方法論記事

マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

DOI：

10.3791/54641

⸱

2016年11月4日

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Flow Cytometry Laboratory, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、PDCの機能研究のための狼瘡傾向マウスの骨髄から高純度の形質細胞様樹状細胞（pDC）を単離するために蛍光活性化セルソーティングを使用してプロトコルを報告しています。

要約

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Fluorescence-activated cell sorting (FACS)は、フローサイトメトリーによって検出された表現型に基づいて特定の細胞集団を精製する技術です。この方法により、研究者は他の細胞の影響を受けずに、単一細胞集団の特性をよりよく理解することができます。磁気活性化セルソーティング(MCS)などの他の細胞濃縮方法と比較して、FACSはフローサイトメトリーによる表現型検出の能力により、細胞分離に対してより柔軟で正確です。さらに、FACSは通常、複数の細胞集団を同時に分離することができるため、実験の効率と多様性が向上します。FACSにはいくつかの制限がありますが、in vitroおよびin vivoの設定で機能研究のための細胞の精製に広く使用されています。ここでは、pDCのin vitro機能研究のために、狼瘡を起こしやすいマウスの骨髄から免疫細胞、形質細胞様樹状細胞(pDC)の非常にまれな集団を高純度で単離するための蛍光活性化細胞ソーティングを使用したプロトコルを報告します。

概要

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選択した細胞集団を他の細胞から効率的に分離することで、他の方法では不可能な集団の研究が可能になります。蛍光活性化セルソーティング(FACS)は、興味深い細胞集団を高純度で濃縮する方法です。1,2 通常、異なる細胞タイプは、ある細胞集団を別の細胞集団と区別できる原形質膜上に独自の分子、またはいくつかの分子のユニークな組み合わせを発現します。これらの細胞表面分子を特異的な蛍光標識抗体に結合させると、フローサイトメーター/ソーターと呼ばれる検出装置は、細胞上の異なる分子マーカーを表す異なる蛍光色素の光シグナルを単一細胞レベルで励起し、検出することができます。光信号の存在(対応する表面分子の正の発現を表す)または光信号の不在(分子の負の発現を表す)のいずれかからなる複合情報が、細胞の表現型を定義します。検出器を通過した後、目的の同じ表現型を持つ細胞は、電荷に基づいて指定された収集チューブに向けられます。

FACSは、濃縮されるべき集団が蛍光で標識されている限り、さまざまな研究に広く適用されます。3-7 腸内細菌叢8において、免疫グロブリン(Ig)A被覆細菌と非IgA被覆細菌を分離し、蛍光タンパク質を発現する遺伝子改変細胞集団を選別するために使用されています。9 重要なことに、複数の集団を同時に分離する能力があるため、時間と試薬を節約できるだけでなく、より洗練された研究デザインが可能になります。10 ただし、FACSにも限界があります。目的の集団が非常にまれな(1%未満)場合、ソーティング効率が低下し、細胞が大幅に失われる可能性があります。さらに、一部の抗体結合は、選別された細胞集団の機能変化を誘導する細胞内シグナル伝達を活性化する可能性があります。11したがって、ソーティングに使用される表現型は慎重に選択する必要があります。

FACS以外にも、特定の細胞集団を濃縮するための細胞表面マーカーに基づく方法、例えば磁気活性化セルソーティング（MCS）などがあります。12 FACSと同様に、磁気ビーズ標識抗体は特定の細胞表面分子を標的とすることができます。抗体-抗原相互作用により、磁気ビーズでコーティングされた細胞は、磁場を通過した後、コーティングされていない細胞から分離することができます。しかし、MCSでは、磁気ビーズはFACSのさまざまな蛍光色とは異なり、区別できないため、標的にできる分子の数は限られています。したがって、MCSが表面マーカーの複雑な組み合わせで細胞表現型を定義することは困難です。13,14 さらに、MCSは標的細胞の意図しない活性化を引き起こすこともあります。

