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方法論記事

骨髄増殖性腫瘍の形質導入 - 移植マウスモデル

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DOI：

10.3791/54624

⸱

2016年12月22日

 ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology/Oncology, University of California, Irvine

この記事について

サマリー

この原稿は、形質導入移植マウスモデルを確立するために使用される方法論の説明を提供します。骨髄移植を行う際に避けるべき技術的なエラーについて詳細に説明されています。高ウイルス力価、トランスフェクション/形質導入、および照射の重要性を明確に理解する必要があります。

要約

形質導入移植は、マウスのヒト血液悪性腫瘍をモデル化するための迅速かつ効率的な方法です。この技術は、造血細胞における目的遺伝子の発現をもたらし、正常および/または悪性造血における遺伝子の役割を研究するために使用することができます。このプロトコルでは、骨髄増殖性腫瘍 (MPN) で最近同定されたカルレティキュリン (CALR) 変異を例として使用して、形質導入移植を行う方法についての詳細な説明を提供します。このプロトコルでは、5-フルルラシル(5-FU)処理ドナーマウスの全骨髄細胞に、変異型CALRをコードするレトロウイルスを形質導入し、致死的に照射した同系宿主に移植します。変異型CALRを発現するドナー細胞は、緑色蛍光タンパク質(GFP)で標識されています。移植マウスは、末梢血中の血小板上昇、骨髄中の巨核球の増殖、骨髄線維症などのMPN表現型を発症します。レトロウイルスの生成方法、ウイルス力価の計算方法、全骨髄細胞の形質導入方法、および放射線照射を受けたレシピエントマウスへの移植方法について、段階的に説明します。

概要

形質移植は、マウスにおける血液悪性腫瘍をモデル化するための有用な方法です。この技術は、バックBCR-ABL1の異所性発現が忠実にマウス1に慢性骨髄性白血病を再現できた最初の実証にまでさかのぼる骨髄性悪性疾患を研究するために特に有用となっています。この技術は、その後骨髄増殖性腫瘍（MPN）を変異させJAK2 V617FおよびMPL W515K / Lの広範な研究を促進してきました。

MPNは、成熟骨髄細胞と骨髄線維症の過剰産生を特徴とする血液悪性腫瘍のグループです。これらの疾患は、一般的にはJak2、MPL、またはCALRのいずれかで体細胞変異を獲得した造血幹細胞のクローン性増殖から生じます。形質移植JAK2 V617FおよびMPL W515K / Lモデルの展示真性多血と骨髄線維症2の臨床的特徴- 5 </ SUP>。最近、カルレティキュリン変異MPNのマウスモデルはまた、形質移植法6で生成されています。これらのマウスは、増加した血小板、巨核球数の増加、および骨髄線維症本態性血小板血症のような疾患を発症します。一緒に、これらのモデルはMPNの分子病態だけでなく、前臨床設定において治療薬を開発し、研究するための能力への洞察を得る機会を提供していません。

この原稿はCALRdel52突然変異を中心とした形質導入移植方法論の詳細な説明を提供します。この技術は、変異体が照射同系のレシピエントマウスに構築物を発現するレトロウイルスで形質導入した骨髄細胞の移植を含みます。

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プロトコル

本研究では、承認され、カリフォルニア大学アーバイン校で施設内動物管理使用委員会の勧告に準じて行きました。すべての手順は、イソフルラン麻酔下で実施し、すべての努力は苦痛を最小限に抑えるために行われました。

