のジェノタイピング<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;によってリボソームスペーサーPCR（RS-PCR）

サマリー

ここでは、リボソームスペーサーPCR(RS-PCR)を小型電気泳動システムとともに使用し、黄色ブドウ球菌を適度なコストでジェノタイピングするための高速かつ高分解能の方法として、高いスループットを可能にします。

要約

リボソームスペーサーPCR (RS-PCR) は、黄色ブドウ球菌の高分解能で堅牢なジェノタイピング法であり、中程度のコストで高いスループットを可能にするため、日常的な目的に使用するのに適しています。最高の分解能、データ評価、およびデータ管理のためには、小型化された電気泳動システムが必要です。このような電気泳動システムと自社開発のソフトウェア(こちらから無料で入手可能)を組み合わせることで、遺伝子型へのバンドパターンの割り当てが標準化され、簡単に進むことができます。DNA抽出は簡単で(煮沸調製)、反応のセットアップは簡単で、標準的なPCRマシンで実行できます。PCRサイクルは、長時間のランピングと伸び時間を除いて一般的です。スパタイピングやマルチローカスシーケンスタイピング(MLST)と比較して、RS-PCRはDNAシーケンシングを必要としないため、解析が大幅に簡素化され、高いスループットが可能になります。さらに、黄色ブドウ球菌のウシ株の分解能は、少なくともスパタイピングと同等であり、MLSTまたはパルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)よりも優れています。RS-PCRデータベースには、現在、合計141の遺伝子型と変異体が含まれています。この方法は、ウシ乳房炎に関与する黄色ブドウ球菌株の病原性遺伝子パターン、伝染性、および病原性と非常に関連しています。黄色ブドウ球菌遺伝子型B(GTB)は伝染性であり、群れの問題を引き起こし、スイスや他のヨーロッパ諸国で多額の費用がかかります。スイスで観察される他のすべての遺伝子型は、個々の牛や宿舎に感染します。RS-PCRによるジェノタイピングは、臨床獣医学の2つの重要な要素であるウシの乳房内感染(IMI)に関与する黄色ブドウ球菌の疫学的および病原性の可能性を確実に予測することができます。これらの有益な特性と適度なコスト、高いサンプルスループットにより、この出版物の目標は、他の研究室で黄色ブドウ球菌のジェノタイピングのためのRS-PCRを簡単に確立し、実行するための詳細なステップバイステップのプロトコルを提供することです。

概要

ブドウ （ 黄色ブドウ球菌）は、牛¹における乳房内感染（IMI）のための世界的な責任を最も重要な病原体として知られています。欧州12カ国というの牛でCosandey ら ³及びボスら ⁴によりフルニエら ²スイス牛で実証・研究による研究S.ウシIMIから分離された黄色ブドウ球菌は、遺伝的に不均一な群です。 16S-23S rRNAの遺伝子間スペーサー領域のPCR増幅（RS-PCR）により、17遺伝子型の合計は、最初に101疫学的に独立した単離物²で検出されました。他の15の遺伝子型（GTS）は、各すべての分離株の1〜4％を作り、まれに発生していないのに対し、遺伝子型Bと遺伝子型C（GTC）は、（80％）が最も一般的でした。欧州レベル³では、GTBは、GTCは、GTF、GTI、およびGTRは、すべての分析株（N = 456）の76％を含む、最も重要な遺伝子型でした。 GTBは、ワット中央ヨーロッパに位置していましたhereas他の遺伝子型は、広く普及しました。株の残りの24％は41の遺伝子型が含まれ、それらの多くは、しかし、一度のみ観察されました。

フルニエ者らの研究ら ^2、Cosandey ら ^3、及びグラバーら ^5は、さらに^、遺伝子型が非常に欧州レベルでのように、スイスで、ならびに、それらの病原性遺伝子のパターンと関連していたことを実証しました。研究はさらにS.間のIMIの有病率の大幅な違いを明らかにしました球菌 GTB、GTCおよび他の遺伝子型^2,5：GTB考慮して、群れでの牛の87％までは、この遺伝子型に感染していました。 GTCのと他の遺伝子型の場合には、しかし、IMIは唯一の群れの1〜2頭の牛に認められました。