全身性エリテマトーデス(SLE)のマウスモデルの研究では、形質細胞様樹状細胞(pDC)を精製して、疾患の進行に伴う機能変化を調査することを意図していました。まず、MCSを用いて、定常状態でマウスpDCに高位かつ一意に発現する分子であるPDCA-1を標的として、骨髄からpDCを濃縮しました。16 しかし、細胞の純度は予想外に低かった、これはおそらくSLEのような炎症環境における他の細胞集団に対するPDCA-1のアップレギュレーションによるものであった。16 最終的に、4つの表面マーカー(CD11c、CD11b、B220、PDCA-1)を組み合わせたFACSを使用して、高純度pDCをCD11c+CD11b-B220+PDCA-1+集団として分離しました。マウスpDCには、Siglec-Hという別の特異的な表面マーカーがあります。Siglec-Hは、この分子の抗体結合がpDCのIFNα産生機能を抑制するため、使用しないことに決めました。11

名

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プロトコル

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注：MRL / MP-のFas のlpr狼瘡傾向マウスを繁殖させたとバージニア工科大学（動物福祉保証番号での施設内動物管理使用委員会（IACUC）の要件以下の特定病原体フリーの施設で維持した（MRL / LPR）： A3208-01）。この研究は、米国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って行きました。全ての動物実験は、IACUCプロトコル番号12から062で行いました。

1.細胞培養培地およびソート・バッファ

  1. 完全な細胞培養培地（C10）を10％ウシ胎児血清、1mMピルビン酸ナトリウム、1％の100 MEM非必須アミノ酸、10mMのHEPES、55μM2-メルカプトエタノール、2mMのL-グルタミンを補足したRPMI1640を使用して調製100 U / mlのペニシリン - ストレプトマイシン。
  2. 並べ替えバッファを準備し、10mMのHEPESを補充した1×ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）を用いて（フルHBSS）、2.5 mg / mlウシ血清アルブミン、0.05のMgCl 2および0.2 U / mlのDNアーゼI.

2.マウスの解剖

  1. 4ミリリットルのC10を含む2つの6 cmの直径の料理を準備します。氷の上に皿を置きます。
  2. CO 2吸入によりマウスを安楽死させます。
  3. 脾臓を採取し、氷上でC10と皿の中でそれを保ちます。
    1. 解剖板に上向きに腹でマウスを突き止めます。 70％エタノールを噴霧することにより本体を滅菌。
    2. 皮膚をカットし、下に首に恥骨結合から腹側正中線に沿って筋肉の壁から皮膚を分離します。
    3. 足首への最初の切開部から後肢に沿って皮膚をカット。
    4. 裏面に肌をピンとダイヤフラムに最初の切開場所から側面に沿って筋肉壁をカット。
    5. 後頭部の右側の筋肉壁をピン。
    6. 小腸の下、胃の横にマウスの右側に脾臓を探します。目の一端をピックアップ電子脾臓と胃から分離。
  4. 大腿骨と脛骨を含む、両方の後肢を切り取り、そしてできるだけ多くのすべての筋肉を取り除きます。
    1. 血管を回避しようとすると、鋭いハサミで足首に骨盤/股関節から後肢に沿って筋肉をカットします。
    2. 骨髄内容の暴露せずに骨盤/股関節と足首/足関節で切断することにより、後肢を分離。
    3. 繰り返しかみそりの刃で傷や関節のポイントで筋肉を切断することにより、骨の残りの筋肉を清掃してください。
  5. 氷の上で4ミリリットルのC10を含む6センチ皿に骨を保管してください。次のマウスを解剖に進んでください。

3.脾細胞の単離

  1. 赤い片が見えなくなるまで4ミリリットルのC10を含む皿の上に70μmのセルストレイナーに対するシリンジプランジャで軽く脾臓をホモジナイズします。
  2. ストレーナAを介して皿に追加の6ミリリットルのC10を追加します。NDその後、15ミリリットルコニカルチューブに合計10ミリリットルの細胞懸濁液を移します。
  3. 5分間遠心800×gで、4℃でコニカルチューブ。
  4. 遠心分離後、上清を吸引し、2mlの1×赤血球（RBC）溶解緩衝液中で細胞ペレットを再懸濁します。室温で5分間インキュベートします。
  5. インキュベーション後、5分間、800×gで4°Cをコニカルチューブを遠心します。
  6. 遠心分離後、上清を吸引し、1mlのC10に細胞ペレットを再懸濁します。任意の大きな塊（死細胞）を破棄し、後でチューブを氷上に保ちます。
    注：多くの小さな塊がある場合は、一度細胞懸濁液をフィルタリングするために70μmのセルストレイナーを使用しています。
  7. 自動細胞カウンターを用いてトリパンブルーを用いて細胞数をカウントします。