同種指向性レトロウイルスの1世代

  1. 商用マキシプレップキットまたは塩化セシウム精製のどちらかを使用して、少なくとも1μgの/μlの濃度で高品質のプラスミドを準備します。
    注：言及（これらは、（この場合はCALR 7,8）目的の遺伝子をコードするMSCVのバックボーンベクターが含まれており、選択のマーカー（ など GFP、ネオ、）だけでなく、同種指向性パッケージングプラスミド、エンコードギャグ-POL-ENVここでは、プラスミドなど）。
  2. DMEM中で解凍し、展開した低継代293T細胞を、ペニシリン/ストレプトマイシン（D10）で、10％FBSおよびL-グルタミンを補充しました。プレート加湿さ10cm組織培養処理皿の中で5×10 6個の細胞組織培養を37℃にてインキュベーター、5％CO 2。
  3. 培養中の293T細胞を展開します。トランスフェクションの前日には、真空フラスコに1mlのPBSを吸引上清を添加することにより、細胞を洗浄。
  4. 細胞をトリプシン処理するには、2ミリリットル0.05％トリプシンを追加し、インキュベート料理を2加湿組織培養インキュベーター中- 3分37℃、5％CO 2。
  5. トリプシン処理を停止するには、15ミリリットルコニカルチューブに細胞を皿転送する3ミリリットルのD10を追加します。 10分間400×gで細胞をスピン。
  6. 2ミリリットルのD10での真空フラスコおよび再懸濁細胞ペレットに上清を吸引。
  7. 血球計数器を用いて、トリパンブルー排除によって細胞を数えます。
  8. シード生成されたウイルスごとに3つの10cmの組織培養処理皿に皿当たり2×10 6個の細胞。
    注 ： -トランスフェクションまたは悪いウイルス収量の時点で50％コンフルエンスを得ることができる最適な結果を得るためには、30を超える細胞が許可されていません。
  9. すぐにトランスフェクションの前に、真空フラスコに培地を吸引し、5mlの新鮮なD10と交換します。
  10. すべての10 CMのペトリ皿は、個々の滅菌1.5ミリリットルマイクロチューブを準備するトランスフェクトします。
  11. ピペット減少血清培地の760μlの各マイクロ遠心チューブには、慎重に直接メディアへのトランスフェクション試薬の40μlを添加します。 5分間室温で組織培養フード中で管をインキュベートします。
  12. 目的の遺伝子（空のベクターを用いて、15μgの場合）だけでなく、それぞれのチューブに5μgのプラスミドでMSCVベクター30μgのを追加し、ピペッティングにより穏やかに混合します。さらに15分間組織培養フード中で室温でインキュベートします。
    注：小さいベクターは、ウイルスの収量を有する傾向があります。
  13. 慎重に滴下、そのそれぞれ10センチメートルペトリ皿に各反応（約800μl）を、総容量を追加し、穏やかに混合するために左右に料理を傾けます。加湿した組織のcuに細胞を返しますltureインキュベーター。
  14. 組織培養インキュベーター中で8時間または一晩のインキュベーション後、静かに吸引真空フラスコにメディアとは、新鮮なD10の10ミリリットルと交換してください。
  15. 48時間後、トランスフェクション時に35ミリリットル注射器に上清を回収し、細胞破片を除去するために0.45μmの膜でろ過します。
  16. オプション：バック293T細胞および追加のウイルスに置き10ミリリットル新鮮なD10は72時間トランスフェクション後に収穫することができます。
  17. 追加のウイルスが回収されない場合、バイオハザード廃棄物中の293T細胞を処分。
  18. 単回使用量（ウイルス力価のために例えば1ミリリットルまたはBM感染の6.5ミリリットル）にアリコートウイルス上清。 -80℃で液体窒素とストアウイルスによるフラッシュ凍結ウイルス。
    注：彼らは非常にウイルス力価を減少させるように繰り返し凍結/融解の繰り返しは避けてください。