IMI S.によって引き起こされます黄色ブドウ球菌は 、通常、対応する乳腺の炎症および乳中の炎症細胞の増加をもたらします。その結果、体細胞の共同乳中のunts（SCC）、ほとんどの国で乳質の重要な指標は、減少した牛乳の価格、あるいは配信停止につながる増加されます。

フルニエら ²のRS-PCRに加えて、他のタイプの方法は、Sのウシ株サブタイプについて記載されています球菌 ^8-11。 2つの一般的なものは、 スパタイピング ¹²と多座配列タイピング^{（MLST）13が}含まれます。後者の1が7ハウスキーピング遺伝子の塩基配列決定を必要とするのに対し、前者は、プロテインAのブドウ球菌スパコードする遺伝子の可変スペーサー領域の配列を決定するDNAに基づいています。これは、1つの¹²および7のPCR ^13は 、それぞれ、特定の装置を使用してアンプリコンの精製、配列決定反応及び分析を行い、実行する必要があることを意味します。 RS-PCRと比較すると、これらの方法は、低いサンプルスループットと高いコストが生じ、実験室にかなりの付加的な努力を必要とします。ザスループットは、PFGEのために特に低いです。 S.のウシの株について、これらの方法の解像度を考慮すると黄色ブドウ球菌 、RS-PCRは、少なくともMLST ⁴またはPFGE ¹⁵より^4、より良いと入力し、スパと同じくらい良いです。

バイナリタイピング¹³を含むすべてのこれらの方法は、Sによって引き起こされるウシIMIの病因にさらなる洞察を得ることにその有効性を実証しました黄色ブドウ球菌 、しかし理由述べた制限の彼らは、大規模な臨床研究にはあまり適しています。また、RS-PCRによる遺伝子型決定フルニエらによって記載されているように^2は 、疫学的及びS.の病原性の可能性のある信頼性の高い予測を可能にしますウシIMIに関与球菌 、臨床獣医学における2のキー値。

プロトコル

1. 黄色ブドウ球菌分離株

1. S.10μlのスプレッド黄色ブドウ球菌株培養または1つのコロニーを5％ヒツジ血液（BA）を含むコロンビア寒天プレート上で選択培地上で増殖させました。
2. 24時間〜18時間、37℃で好気的に培養します。

2. DNA抽出

1. 10 mMトリス-塩酸および10mMのNa ₂ EDTA、pHが8.5を含むTELバッファを準備します。 15分間、121℃でアリコートし、オートクレーブを準備します。
2. 100μlのTELに滅菌プラスチックループまたは滅菌木製の歯のピックと再懸濁を使用して、BAから1コロニーを収集します。スクリューキャップで1.5ミリリットルチューブを使用してください。
3. 10分間95℃でインキュベートします。その後、濡れた氷の上にすぐにサンプルを置きます。
4. PCR（PCR用=鋳型DNA）に適したH ₂ Oで100：サンプル1を希釈します。非希釈し、希釈した試料を1ヶ月間-20℃で保存することができます。

3. RS-PCR

PCRチューブに1.5μlのH ₂ O、12.5のTaqマスターミックス、2μlのG1プライマーμlの10μM、2μlのL1プライマー、10μM、および純粋の約30 ngのに対応するテンプレートDNAの7μlのDNA ^2。
1. 標準的なPCRサイクラーで以下のサイクリングプログラムを実行します。7分間55℃で2分間ランプアニールに続いて1分間94°Cを含有する27サイクル、続いて15分95°C、。さらに2分勾配後、2分間72℃で延びています。 4℃に冷却し、続いて72℃で10分間の最終伸長によってPCRを終了します。
   注：PCR産物は、5日間20℃で保存することができます。
2. RS-PCRの各実行のために知られて遺伝子型（通常はGTB）とポジティブコントロール、 すなわち、サンプル、およびネガティブコントロール（H ₂ O）が含まれます。