4.骨髄細胞の単離

  1. 乳鉢に4ミリリットルのC10と骨を移し、合計で10ミリリットルC10の容量を作るために6ミリリットルC10を追加します。
  2. APを使用して乳鉢で軽く骨をクラックestle。
  3. C10に骨髄を解放するために乳棒で軽くかき混ぜます。
  4. 70μmのセルストレイナーを通して氷上で50ミリリットルコニカルチューブに骨髄を含む10ミリリットルのC10を転送します。まだ骨を含む乳鉢に10ミリリットルの新鮮なC10を追加します。
    注：ピペット赤い塊が観察される場合は、ストレーナを通過する前に数回上下に骨髄を含む溶液。
  5. 繰り返し二回4.4から4.2を繰り返します。最後の洗浄後、骨は白表示されます。
  6. 5分間遠心800×gで、4℃で50ミリリットルコニカルチューブ。一方、RTで15 mlのコニカル遠心チューブ中の5 mlのにすぐに使用密度勾配培地を調製。
  7. 遠心分離後、上清を吸引し、10mLのC10で細胞ペレットを再懸濁します。
  8. ゆっくり二相の間に明確な界面を維持5mlの密度勾配媒体の上部と10 mlのCell懸濁液を層。その後で30分間1363グラムで15ミリリットルコニカルチューブを遠心分離9と0（またはブレーキOFF）に設定し、減速としての加速度が設定されたRT（20℃）。
  9. 遠心分離した後、慎重にトップ8ミリリットルの溶液を除去し、新しい15ミリリットルコニカルチューブにインタフェース（単核細胞の層）で2ミリリットルの軟膜を収集します。
  10. 骨髄単核細胞、キャップを含む15ミリリットルコニカルチューブに12ミリリットルの氷冷C10を追加して、よく混ぜ、10分、4℃、800×gでチューブを遠心分離する数回転倒。