2.フローサイトメトリーによって相対ウイルス力価を決定します

  1. 3T3細胞を解凍し、D10に維持します。 10センチメートル文化細胞加湿した組織培養37℃インキュベーター、5％CO 2で組織培養処理皿。
  2. 三重でウイルス力価を実行します。細胞を調製するために、真空フラスコに1mlのPBSと吸引上清を添加することによって細胞を洗浄します。
  3. 細胞をトリプシン処理するために2mlの0.05％トリプシンを追加し、インキュベート皿を加湿組織培養インキュベーター中、37℃で、5％CO 2。
  4. トリプシン処理を停止するには、15ミリリットルコニカルチューブに細胞を皿転送する3ミリリットルのD10を追加します。 10分間400×gで細胞をスピン。
  5. 2ミリリットルのD10での真空フラスコおよび再懸濁細胞ペレットに上清を吸引。
  6. 血球計数器を用いて、トリパンブルー排除によって細胞を数えます。
  7. シード15 60ミリメートル組織培養処理皿に1×10 5細胞の密度で3T3細胞と一晩インキュベートします。
  8. 3、1：10、1：30、および1：1ミリリットルの合計にD10を使用して解凍したウイルス上清の100希釈液1を加えます。また、ウイルスフリーコントロールが含まれています。
  9. 私を吸引真空フラスコに3T3細胞から径とD10の4ミリリットルと交換してください。
  10. ウイルス上清の希釈液で3T3細胞をオーバーレイし、各ディッシュに最終濃度8μg/ mlとなるようにポリブレンを追加します。 37℃で組織培養インキュベーター中で48時間、5％CO 2インキュベートします。
  11. フローサイトメトリーによる相対的なウイルス力価を決定します。
    1. 細胞を洗浄するために、真空フラスコにメディアを吸引し、5ミリリットルのPBSを追加します。
    2. 真空フラスコにPBSを吸引除去します。 1ミリリットル0.05％トリプシンを追加し、2、37℃でインキュベート - 5分は皿から細胞を剥離します。
    3. プレートから残りの細胞を剥離するには、上下3ミリリットルのD10とピペットを追加します。 10分間400×gでFACSチューブと遠心分離機に細胞を移します。
    4. 上清を除去し、3ミリリットルのPBSで細胞を洗浄。 10分であり、デカンテーション、上清のための400×gで遠心分離します。 200μlのPBSで再懸濁。
    5. 9フローサイトメーターで細胞を実行します。トン内3万イベント - 20,000を収集彼は（SSC 対 FSCによって決定される）セルゲートを生き、GFP +およびGFPの割合を計算-細胞を。
      注：ウイルス力価が許容できると考えられているときにウイルス上清の収率は、少なくとも50％のGFP + 3T3細胞の1時30希釈。 50％未満のGFP +細胞におけるこの希釈の結果は、その後、次善の変換結果を得ることができる場合。ウイルス力価を決定するための計算は、リモンらから適合させました。 、 ブラッド （1997）9。
    6. 希釈ファクター×ウイルス力価=粒子形成単位（PFU）/ mlの= [上清の（GFP +細胞の頻度×3T3細胞の数）/容量（ml）]：相対的なウイルス力価を決定するために、式を使用します。

