまた、アミン反応性蛍光色素であるFITCに似ています。 CFSEは、しかし、それCREとしての結合のために、FITCよりも好ましいですATE非常に安定カルボキサミド債16。また、CFSEは非常に膜透過性であり、受動的に細胞内に拡散します。いったん内部には、細胞内のアミン（蛍光）標識されたセル15内に保持された抱合体を形成します。

筆者らが開発したCFSEベースの移動アッセイは、BCGに応答して、24時間の期間内に皮膚からDLNに移転細胞の同定を可能にします。したがって、定義された期間中に急性遊走を測定し、1つは、異なる能力を調査することができ、移行をトリガするために刺激を注入しました。このアッセイは、接触感作剤の皮膚、局所適用によってトリガー累積移行イベントを測定FITC皮膚絵画の古典的な手法とは異なります。したがって、CFSEに基づく遊走アッセイは、微生物、微生物産物又はFで他の炎症性刺激の注射後のPLNにホーム遊走皮膚DCまたは他の細胞を同定するために使用することができますootpad。実際、好中球およびγの両方：δT細胞は、BCG 17,18に対応して皮膚からDLNに移転することが示されています。実際には、アッセイは、最近、腸局在線虫感染はDLN 14にBCG-トリガ皮膚DCの遊走をミュートできたことを示すために同時感染の設定に使用しました。

FITC標識DCは19を塗装した後4〜5日を検出することが困難であるため、DCの移行は、多くの場合、FITC皮膚の絵に24〜72時間の間で評価されます。移動の分析は24時間に制限されたため、ラベルされたDC上のCFSE信号の損失は、ここで提示アッセイでは問題ありません。この背後にある理由は、著者が特に「一晩」移行イベントを勉強したいと思ったことです。この検定に興味を持って他の人は、しかし、CFSEベースの追跡のために、以前の、あるいは後の時点を調査することが推奨されます。 CFSEは、注射によって導入されるので、それは、任意の定義された時間に与えることができます。この柔軟性は、Aを許可しましたBCG感染（ 図2C）3日後に5と6の間のDCの移行を評価するuthors。 CFSEを注入することは、潜在的に標識反応にその場でアクセス可能な細胞タイプを制限することができます。皮膚の最上層に存在する樹状細胞であるインスタンスランゲルハンス細胞（LCS）、のために、表皮は、CFSEベースの移行アッセイにおけるBCGに対する応答（ 図3）3で不完全に移行します。しかし、FITC皮膚塗装の際に、真皮内に配置されたDCは、表皮の下の層は、容易にラベル付けされており、より高速のLC 20,21よりもDLNに移行します。これは、細胞が、必ずしも標識溶液が適用される皮膚の層に局在化することなく、蛍光標識になることを示唆しています。

BCG感染のモデルとして、マウスの耳には、より多くの結核ワクチンとしてBCGの臨床管理に沿ったものである接種の善意の皮内経路を提供します。フォー一方、otpad注入は、おそらく皮内および皮下経路の組み合わせです。つまり、臨床現場では、常に本当に皮与えられるのではなく皮下または両方の組み合わせではないかもしれので、それは、正確かつ再現性真皮22にBCGを提供するためにスキルと訓練を必要とする、と述べました。接種部位としてはフットパッドは言及に値する耳の上に2つの非常に明確な利点を持っています。まず、免疫応答は、足蹠注射後の排水PLNまで濃縮し、これは、応答の検査を容易にされています。この報告書の著者は、PLNは、フットパッド3を排出する第一及び主LNであることが判明しました。その他は、エバンスブルー23の注入後の膝窩と腸骨下部のLNを間分割排水を示唆しています。それにもかかわらず、耳に関してで、そこにマウスで複数の耳DLNであり、これらは、定期的に存在するか、または24を見つけることは容易ではないかもしれません。後者は明らかにliabを紹介しますDLNにおける応答を調査するために求めている研究でility。耳に比べて - （50μlの10）第二に、より大きなボリュームは足蹠に接種することができます。これにより、リンパの流れの主要な変更を導入すると、それ自体が、それはマイコバクテリアを大量に接種することになる問題である非常に小さな注入量、で動作することの責任を最小限に抑えることの両方。注入量が小さい（1-10μl）をしなければならない耳でも5μlをリンパの流れを変えることができ、潜在的に制御されていない方法で直接DLNに注入材料を大量に強制します。注入量を考慮することが重要です。これは、LNに細菌を運んで細胞の寄与に取り組む実験では特に重要です。 BCGの足蹠モデルでは、いくつかのBCGは、細胞輸送の非存在下でDLNに達していてもよいです。これは、1つは、まだ足の細胞遊走マウスのDLNにBCGを検出することができるという観察に基づいていますパッドは完全に百日咳毒素3の局所注射によって切除されました。これはBCGが直接リンパ管にアクセスして、真の無細胞の方法でDLNに達することができるという指示があるかどうか、それを排除することはできませんので、まだ決定されていないその注入量の力によってリンパ管へのアクセス権を与えられ、この場合のマイコバクテリア。

