腎内注射大腸菌腎盂腎炎のラットモデル

サマリー

この原稿は、腎盂への大腸菌による直接腎内感染を使用した腎盂腎炎のラット手術モデルについて説明しています。この実験手順は、腎盂腎炎の病因だけでなく、関連する炎症や線維症の研究にも利用できます。

要約

腎盂腎炎は腎臓の細菌感染症であり、最も一般的には大腸菌によって引き起こされます。感染症の再発は、重大な腎の炎症や線維化を引き起こし、最終的には腎機能の低下を引き起こす可能性があります。腎盂腎炎の臨床管理と予防を改善する前に、進行、再発、および治療効果のメカニズムを研究するために、信頼性の高い動物モデルを確立する必要があります。経尿道的感染モデルは、ヒト腎盂腎炎によく似ていますが、細菌を腎臓に輸送するために尿道逆流に依存しているため、かなりのばらつきを示します。本明細書では、ラット腎盂への細菌注射を実施するための詳細な外科的プロトコルが提供され、非侵襲的磁気共鳴画像法(MRI)によって確認される。このプロトコルを使用して、動物は所望の濃度の大腸菌に直接曝露され、適切な術後ケアで外科的処置から完全に回復することができます。これにより、生理食塩水(偽)コントロールとの比較のための実験動物モデルのその後の縦断的MRI評価が容易になります。この直接送達アプローチを使用すると、感染の重症度を制御し、進行のメカニズム研究や新しい治療戦略の開発に適用できます。

概要

齧歯類モデルは、腎盂腎炎および尿路感染症（UTI）を含む多数のヒト疾患の症状を研究するために使用されている。 UTIは世界的な健康問題であり、すべての年齢の子供、男性、および女性に影響を与える可能性があります。 ^1、2、3のUTIの初期症状は、膀胱炎を含む、感染は尿管に沿って上昇した場合、腎臓感染（腎盂腎炎）が続いてもよいです。同時に、糖尿病の罹患率は世界中で4億人に達しています。 ^4、5重要なことに、UTIの発生率がアップ肥満であるか、または再発性UTI感染（rUTI）、敗血症、腎盂腎炎から腎線維症、及び膀胱機能不全の危険性の増大をもたらす、2型糖尿病を有する患者の4倍であることができます。 ^6、7、8げっ歯類現在の抗生物質療法はUTI患者のサブセットにおいてのみ持続的かつ予防的応答を生じるため、モデルはUTIの研究において重要である。臨床UTIケアを改善するために、主要なステップは、急性感染から炎症、線維症へのrUTIおよびその病態生理学的プロセスのメカニズムならびに2型糖尿病の影響を理解することである。

動物モデルを改善する目的は、疾患の進行および治療的介入のより正確な評価を可能にする技術を開発することである。ラットおよび/またはマウスにおいて、腎臓損傷の病態生理学、抗生物質治療の効果、およびUTIの自然経過の他の側面を研究するために、腎盂腎炎を誘発するためにいくつかの異なるアプローチが用いられてきた。逆行性UTIを確立するための一般的なアプローチは経尿道カテーテル法である。 ^{10、11、12、13 <}この方法は、麻酔した動物の膀胱に尿道を介して細菌を導入する。この技術はヒト腎盂腎炎と非常によく似ていますが、腎盂腎炎感染の実際の発生率と規模は、接種中または直後の自然尿管逆流または尿排尿の欠如を含む複数の要因のため、 ¹¹その結果、昇順腎盂腎炎の感染を誘導する実験的な変動は、腎臓の感染症などの治療戦略を研究するために、このモデルの有用性を制限することができます。

この報告では、 大腸菌をラット腎臓に直接注射する外科的腎盂腎炎ラットモデルが記載されている。このラットモデルが侵襲的であるにもかかわらず、腎臓に送達される大腸菌の量は効果的に制御され、強力な腎臓感染および炎症を可能にする。 ¹⁴この手順の中で、我々はまた、記述これらの誘発された腎臓感染を、生体内磁気共鳴画像法（MRI）で縦方向にどのように監視することができるかを示す。

プロトコル

すべての動物実験は、Case Western Reserve Universityで承認された動物実験および使用委員会（IACUC）のプロトコールに従って実施した。以下に記載される外科的処置の持続時間は、約45〜60分である。 MRI手順自体は、各時点で約15分である。

1.麻酔

1. 注射可能な麻酔を腹腔内投与する前に、動物の取り扱いおよび拘束を容易にするために、イソフルランチャンバーを酸素と混合した2％イソフルランでラットを麻酔する。
2. イソフルランに3〜5分間暴露した後、動物が麻酔され、つま先にピンチに反応しないことを確認する。
3. キシラジンとケタミンの混合物の腹腔内注射：75mg / kgケタミン/ 10mg / kgキシラジンを用いてラットをさらに鎮静させる。腹腔内注射を行う際には、腸やその他の重要な器官の一部に穿刺されていないことを確認するために針を引き戻します。
4. 私切開部位に2mg / kgのブピバカインを皮下投与して、局所的な痛みを軽減する。