FACS 5.細胞表面染色

  1. サンプル染色
    1. 抗マウスCD16 / 32抗体溶液（HBSS-フルで1〜100希釈、5μg/ mlの最終濃度）を準備します。
    2. ステップ4.10において遠心分離後、上清を吸引し、単核細胞上のFc受容体をブロックするために100μlの抗マウスCD16 / 32抗体溶液中で細胞ペレットを再懸濁します。氷上で10分間インキュベートします。
    3. 蛍光標識抗体の混合物を準備する（アリI-マウスのCD11c-PE 1：40希釈、抗マウスのCD11b-APC-CY7 1:80希釈、抗マウスPDCA-1-FITC 1：40希釈および抗マウスB220-V500 HBSS-で1：40希釈サンプルあたり100μlの最終容量で、製造業者によって推奨されるようにフル）。
      注：これは、使用する前に抗体を滴定することが重要です。
    4. ステップ5.1.2での10分間のインキュベーション後、抗マウスCD16 / 32、非結合除去するために5分、4℃で800×gで4 mlの氷冷HBSSフルと遠心を追加します。
    5. 遠心分離後、上清を吸引し、100μlの蛍光標識抗体の混合物で細胞ペレットを再懸濁します。暗所で15分間氷上でインキュベートします。
    6. 15分間のインキュベーション後、未結合の蛍光標識抗体を除去するために、5分間800×gで、4℃で4 mlの氷冷HBSSフルと遠心を追加します。
    7. FACSのローディング溶液（HBSS-フルで500 ngの/ mlのDAPI）を準備します。
    8. ステップ5.1.6で遠心分離した後、上清を吸引し、500μの細胞ペレットを再懸濁;リットルFACSローディング溶液。 12×75ミリメートルの丸底チューブ（FACSチューブ）に細胞懸濁液を移し、1時間以内に仕分けするまで暗所でチューブを氷上に保ちます。
  2. 補償のための染色
    1. PE、APC-CY7、FITC、V500、DAPIまたは未染色のようなラベル6は、FACSチューブ。一定分量のFACSチューブに1×10 6細胞/チューブで脾細胞を、5分間、4℃で800×gで4ミリリットルHBSS-フルで洗浄します。
      注：使用してDNA結合蛍光色素、DAPI、死細胞から生細胞を区別します。 DAPIは（ただし生細胞）の死細胞の原形質膜を通過し、染色体DNAに結合することができます。
    2. 上清を吸引し、100μlのHBSS-完全に細胞ペレットを再懸濁します。
    3. 抗マウスCD19-PE 1：40希釈、抗マウスのCD11b-APC-CY7 1:80希釈、抗マウスPDCA-1-FITC 1：40希釈または：対応する各FACSチューブでは、以下の抗体の1を追加します。 manufaによって推奨されるように抗マウスB220-V500 1：40希釈cturer。そのまま5 回目 （DAPI）と6 番目 （未染色）FACSチューブを残します。振とうしてよく混合し、15分間、暗所で氷の上のすべてのFACSチューブをインキュベートします。
    4. インキュベーション後、各試験管に4 mlの氷冷HBSS-フルを追加し、5分間、800×gで4°CをFACSチューブを遠心してください。
    5. 遠心分離後、上清を吸引し、500μlのFACSローディング溶液中に再懸濁されたDAPI標識されたチューブ内のペレットを除き、500μlの氷冷HBSSフルで細胞ペレットを再懸濁します。ソートするまで暗所で氷の上のすべての6のチューブを維持します。

6.セルソーターでソート

注：サイトメーターおよびソフトウェア上の手順をソートの動作は、同社が提供する詳細な命令で標準化されています。 （ すなわち 、競合が30下に保持ミリリットル当たり10百万円、70％以上に効率を調整する-簡単に言えば、我々は5の間、標的細胞濃度を設定し、20 psiで100ミクロンのノズルを使用します％）。

  1. 100 U / mlのペニシリン - ストレプトマイシンを含む500μlのFBS /チューブを収集FACSチューブを準備します。
  2. ステップ5.2からの単染色補償管を使用して、セルソーターの補償パラメータを調整します。
    1. 各蛍光強度のために負のゲートを設定するために染色されていないチューブで10,000個の細胞を記録します。
    2. 各蛍光強度のために正のゲートを設定するには、他の単一染色補償チューブで10,000細胞を記録します。
      注：ソフトウェアが自動的に補正パラメータを算出します。
  3. 3000細胞を記録することにより、ソートされた細胞集団のゲートを設定するためにステップ5.1から1のサンプルを使用してください。明らかに他のドットから分離したドット群として手動で、X及びY軸グラフのパラメータとして蛍光強度をゲート標的細胞集団使用。
    注：このゲーティングセットは、研究者の要件に基づいて、柔軟かつ任意です。研究者は1つ以上のマーカーに基づいて、より高純度が予想される場合、ゲートを移動高い対応する蛍光強度に基づいて。
  4. コレクションチューブをロードし、標的細胞集団をソートするために開始します。
  5. すべての試料管が行われるまで、ソートした後、氷上でコレクションチューブを保管してください。
  6. 4ミリリットル、キャップまでのコレクションチューブに氷冷C10を追加し、混合するために反転。
  7. 5分、4℃で800×gでコレクションチューブを遠心し、その後そのまま細胞ペレットと約200μLを残し、上清を吸引除去します。
  8. 細胞ペレットを再懸濁し、1.5ミリリットル遠心管にすべての細胞懸濁液を転送する1ミリリットルの氷冷C10を追加します。
  9. 5分間800×gで遠心分離し1.5mlチューブ、4°C、上清を吸引、手つかずの細胞ペレットに100μlのを残します。
  10. 使用するまで氷上でソートされた細胞集団を保管してください。

