私たちは、PDCの機能研究のための狼瘡傾向マウスの骨髄から高純度の形質細胞様樹状細胞（pDC）を単離するために蛍光活性化セルソーティングを使用してプロトコルを報告しています。
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この記事について
サマリー
要約
Fluorescence-activated cell sorting (FACS)は、フローサイトメトリーによって検出された表現型に基づいて特定の細胞集団を精製する技術です。この方法により、研究者は他の細胞の影響を受けずに、単一細胞集団の特性をよりよく理解することができます。磁気活性化セルソーティング(MCS)などの他の細胞濃縮方法と比較して、FACSはフローサイトメトリーによる表現型検出の能力により、細胞分離に対してより柔軟で正確です。さらに、FACSは通常、複数の細胞集団を同時に分離することができるため、実験の効率と多様性が向上します。FACSにはいくつかの制限がありますが、in vitroおよびin vivoの設定で機能研究のための細胞の精製に広く使用されています。ここでは、pDCのin vitro機能研究のために、狼瘡を起こしやすいマウスの骨髄から免疫細胞、形質細胞様樹状細胞(pDC)の非常にまれな集団を高純度で単離するための蛍光活性化細胞ソーティングを使用したプロトコルを報告します。
概要
選択した細胞集団を他の細胞から効率的に分離することで、他の方法では不可能な集団の研究が可能になります。蛍光活性化セルソーティング(FACS)は、興味深い細胞集団を高純度で濃縮する方法です。1,2 通常、異なる細胞タイプは、ある細胞集団を別の細胞集団と区別できる原形質膜上に独自の分子、またはいくつかの分子のユニークな組み合わせを発現します。これらの細胞表面分子を特異的な蛍光標識抗体に結合させると、フローサイトメーター/ソーターと呼ばれる検出装置は、細胞上の異なる分子マーカーを表す異なる蛍光色素の光シグナルを単一細胞レベルで励起し、検出することができます。光信号の存在(対応する表面分子の正の発現を表す)または光信号の不在(分子の負の発現を表す)のいずれかからなる複合情報が、細胞の表現型を定義します。検出器を通過した後、目的の同じ表現型を持つ細胞は、電荷に基づいて指定された収集チューブに向けられます。
FACSは、濃縮されるべき集団が蛍光で標識されている限り、さまざまな研究に広く適用されます。3-7 腸内細菌叢8において、免疫グロブリン(Ig)A被覆細菌と非IgA被覆細菌を分離し、蛍光タンパク質を発現する遺伝子改変細胞集団を選別するために使用されています。9 重要なことに、複数の集団を同時に分離する能力があるため、時間と試薬を節約できるだけでなく、より洗練された研究デザインが可能になります。
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プロトコル
注：MRL / MP-のFas のlpr狼瘡傾向マウスを繁殖させたとバージニア工科大学（動物福祉保証番号での施設内動物管理使用委員会（IACUC）の要件以下の特定病原体フリーの施設で維持した（MRL / LPR）： A3208-01）。この研究は、米国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って行きました。全ての動物実験は、IACUCプロトコル番号12から062で行いました。
1.細胞培養培地およびソート・バッファ
- 完全な細胞培養培地（C10）を10％ウシ胎児血清、1mMピルビン酸ナトリウム、1％の100 MEM非必須アミノ酸、10mMのHEPES、55μM2-メルカプトエタノール、2mMのL-グルタミンを補足したRPMI1640を使用して調製100 U / mlのペニシリン - ストレプトマイシン。
- 並べ替えバッファを準備し、10mMのHEPESを補充した1×ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）を用いて（フルHBSS）、2.5 mg / mlウシ血清アルブミン、0.05のMgCl 2および0.2 U / mlのDNアーゼI.