耳または足蹠での免疫化のための実用的な考慮事項は、動物が十分に正確かつ再現可能な方法で実施される注射のために固定化されなければならないことです。イソフルランガスは、足蹠注射の準備のために動物を抑制するための方法として、現在のプロトコルに記載されています。イソフルラン媒介麻酔のための比較的迅速な誘導と回復時間は、一般的な方法にするが、他の麻酔薬と同様に、それは実験結果25に干渉する可能性が生理学に影響します。確かに、揮発性および注射用の両方の麻酔薬は、廃止によってリンパの流れを減少させます自発的な筋肉の動き、筋肉の緊張を軽減し、lymphangion収縮26を減少させます。さらに、養子足蹠に転送DCのDLNへの移行中に5倍の減少が27麻酔した動物で報告されています。上記を考慮すると、麻酔前に取り扱い手順ので、管理が両方迅速であり、回収工程を必要とせず、注射自体、より動物に多くのストレスを引き起こす可能性があり、可能性は十分に麻酔なしで動物を拘束するべき考慮されます。動物は急速に30〜40秒以内にフットパッドに固定化された位置に持ってきて接種することができる足蹠注射のためにカスタマイズされたマウスレストレーナーは、プロセスにその生理​​機能の他の側面を変更することなく、後肢足蹠でマウスを注入するのに理想的です、およびリンパ管を介して細胞移動に対処する研究において非常に有用であろう。

結論として、この報告書定義された24時間のウィンドウの間の移行をモニターするアッセイを使用してDLNへの動員中に皮膚のDCを追跡するための新規のプロトコルを強調しています。このCFSEベースの遊走アッセイは、共焦点顕微鏡3により、ここで詳述されるように、フローサイトメトリーによって遊走細胞の検出および分析を可能にするだけでなく、。これは、注入された種々の刺激及びDCの遊走を誘発する能力を研究するための柔軟なプラットフォームを提供し、重要なことに、DCだけでなく、種々の実験の設定時DLNに皮膚から移動する他の集団ではないだけを追跡するために使用することができます。

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この作業は、カロリンスカ研究所、スウェーデン研究評議会VR(Dnr 2014-2794)からのプロジェクト助成金、およびカロリンスカ研究所からのKID博士助成金(すべてA.G.R)によって支援されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に関与していませんでした。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
イソフルランバクスター1001936060
5-および6-カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル
(CFSE)		InvitrogenC1157
ジメチルスルホキシド(DMSO)SigmaD2650
シ胎児血清(FBS)SigmaF7524
Bacille Calmette-Gué凛(BCG)株パスツール、社内
トリパンブルー溶液ΣT8154
EDTA社内
アジ化ナトリウムΣΣS2002
PBS社内
ろ過水
社内 BD Plastipak 3 mlシリンジBD医療外科システム309658代替品:5mlシリンジ 
6ウェルプレートTPP92006
15 ml 遠心分離チューブTPP91015ポリプロピレン
5 ml 丸底チューブBD ファルコン3272948ポリスチレン
ユニベントール 400 麻酔ユニットユニベントール8323001
モノジェット 3/10 ml シリンジメディキャリア888151114429 G x 1/2 インチ。
滅菌フィルターユニットTPP99500PESメンブレン 
EPPI-PistillホモジナイザーSchuettバイオテクノロジー3.200 512ポリプロピレン
レグラX-30R遠心分離機ベックマンコールターB01145
Bürker計数室VWR631-0920
0.5 ml スクリューキャップマイクロチューブ Sarstedt72.730ポリプロピレン
1.5 ml エッペンドルフ微量遠心チューブVWR700-5239ポリプロピレン
70 ミクロンセルストレーナーVWR734-0003
BD LSR-II フローサイトメーター、FACSDiva ソフトウェアで操作BD Biosciences販売終了。その他のフローサイトメーターも利用可能で、必要な蛍光色素6種を最小で検出
FlowJo細胞解析ソフトウェアTree Star
抗体<strong>CloneCompany 
MHC-II I-A/I-E M5/114.15.2BD Biosciences
CD11bM1/70BD Biosciences
CD11cHL3BD Biosciences
CD16/CD32 (Fc-block)2.4G2BD Biosciences
CD326/EpCAMG8.8Biolegend
CD1032E7Biolegend
CD8016-10A1バイオレジェンド
CD86GL-1バイオレジェンド
ウア可能