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結果

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我々は、IFNαを産生する能力についてのpDCの機能変化を研究するために老いも若き両方年齢のMRL / LPRの狼瘡傾向マウスから、高純度の骨髄のpDCを豊かにすることを目的とした、および他の細胞型の影響を受けません。使用された最初の精製戦略は、 図1に示すように、濃縮した後にのみ7.75パーセントの純度につながった、MCS、でした。 MCSと比較して、FACSは、96.4％の高純度でのpDC濃縮しました。高純度を確保するために、ステップバイステップのゲーティング戦略を行いました。 図2に示すように、単核細胞をゲーティングし、前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）のパラメータによって破片から分離しました。 FSC幅（FSC-W）FSC-高さ対 （FSC-H）とSSC-H対SSC-Wを使用して、単一の細胞が集合体によって産生される偽陽性シグナルを回避するために、ゲートしました。ライブ単一細胞は、その後、DAPIとしてゲートした-人口（DAPI +

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ディスカッション

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この原稿に記載されているプロトコルは、IFNαを産生する能力を保持する生きたpDCの高純度濃縮のためのものです。このプロトコルのアプリケーションには、細胞および分子機能の研究のためのMRL / lprの骨髄および他のマウス株からのpDCおよび/または他の単核細胞の精製が含まれますが、これらに限定されません。このプロトコルのいくつかの重要なステップは、選別されたpDCの高い生存率と純度を確保することです。最初の重要なステップは、骨からの骨髄の放出です。骨髄細胞への損傷を最小限に抑えるには、骨を砕くのではなく、骨をそっと割って乳棒をかき混ぜることが重要です。2番目の重要なステップは、密度勾配培地による単核細胞の濃縮です。細胞懸濁液をロードしながら、下相(密度勾配培地)と上相(細胞懸濁液)の間に明確な界面を確立することが重要です。遠心分離条件は、主に単核細胞を含むバフィーコート層の形成にも重要です。遠心分離後、骨片、赤血球、高密度好中球はバフィーコート層から除外され、チューブの底にとどまります。3番目の重要なステップは、細胞を蛍光結合抗体とともに低温(氷上または4°C)でインキュベートすることです。染色後、細胞を広範囲に洗浄して、細胞ソーター...

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開示事項

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著者らは、この論文の出版に関して利益相反がないことを宣言します。

謝辞

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フローサイトメトリーの中核施設の使用について、バージニアメリーランド獣医学部のフローサイトメトリー研究所に感謝します。この作業は、XMLのスタートアップファンドによって支援されました。XLは、生物医学および獣医学の大学院プログラムのスタンプフェローです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RPMI 1640gibco by life technologies11875-093
ウシ胎児血清HyCloneSH30396.03
ビン酸ナトリウムgibco by life technologies11360-070
MEM 非必須アミノ酸gibco by life technologies11140-050
HEPES gibco by life technologies15630-080
2-メルカプトエタノールgibco by Life Technologies21985-023
L-グルタミン ライフテクノロジーズによるgibco25030-164
ペニシリン-ストレプトマイシンライフサイエンステクノロジーズによるギブコ15140-122
1x ハンク'平衡塩溶液 ライフテクノロジーズによるgibco14175-079
MACS BSAストックソリューションMiltenyi Biotec130-091-376
MgCl2SIGMAM8266
DNase ISIGMAD4527
赤血球(RBC)溶解バッファー eBioscience00-4300-54
密度勾配中GE Healthcare17-1440-02Ficoll-Paque Plus 
抗マウス CD19-PEBD Pharmingen553786
抗マウス CD11c-PEeBioscience12-0114-82
抗マウス CD11b-APC-CY7BD Pharmingen557657
抗マウス PDCA-1-FITCeBioscience11-3172-81
抗マウス B220-V500 BD Pharmingen561226
DAPIinvitrogenD3571
形質細胞様樹状細胞単離キット II, マウスMiltenyi Biotec130-092-786
BD FACSAria I フローサイトメーター BDバイオサイエンス643178
BD FACS ディーバ バージョン6BDバイオサイエンス
ピル

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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