2.外科手術領域の準備

1. 外科用器具および消耗品を手術前に滅菌し、滅菌のために外科用パッド上に配置する。ほとんどの器具および消耗品は、オートクレーブして再使用することができます。
2. すべての外科手術に無菌手袋を使用する。
3. 動物の右側から毛皮を剃るために電気かみそりを使用してください。胸郭の底から後ろの脚の上まで動物を剃り、切開のための大きなヘアフリーエリアを提供する。
4. 消毒された外科用パッドの上に動物を置き、消毒された領域を周囲の領域から隔離する。
5. ポビドンヨードやベタジンなどの消毒剤で皮膚を擦る。手術部位の中心でスクラビングを開始し、円形に外側に移動する。ポビドンヨードまたはベタジンの新しいワイプで少なくとも3回繰り返します。
6. 皮膚が透明になるまで、70％のアルコール綿棒で手術部位を擦る。ヨウ素が吸収されると毒性を示すことがある。

3.手術手順

1. 無菌条件下でこの手順を維持する。
2. 麻酔した動物を暖かい床の上に置いて、右腹を上にして左臥位にする。
   注：低体温を防ぐために、動物の中核体温を35〜37℃に維持するように注意する必要があります。この加温ベッドは、無菌状態を維持するために必要に応じて滅菌する必要があります。
3. 胸郭のために感じ、胸郭の底部から始まる滅菌されたサイズ10のメスの刃を使用して、右後部背部の腹腔内の小さな2〜3cmの切開を行う。
4. 切開の両側に滅菌ガーゼを縦に置きます。
5. 腹腔を視覚化してアクセスするために、皮下組織、脂肪、および筋肉を切除する。湾曲した羽毛のはさみを使用してより深く浸透させる傷口に入れ、厚い組織を切る。
6. 肝臓がはっきりと見えてアクセス可能になったら、鈍い鉗子を用いて肝臓を上方に収縮させる。
7. 一方、鈍い鉗子の別のペアを使用して、それは腹腔のすぐ外に座るように右の腎臓を公開する。
8. 腎臓を所定の位置に保持するには、指の指と左手の親指を使用します。右手でゆっくりとしっかりとゆっくりと着実に滅菌注射器からUTI89 大腸菌溶液（濃度は1 x 10 ⁸ -1 x 10 ⁹ ）を腎盂（白い泡として現れる）に注入する¹⁵ 。
   注：参考文献^15に記載されているように、細菌力価を調製する。
9. 腹膜への接種物の流出を防ぐために、吸収性止血剤のストリップを針の上に置く。ゆっくりと腎盂から針を抜き取る。
   注：周辺組織に穴をあけたり感染させたりしないでください。その結果、標的外の感染が起こりますオンザ及び/又は合併症を引き起こす。
10. 大型注射器を使用して腹腔内に戻す前に、腎臓を生理食塩水で十分にすすいでください。

4.縫合

注：組織に埋め込まれる縫合糸は、4-0の非吸収性編組縫合糸でなければなりません。身体表面に吸収性またはモノフィラメント縫合糸を使用することができる。

1. 血流の閉塞を防ぐために、縫合糸をできるだけ均等に、組織の縁の近くに置く。典型的には縁から0.3cm以下が必要である。
2. 皮膚をつかみ、細かい歯の鉗子を使って軽く傷つけ、針のホルダーを回して皮膚を刺す準備をします。
3. 手首を動かして針を回転させ、皮膚に通すことによって、皮膚の全厚を通して針を駆動する。
4. プロシージャを実行する個人に最も近いスキンエッジに対してこのプロセスを繰り返します。
5. 締める組織の縁に十分に縫合することができる。どんなに硬くても、血液供給が遅くなり、創傷治癒が遅くなり、裂開することになります。
6. 短い鎖だけが切断され、約3〜4 mmの尾を残すことを除いて、単純な中断された縫い目のように、正方形の結び目を使用して縫合糸を結ぶ。
7. 最初のステッチを締め込んだ後、最初のステッチを約3mm離して準備し、実行中の縫合を続けます。
8. 切開の終わりに達すると、最後のステッチを完全に引っ張らないでください。代わりに、ここではニードルホルダーで保持されているループを短いストランドとして使用して、縫合閉鎖の遠位端を結ぶ。
9. 器具の結び目を使用して、正方形の結び目を使用して縫合糸を結びます。これにより、3つのストランドが遠位端の完成した結び目から突き出てしまう。