3.伝達のドナー骨髄細胞

  1. 骨髄（BM）収穫のためのドナーマウスを準備するには、最初の5％を合わせ補足の流量でイソフルラン気化器によりマウスを麻酔1L /分の酸素。応答性を評価するために足をつまみます。
    注：（未満8週齢）ドナーマウス（8日、移植前に）5日前骨髄採取に準備する必要があります。一つのドナーマウスは、少なくとも2つの受信者のために十分な細胞を提供します。
  2. 注入150ミリグラム/キログラム27 G×½ "針を用いて麻酔したマウスにおける眼窩後部注射による5-フルオロウラシル（5-FU）。
    注意！ 5-FUの抗癌化学療法剤。常に認定された化学ヒュームフードやダクトバイオセーフティキャビネット内の5-FUを処理します。 5-FUで処置したマウスの適切なラベル付けを決定するために、金融機関の実験室および動物安全委員会に相談してください。
    1. その側に麻酔をかけたマウスを合わせ、目が頭からわずかに突出するように親指と人差し指の両方を使用することによって抑制。
    2. 内側眼角へと上向きにベベルと横針で出発し、45時に針を挿入します針が途中まで挿入され、内側方向、停止中の°の角度。ゆっくりと細胞を注入し、慎重に針を外してください。
      注：この技術が正しく実行された場合、目はやや後退しなければならないと何の抵抗は、針の挿入時に感じてはなりません。
    3. このような腫れや出血などの損傷の兆候のためのマウスを調べます。
  3. 収穫骨髄5日（移植の3日前）、5-FU処置後。
    1. 1L /分で酸素補給を組み合わせた5％の流量でイソフルラン気化器によりマウスを麻酔。応答性を評価するために足をつまみます。
    2. 頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。毛皮が濡れになるまで、70％EtOHで寛大に噴霧することにより、マウスを滅菌します。
    3. 解剖ハサミを使用して、皮膚に切開を行い、離れて足の筋肉から筋膜を分析。次に、ヒップで大腿骨と足首で脛骨を切断することによって、マウスから離れて足を解剖。
    4. ベンド「L」字型に脚部とは、解剖ハサミで膝関節で切断することにより、各脚の骨を分離します。
    5. 各脚の骨の遠位端部に軟骨を除去するために、軟骨が解除されるまで、そっと足骨の一端に向かって筋肉をこすり取る際には、解剖ハサミを使用しています。
    6. 27 Gのx½インチの針と注射器を使用して、PBSと面一に各脚の骨は、50ミリリットルコニカルチューブに100μMのナイロン膜の上に、2％FBSを補充しました。骨まで洗浄骨が採取された細胞の数を最大化するためにホワイトになります。
    7. 単一細胞懸濁液を得るために、50mLのコニカルチューブにナイロン膜を介して細胞をマッシュシリンジのプランジャーを使用します。他のマウスの足で繰り返します。
  4. 400×gで10分間4℃で遠心し細胞と上清を捨てます。再懸濁BMを5mlの塩化アンモニウムカリウム（ACK）緩衝液中の赤血球を溶解します。氷上で10分間細胞をインキュベートします。
  5. 細胞溶解を停止するためにPBSでチューブを埋めます。 Centri400×gで10分間、4℃でFUGE細胞と上清を捨てます。 BMペレットは、赤い色を持っている場合は溶解ステップを繰り返します。
  6. 5ミリリットルのPBSで再懸濁し、血球計数器を用いてトリパンブルー排除によって細胞をカウントします。
  7. DMEM、20％FBS、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシンを補充含まれている2回プレstimのカクテルメートルあたり2×10 6個の細胞で細胞を再懸濁し、IL-3（14 ngの/ ml）を、IL-6（24 ngの/ミリリットル）、およびSCF（112 ngの/ mlで）。プレート6ウェルプレート中のウェルあたり2ミリリットル。
  8. 37℃で一晩細胞をインキュベートし、5％のCO 2。
  9. 含む各ウェルBM細胞にウイルス上清の2ミリリットルを追加し、ポリブレン（/ミリリットル8μgの）を追加します。 1,500×gで90分間、30℃で回転プレートを一晩組織培養インキュベーターにプレートを戻します。
  10. 400×gで10分間、4℃でコニカルチューブと遠心分離機にピペット細胞懸濁液、プレートを破棄することはありません。 2ミリリットル中に細胞を再懸濁し、ウェルあたりの新鮮な2×プレstimのカクテルとオリジナルのウェルに戻ります。
  11. ステップ3.7から3.9を繰り返して、2 番目のスピノキュレーションを実行します。