4.電気泳動

1. 一緒にDNAのための市販の小型化電気泳動キット（MEDキット）を使用しますPCおよびインストールされたソフトウェアに接続されているバイオアナライザと。慎重に、メーカーの対応マニュアルを研究しています。
2. チッププライミングステーションを設定し、製造業者の説明書に従ってシリンジクリップを調整します。
3. 製造業者の説明書に従ってゲル - 色素ミックスを調製します。
4. （製造業者の説明書に従って）ゲル - 色素ミックスをロードします。
   1. 使用前に30分間RTにゲル染料ミックスを平衡化します。
   2. チッププライミングステーション上の新たなDNAチップを置きます。よくマークされG.中のゲル - 色素のピペット9μlの
   3. プランジャが1ミリリットルに配置されていることを確認した後、チッププライミングステーションを閉じます。それは、シリンジクリップで固定されるまで押しプランジャ。 30秒後、シリンジクリップを解放するために正確に待ちます。
   4. 5秒間待ってください。ゆっくりと1ミリリットルの位置にプランジャーを引き戻します。
   5. 両方のウェル中のゲル色素のオープンチッププライミングステーションとピペット9μlを「G」をマークしました。
5. Mのロードarker
   1. 全12サンプルウェル中、よくはしご中のマーカーのピペットを5μl。空のこれらの13のウェルのいずれかのままにしないでください。
6. ラダーとサンプルをロードします。
   1. ラダー記号をよくマークさにDNAラダーのピペット1μlの。
   2. サンプルのピペット1μlの（使用のウェル）または脱イオン水（未使用井戸）の1μlの。
   3. 2400 rpmで1分間アダプタと渦に水平にチップを置きます。
   4. 5分以内にバイオアナライザーでチップを実行します。
7. 分析の実行
   1. バイオアナライザーと接続されたコンピュータを起動します。ソフトウェアを開きます。
   2. バイオアナライザのふたを開け、（チップは一方向にしかフィット）チップホルダーにチップを置きます。慎重に蓋を閉じます。
   3. ソフトウェアのインストゥルメントの文脈では、「電気泳動">"のdsDNA ">" DNA 7500 "を選択します。ソフトウェアの現在のファイルの接頭辞を受け入れるか、またはそれを変更します。
   4. ソフトウェアに存在するスタートボタンをクリックします。ソフトウェアでサンプル名を入力します。チップの実行が終了すると（後に約30分） を実行し 、メッセージの終了は、バイオアナライザーソフトウェアに表示されます。
   5. 製造業者の指示に従ってチップを取り外し、バイオアナライザーの電極を清掃してください。