5.動物の回復

1. 手術後に麻酔を逆行させるために、2.1mg / kgヨヒンビンを腹腔内に注射する。 A3~5時間後に外科処置から完全に回復することが期待される。
2. 動物は暖房パッド（低体温症を避けるため）と吸収剤の柔らかい寝具の手術後に保管してください。
3. 通常の授乳に戻るまで（24時間以内）、経口または非経口の液体で再水和を行います。脱水効果を制限するために、手術直後に約0.6mlの生理食塩水溶液を腹膜内に注射する。
4. IACUCが承認したAnimal Care and Use Protocolに記載されているように鎮痛剤を提供する。疼痛管理のために皮下に5mg / kgのカルプロフェンを注射する。
5. 腫れ、滲出、痛み、裂開のために定期的に切開を監視する。

磁気共鳴イメージング経由 6.検証

1. ハイフィールド小動物MRIスキャナーで生体内 MRI実験を行う。
2. 麻酔を酸素中のイソフルラン3％で行い、MRIスキャナー内のアイソセンタで適切な腎臓に動物を配置し、適切にするラジオ周波数のコイルを食べた。動物にノセコンを介して連続的に1％〜2％のイソフルラン麻酔を与える。
   注記： 図1に示すインビボ MRI画像では、ラットサイズのボリュームコイル（内径= 72mm）を利用した。
3. 各動物の呼吸速度（40〜60呼吸/分）および中核体温（35±1℃）を維持するために、動物監視および制御システムを使用する。
4. 感染した腎臓とコントロール腎臓の両方の高分解能、軸方向のT2強調画像を得るには、マルチスライス、マルチエコースピンエコーMRI撮影を使用します。典型的なMRI取得パラメータは、反復時間= 5000msec、エコー時間= 40msec、スライス厚さ= 2.0mm、面内空間分解能=200μm、3つの信号平均、および8分間の取得時間である。

結果

医療画像技術は、非侵襲的にUTIおよび治療効果を評価する機会を提供する。したがって、MRIを利用して、1〜2×10 ⁷個のUTI89 大腸菌の注射後の急性感染の誘導を確認し、手術前後の腎臓の変化を視覚化した。 図1a-bは、腎臓感染の漸増領域（黄色の矢印）を示す。感染後1および4日目に各動物について得られたMRI画像は、急性腎盂腎炎感染の成長を特徴付けるのに役立つ。

図1：軸T1加重MRIの大腸菌からの画像- （A）1日目に腎盂腎炎の齧歯類モデルを誘導し、（b）は、4日目、感染後（黄色矢印）。

ディスカッション

げっ歯類（すなわち、マウスおよびラット）における急性腎盂腎炎の上昇は経尿道カテーテル法によって生じ得る。それは上昇感染症の非侵襲的および模倣ヒト病態である^{16、17、18、}この経尿道感染法が有利です。 ^{17、18、19、20しかし} 、この方法はまた、不規則な感染率及びこのような排尿および解剖学的変化のような生理学的限界に腎臓に投与可変大腸菌から受けることができます。 ¹¹ Fierer et al。 （1971）は、 大腸菌を膀胱に注入した後に腎盂腎炎の証拠を示す40匹中6匹（15...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
吸収パッド	フィ	ッシャー14-127-47
綿ガーゼパッド	フィ	ッシャー22-415-469
ラテックス手術用手袋	リーシャインアニマルヘルス	21540
湾曲メイヨーハサミ	ッシャーS17341
ストレートブラントフォレセップ	スフィ	ッシャー08-895
メスハンドル	フィッシャー	08-913-5
滅菌メスブレード	フィッシャー	53220
1 ml ルアーロック シリンジ	BD バイオサイエンス	309628	細菌注射用
20 ml ルアーロック シリンジ	BD Biosciences	301031	生理食塩水洗浄用
Hemostat	Seneca Medical	240267
23 G 3/4 in.針	BDバイオサイエンス	305143
30 G 1インチ針	BDバイオサイエンス305128
U-100インスリンシリンジ	エクセルインターナショナル	25846	薬の注射のために
イソフルラン	ヘンリー シャイン 動物の健康	050033
キシラジン	ヘンリー シャイン 動物の健康	33197	IP
ケタミン	パターソン 動物を注射する	07-881-9413	IP
ヨヒンビン(アチパメゾール)	パターソン動物注射	07-867-7097	手術後にIPを注入
ブピバカイン(マルカイン)	Patterson Vetrinary	07-890-4584	切開部位にSQを注入
4-0 クロミック腸縫合	Ethicon Inc.	U203H
4-0 ブレードビクリル縫合糸	エチコン株式会社	J304H
1 ml SubQ シリンジ	BD バイオサイエンス	309597
E. coli UTI89またはCFT073	ATCC	700928
Surgicel Absorbable Hemostat	Ethicon Inc.	ETH1951CS
Biospec 9.4T MRI	ブルカー	94/20 USR

滅菌ヘンフィ糸