2.マウスの解剖
- 4ミリリットルのC10を含む2つの6 cmの直径の料理を準備します。氷の上に皿を置きます。
- CO 2吸入によりマウスを安楽死させます。
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結果
我々は、IFNαを産生する能力についてのpDCの機能変化を研究するために老いも若き両方年齢のMRL / LPRの狼瘡傾向マウスから、高純度の骨髄のpDCを豊かにすることを目的とした、および他の細胞型の影響を受けません。使用された最初の精製戦略は、 図1に示すように、濃縮した後にのみ7.75パーセントの純度につながった、MCS、でした。 MCSと比較して、FACSは、96.4％の高純度でのpDC濃縮しました。高純度を確保するために、ステップバイステップのゲーティング戦略を行いました。 図2に示すように、単核細胞をゲーティングし、前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）のパラメータによって破片から分離しました。 FSC幅（FSC-W）FSC-高さ対 （FSC-H）とSSC-H対SSC-Wを使用して、単一の細胞が集合体によって産生される偽陽性シグナルを回避するために、ゲートしました。ライブ単一細胞は、その後、DAPIとしてゲートした-人口（DAPI +
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ディスカッション
この原稿に記載されているプロトコルは、IFNαを産生する能力を保持する生きたpDCの高純度濃縮のためのものです。このプロトコルのアプリケーションには、細胞および分子機能の研究のためのMRL / lprの骨髄および他のマウス株からのpDCおよび/または他の単核細胞の精製が含まれますが、これらに限定されません。このプロトコルのいくつかの重要なステップは、選別されたpDCの高い生存率と純度を確保することです。最初の重要なステップは、骨からの骨髄の放出です。骨髄細胞への損傷を最小限に抑えるには、骨を砕くのではなく、骨をそっと割って乳棒をかき混ぜることが重要です。2番目の重要なステップは、密度勾配培地による単核細胞の濃縮です。細胞懸濁液をロードしながら、下相(密度勾配培地)と上相(細胞懸濁液)の間に明確な界面を確立することが重要です。遠心分離条件は、主に単核細胞を含むバフィーコート層の形成にも重要です。遠心分離後、骨片、赤血球、高密度好中球はバフィーコート層から除外され、チューブの底にとどまります。3番目の重要なステップは、細胞を蛍光結合抗体とともに低温(氷上または4°C)でインキュベートすることです。染色後、細胞を広範囲に洗浄して、細胞ソーター.......
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開示事項
著者らは、この論文の出版に関して利益相反がないことを宣言します。
謝辞
フローサイトメトリーの中核施設の使用について、バージニアメリーランド獣医学部のフローサイトメトリー研究所に感謝します。この作業は、XMLのスタートアップファンドによって支援されました。XLは、生物医学および獣医学の大学院プログラムのスタンプフェローです。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| ウシ胎児血清 | HyClone | SH30396.03 | |
| ビン酸ナトリウム | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM 非必須アミノ酸 | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES gibco by life technologies | 15630-080 | ||
| 2-メルカプトエタノール | gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| L-グルタミン | ライフテクノロジーズによるgibco | 25030-164 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | ライフサイエンステクノロジーズによるギブコ | 15140-122 | |
| 1x ハンク'平衡塩溶液 | ライフテクノロジーズによるgibco | 14175-079 | |
| MACS BSAストックソリューション | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MgCl2 | SIGMA | M8266 | |
| DNase I | SIGMA | D4527 | |
| 赤血球(RBC)溶解バッファー | eBioscience | 00-4300-54 | |
| 密度勾配中 | GE Healthcare | 17-1440-02 | Ficoll-Paque Plus |
| 抗マウス CD19-PE | BD Pharmingen | 553786 | |
| 抗マウス CD11c-PE | eBioscience | 12-0114-82 | |
| 抗マウス CD11b-APC-CY7 | BD Pharmingen | 557657 | |
| 抗マウス PDCA-1-FITC | eBioscience | 11-3172-81 | |
| 抗マウス B220-V500 | BD Pharmingen | 561226 | |
| DAPI | invitrogen | D3571 | |
| 形質細胞様樹状細胞単離キット II, マウス | Miltenyi Biotec | 130-092-786 | |
| BD FACSAria I フローサイトメーター | BDバイオサイエンス | 643178 | |
| BD FACS ディーバ バージョン6 | BDバイオサイエンス |
参考文献
- Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).
- Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Sta....
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再版と許可