レシピエントマウスに4移植ドナー細胞

  1. BM細胞の注入前に致死量の全身照射<24時間で移植用同系レシピエントマウスを準備します。
    注 ：BALB / cマウスのための致死量の放射線照射は、一般的に800〜900センチグレイとC57B / 6 10 1,000-1,200 cGyです。用量は、典型的には少なくとも3-4時間間隔を空け照射の二つのセッションに分割されます。
  2. 優しくコニカルチューブに上清をピペットでステップ3.11、6ウェルプレートから収穫形質導入されたドナー細胞から続きます。残留細胞を回収し、50mlコニカルチューブに追加する1mlのPBSで各ウェルを洗浄します。
  3. ウェルに0.05％トリプシンを0.5mlを加え、5分間組織培養インキュベーター中、37℃でインキュベートします。
  4. ウェルに1ミリリットルのD10を追加し、穏やかにピペッティングすることにより、残りの細胞を剥離。それぞれのチューブに細胞を追加400×gで10分間4℃で遠心分離することによって、ステップ4.2およびペレットからの。
  5. 400×gで10分間4℃でPBSと遠心で細胞を洗浄します。 5ミリリットルのPBSで再懸濁し、トリパンブルー排除により血球計数器を用いて細胞数を計測します。
    注 ：ベクターは、GFPタグを有する場合には、フローサイトメーターを用いてGFP陽性細胞の割合を定量化します。
  6. マウスに注入するための100μlのPBS - 50で2×10 6細胞- 5×10 5を再懸濁します。
  7. 滅菌27 Gのx½ "針を用いて麻酔したマウスに眼窩後部注射を介して細胞を注入します。
    注：他の注射技術は、尾静脈、脾臓、または大腿骨が含まれます。
    1. 応答性を評価するために、イソフルランとピンチ足を使用して、マウスを麻酔。
    2. その側にマウスを合わせ、目が頭からわずかに突出するように親指と人差し指の両方を使用することによって抑制。
    3. 傘を上に向けて、n個の挿入45°の角度で内側眼角に横eedle。
      注：この技術が正しく実行された場合、目はやや後退しなければならないと何の抵抗は、針の挿入時に感じてはなりません。
    4. このような腫れや出血などの損傷の兆候のためのマウスを調べます。
      注：次の移植マウスは、数週間のための低血球数を持っているので、感染しやすいでしょう。抗生物質または酸性水を用いて予防を使用することができます。
  8. 移植後1ヶ月、フローサイトメトリーによる生着したドナー細胞の指標として、末梢血中の％のGFPを測定します。
    注：だけではGFPは細胞の移植の成功を決定することはできません。ウイルス形質導入に失敗した可能性があり、まだ生着が発生している可能性があります。この場合には、GFP +細胞が検出されないだろうが、移植細胞の生着が成功しました。
    1. 末梢血Bの10μLを取りますyの21 G×1½ "シリンジで伏在足の静脈を穿刺し、血液凝固を防ぐために、PBS中の100mMのEDTAに追加します。
    2. 10分間氷上で血液と溶解に1ミリリットルACKを追加します。 10分間、400×gで遠心分離により細胞をペレット化。
    3. 上清を吸引し、真空フラスコ中とPBSは、溶解を停止するには、2％のFBSを補充した1ミリリットルを追加します。 10分間、400×gで遠心分離により細胞をペレット化。
    4. 100μlのPBS中の真空フラスコ再懸濁ペレット中の上清を吸引し、2％FBSを補充しました。
    5. フローサイトメーターでサンプルを実行し、（SSC 対 FSCによって決定される）生細胞ゲート内30万イベントを収集し、GFP +およびGFPの割合を計算-セル9を 。
  9. さらに1ヶ月の移植後に、疾患の進行を監視するために自動化された獣医の血液分析器18を使用して完全血球数（CBC）を行います。
    注：％によって病気を監視し続けます毎月の末梢血とCBCでGFP。
  10. 実験を終了するには、応答性を評価するために、イソフルランとピンチ足を用いてマウスを麻酔。組織病理学のための頸椎脱臼や収穫脾臓および骨髄によってマウスを生け贄に捧げます。
    注：この実験の長さは主観的なものであると終了日は、予想される疾患の表現型に基づいて評価されるべきです。