参考文献

  1. Platt, A. M., Randolph, G. J. Dendritic cell migration through the lymphatic vasculature to lymph nodes. Adv Immunol. 120, 51-68 (2013).
  2. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
  3. Bollampalli, V. P., et al. BCG Skin Infection Triggers IL-1R-MyD88-Dependent Migration of EpCAMlow CD11bhigh Skin Dendritic cells to Draining Lymph Node During CD4+ T-Cell Priming. PLoS Pathog. 11, e1005206(2015).
  4. Allan, R. S., et al. Migratory dendritic cells transfer antigen to a lymph node-resident dendritic cell population for efficient CTL priming. Immunity. 25, 153-162 (2006).
  5. Itano, A. A., et al. Distinct dendritic cell populations sequentially present antigen to CD4 T cells and stimulate different aspects of cell-mediated immunity. Immunity. 19, 47-57 (2003).
  6. Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Jr Laboratory maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit 10A 11(2007).
  7. Tung, J. W., et al. Modern flow cytometry: a practical approach. Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).
  8. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).
  9. Sharrow, S. O. Overview of flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.1(2002).
  10. Holmes, K., Lantz, L. M., Fowlkes, B. J., Schmid, I., Giorgi, J. V. Preparation of cells and reagents for flow cytometry. Curr Protoc Immunol. Chapter 5, Unit 5.3(2001).
  11. Henri, S., et al. The dendritic cell populations of mouse lymph nodes. J Immunol. 167, 741-748 (2001).
  12. Diacovo, T. G., Blasius, A. L., Mak, T. W., Cella, M., Colonna, M. Adhesive mechanisms governing interferon-producing cell recruitment into lymph nodes. J Exp Med. 202, 687-696 (2005).
  13. Henri, S., et al. Disentangling the complexity of the skin dendritic cell network. Immunol Cell Biol. 88, 366-375 (2010).
  14. Obieglo, K., et al. Chronic Gastrointestinal Nematode Infection Mutes Immune Responses to Mycobacterial Infection Distal to the Gut. J Immunol. 196 (5), (2016).
  15. Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Curr Protoc Immunol. Chapter 4, Unit4.9(2009).
  16. Banks, P. R., Paquette, D. M. Comparison of three common amine reactive fluorescent probes used for conjugation to biomolecules by capillary zone electrophoresis. Bioconjug Chem. 6, 447-458 (1995).
  17. Nakamizo, S., et al. Dermal Vgamma4(+) gammadelta T cells possess a migratory potency to the draining lymph nodes and modulate CD8(+) T-cell activity through TNF-alpha production. J Invest Dermatol. 135, 1007-1015 (2015).
  18. Abadie, V., et al. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 106, 1843-1850 (2005).
  19. Thomas, W. R., Edwards, A. J., Watkins, M. C., Asherson, G. L. Distribution of immunogenic cells after painting with the contact sensitizers fluorescein isothiocyanate and oxazolone. Different sensitizers form immunogenic complexes with different cell populations. Immunology. 39, 21-27 (1980).
  20. Shklovskaya, E., Roediger, B., Fazekasde St Groth, B. Epidermal and dermal dendritic cells display differential activation and migratory behavior while sharing the ability to stimulate CD4+ T cell proliferation in vivo. J Immunol. 181, 418-430 (2008).
  21. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22, 643-654 (2005).
  22. Kim, Y. C., Jarrahian, C., Zehrung, D., Mitragotri, S., Prausnitz, M. R. Delivery systems for intradermal vaccination. Curr Top Microbiol Immunol. 351, 77-112 (2012).
  23. Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. Lymph node mapping in the mouse. J Immunol Methods. 332, 170-174 (2008).
  24. Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).
  25. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53, E55-E69 (2012).
  26. Schmid-Schonbein, G. W. Microlymphatics and lymph flow. Physiol Rev. 70, 987-1028 (1990).
  27. Tal, O., et al. DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling. J Exp Med. 208, 2141-2153 (2011).

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

CFSEBCG

関連記事