5.電気泳動プロファイルから遺伝子型の推定

1. （ソフトウェアは作者から自由に利用可能です）・マハルのソフトウェアをロードします。
2. マハルソフトにインポートする参照データ：「ファイル」>「インポート参考データ」
3. バイオアナライザソフトウェアのデータコンテキストで実行電気泳動を開きます。 1サンプルの電気泳動プロファイルを選択します。
4. 関連するピークを確認してください。
   1. 「ツール」>「平均蛍光」：関連するピークを確認するためにマハルソフトウェアを使用してください。 「蛍光」ボックスに挿入します蛍光値は、それらがバイオアナライザーソフトウェアから読み出すことができるように蛍光単位（FU）として示されます。昇順で最も高い蛍光を有する4（3）ピークを挿入し、カンマで区切られています。例：126130132137。
      注：すべてのこれらのピークのFUのは、バイオアナライザーソフトウェアによって示されている場合、それらはプロットからそれらを読み出すことによって推定される必要があります。
5. 「計算する」ボタンを押してください。観察された蛍光は、ボックス「最小ピーク高さ」で指定された値を超えた場合にピークが関連しています。
6. 遺伝子型を推論します。
   1. 昇順にマハルのテキストボックス「入力ピークス（bp）の「すべての関連のピークの塩基対での大きさに挿入し、カンマで区切られています。例：440,462,519,579,637。
      注：これらのピークの大きさの全てではないが、バイオアナライザーソフトウェアによって示されている場合、それらはプロットからそれらを読み出すことによって推定される必要があります。
7. 「計算する」ボタンを押してください。
8. リストでボックスには、最小限の二乗マハラノビス距離 "D2M」を探してください。それは≥0.05ある右に対応するP値は、その後確率は帰無仮説H _0が拒否されたこと≥5％である場合には（H _0：観察された基準プロファイルは同一である）が観察されたプロファイルが同じであることが認められていることを意味します指示された遺伝子型の基準プロファイル。
9. D2Mが最小であるが、対応するP値のフィールドが空の場合、確率<5％H _0を棄却。
   注：これはD2Mは最小限ですが、プロファイルが等しくないことを意味します。このような結果は、非平均電気泳動条件に起因し得ます。
   1. これらの偏差を補正するために、値395「ピーク（bp）の観測」テキストボックスに挿入し、「計算」ボタンを押してください。最小限のD2Mと対応するP値≥0.05のために再度確認してください。成功しない場合、値は405、415、および425を試してみてください。
      注：時々、小さなステップでもあります示されています。 、観察されたプロファイルが参照データには存在しない成功していないまだ場合、それは新たな遺伝子型または変異体であってもよいです。
10. 様々なプロファイル
    1. 繰り返しますが、別途、各電気泳動プロファイルに対して5.6〜5.9を繰り返します。

結果

遺伝子型とその変種の定義

すべての識別された遺伝子型から複数の帯域が異なる電気泳動プロファイルが新たな遺伝子型であると考えられます。新しい遺伝子型に名前を付けて拡張フルニエらによると^。5 GTZにGTAの遺伝子型につながる、GTBZに遺伝子型GTAZにGTAA、およびGTBAが続き、現在ではGTCCにGTCAされています。ただ一つのバンドの変化は、遺伝子型の変異体とみなされます。これは、遺伝子型（ 例えば、GTRI、GTRII）の名の後に上付きローマ数字で示されています。全体で、参照データベース141の遺伝子型及び変異体は、現在存在しています。

上記で概説した条件下では、フルニエらによるRS-PCRを^。5

ディスカッション

RS-PCR（> 30純粋なDNA /アッセイをNG）におけるDNAの過剰がある場合手順全体の最も重要なステップがある^2。そのすべてのピークがベースラインから始まり、最後ならば一般的には、プロファイルの解像度が最適です。 2つのピークが一緒に近すぎる場合は、解像度が不完全です。手動識別が必要とされるように、これらの条件下では、バイオアナライザーソフトウェアが不適切なピーク同定につながり得ます。

BPまたはFUとして表現すべて目に見えて分離し、関連するピークは、さらなる分析のために含まれています。ピークの重なりや減損解像度をピークまでのRS-PCRの結果のためにあまりにも多くの鋳型DNA広いピークで、したがって。また、移行は遺伝子型がもはや推論されることがないように、誤って増加しているピークのサイズに遅い有力です。最後に、無関係なピークの数が大きいです。以上の3つのピークを持つプロファイルの場合、最大蛍光を有するピークは、通常150 FUを超えてはなりません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン	メルク	1.08382.0500	Mw = 121.14 g/mol
チトリプレックス III	メルク	1.08418.0250	Mw = 372.24 g/mol;Substance is equivalent to Na2EDTA·2H2O
塩酸 5 mol/L	メルク	1.09911.0001
コロンビア寒天+5% 羊の血液	bioMérieux	43049
Agilent DNA7500 Kit	Agilent Technologies	5067-1504
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2940CA
Agilent 2100 expert sofware	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
プライマー L1	マイクロシンス		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'
プライマー G1	マイクロシンス		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'