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結果

形質移植技術は、細胞は、目的の遺伝子を発現するレシピエントマウスの造血再構成をもたらします。 図1は、MPN変異したカルレティキュリンの導入-移植マウスモデルの概要を示しています。簡単に言えば、CALRwtまたはCALRdel52を発現しているレトロウイルスはC57B / 6ドナーマウスからのBM細胞を感染させるために使用されます。形質導入した細胞を照射C57B / 6レシピエントマウスおよびドナー細胞の生着に移植された最初の月、移植後の間に起こります。 10ヶ月の移植後 - 疾患表現型の証拠が明らかに3ヶ月をマウスの展示は6で骨髄線維症に続いて、血小板及び巨核球を増加させ、移植後になります。ドナー細胞が生着しなかった場合は、マウスの死は、移植後の最初の2週間以内に発生する可能性があります。注入中貧しい注射または外傷に加えて、他の技術的なエラーが伝達の乏しい生着を引き起こす可能性がありますD細胞またはマウス死亡。これらは、これは、ほとんどの造血細胞を生じた場合、受信者ではなく、ドナー由来であろう、レシピエントマウスの次善の照射が挙げられま...

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ディスカッション

このプロトコルは、疾患のドライバーとしてCALRdel52変異を有する骨髄線維症への進行と本態性血小板血症のような疾患を再現するために、マウスに骨髄移植を実行する方法の詳細な説明を提供します。増加した血小板、巨核球の拡大、および骨髄線維症にCALRdel52結果を発現する細胞の移植の成功。骨髄移植は、多段階プロセスであるので、技術的なエラーは、目的の遺伝子、あるいはマウスの死亡を発現する細胞の乏しい生着を防止するために回避することができるステップを認めることが重要です。

見落とされがち成功した形質導入 - 移植モデルへの重要な要因は、ウイルスの品質です。低力価に関連したウイルスを使用して、目的の遺伝子を発現する細胞がより少ないことになるのに対し、高い力価を有するウイルスは、良好な形質導入効率、したがって、病気のための強固な基盤を容易にします。形質導入efficiencyは、ウイルスとポリブレンとレトロネクチンような細胞間の接触を増加させる試薬によって向上させることができます。 HSCの形質導入があっても、ウイルスの高濃度では困難であることが知られている、エコトロピックレトロウイルス...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は、V Foundation Scholar (AGF) と MPN Research Foundation (AGF) の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
細胞株
DMEMCorningMT-10-013-CV
293T細胞ATCCCRL-11268
3T3細胞ATCCCRL-1658
Plasmids
EcoPak、別名pCL-EcoAddgene12371EcoPack 2-293などのレトロウイルスパッケージング細胞株は、EcoPakプラスミドおよび標準的な293T細胞の代わりに使用できます。追加のγ-レトロウイルスエンベロープおよびパッケージングプラスミドは、Addgeneなどから入手可能です。
MSCV-IRES-GFP (MIG)Addgene20672追加のγ-レトロウイルストランスファープラスミドは、Addgeneなどから入手可能です。
消耗品
27 G x 1/2 "針BD305620
ウシ胎児血清コーニングMT-35-010-CV
ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミンコーニングMT-30-009-CI
トリプシン-EDTA (0.05%)コーニングMT-25-052-CI自家製
PBSコーニングMT-21-031-CV
10 cm皿フィッシャー172931
15 mlコニカルチューブフィッシャー12565268
60 mm皿フィッシャー150288
ポリブレンフィッシャーNC9840454
5-FUフィッシャーA13456-06
100 µm細胞ストレーナーフィッシャー22363549
50mlコニカルチューブフィッシャー12565270
6ウェルプレートフィッシャー130184
FACSチューブフィッシャー14-959-5
0.45 μmのシリンジ フィルターFisher0974061B
Opti-MEMGibco31985-070
ACK緩衝器Lonza10-548E自家製であることができる
組換えマウスIL-3Peprotech213-13
組換えマウスIL-6Peprotech216-16
組換えマウスSCFPeprotech250-03
X-tremeGENE 9Roche6365809001トランスフェクション試薬
1.5 ml 遠心分離管USA Scientific1615-5500
Equipment
BD Accuri C6
X 線照射器
にすることができます

参考文献

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