方法論記事

細菌の付着と血清抵抗性ビトロネクチンの役割を研究するための試金

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DOI：

10.3791/54653

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2018年10月16日

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Microbiology, Department of Translational Medicine, Lund University, 2Department of Molecular Biology, Umea University

この記事について

サマリー

このレポートでは、細菌の外膜タンパク質とひと補体レギュレータ ビトロネクチンの相互作用を特徴付けるためのプロトコルについて説明します。この結合反応およびビトロネクチン値の任意の細菌種の生物学的機能を研究するプロトコルを使用できます。

要約

細菌はホストの免疫反応を回避するための手段として補完するレギュレータを利用します。ここでは、ホストの免疫抵抗性の細菌の細胞の表面の再生の役割ビトロネクチン獲得を評価するためのプロトコルについて述べる。流れの cytometry の実験は、ヘモフィルスタイプ f の受容器の細菌外膜蛋白 H のリガンドとしてひと血漿ビトロネクチンを識別されます。酵素抗体法を用いて精製組換え蛋白質 H とビトロネクチン、蛋白質蛋白質の相互作用を特徴付けるし、バイオ層干渉法を用いて評価した結合親和性。正常およびビトロネクチン枯渇のひと血清で血清抵抗試金を使用してホストの免疫の回避の細菌の細胞表面タンパク質 H ビトロネクチンのバインディングの生物学的重要性を確認した.グラム染色に続いてビトロネクチン コーティングなしとスライド ガラスを使って細菌付着におけるビトロネクチンの重要性を調べた。最後に、ヒトの肺胞上皮細胞膜に細菌の付着を調べた。ここで説明されているプロトコルは興味の任意の細菌種の研究に容易に適応することができます。

概要

ビトロネクチン (Vn) は、線溶系の調節することによる恒常性の維持に関与する重要なひと糖です。Vn は 7 C5b6 複合体形成と C9 重合中に端末の補体経路を阻害することによって補完する調節因子としても機能します。いくつかの細菌性病原体は、抵抗補完沈着1,2,3の手段として細胞表面にヴァイオリンを募集する示されています。また、Vn は病原体2,4、5の内面化とホスト上皮細胞受容体、それによって促進付着細菌の「サンドイッチ」分子として機能します。Vn のバクテリアの細胞表面へのバインドは、他の現在正体不明の蛋白質によって媒介されます。完全にホースの免疫の回避で Vn バインディングの機能的役割の解明が必要になります (ヴァイオリン) 募集タンパク質の同定。

Vn 結合蛋白質を識別するに最初のステップは、関心の病原体は精製フローサイトメトリー ヴァイオリンをバインドできるかどうかをテストするのには、Vn が病原体のセルにバインドされているかどうかを決定するための便利で簡単な方法です。本研究では様々 な

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プロトコル

1. 細菌の表面タンパク質のリガンドとしてベトナムの解析

  1. フローサイトメトリーを用いた細菌の表面で Vn 結合の検出
    注意: フローサイトメトリーでを使用して前方散乱、側方散乱肯定的なイベントのゲートへ。Vn との相互作用を調べる Hif 臨床分離 (n = 10)エシェリヒア属大腸菌BL21 と共に選ばれた7 (DE3) (図 1A) のネガティブ コントロールとして。
    1. 文化 Hif 臨床は、10 μ G/ml NAD と 200 rpm で振とうしながら 37 ° C でヘミン培脳心臓注入 (BHI) で分離されます。大腸菌14の文化へルリア ベルターニカミラ培地を使用します。中間ログ段階で Hif を収穫 (外径600 0.3 =)15、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の pH 7.2, 1% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) (ブロック バッファーを含む内の細菌を再停止しなさいとPBS-BSA)。10 にサスペンションを調整9 CFU/mL。
    2. 5 x 106 5 mL ポリスチレ....

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結果

細菌の表面に Vn バインディングは、フローサイトメトリーによって決定されました。すべて Hif 臨床分離株におけるテストは、細胞表面に Vn を採用しました。大腸菌陰性対照ひずみ (図 1A)、Vn 細胞表面との相互作用はみられませんでした。図 1Bに示すように、PH は表面 Hif 細胞の主要な Vn 結合蛋白質。WT Hif ひずみによるベトナムのバインド M10 シフトを引き起こしました、人口で一方 Hif M10Δlph Vn がバインドされないコントロールに同じような出現します。

PH と Vn の蛋白質蛋白質の相互作用は、elisa 法とバリで推定されました。人的要因 H、Vn、C4BP とバインドする許された組換え .......

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ディスカッション

細菌性病原体は、細胞表面に Vn を募集し、補足物の要因の成膜および膜の攻撃の複合体2の完了を防ぐためにこの補完するレギュレータを利用します。Vn は、上皮細胞の表面に付着し、その後内面化を仲介する病原体ができ細菌の表面タンパク質とホスト細胞の表面の受容器、ブリッジの分子としても機能します。本研究では血清抵抗性および強化を提供する i) へのバインド (ヴァイオリン) の細菌細胞、ii) 蛋白質蛋白質の相互作用および親和性定数の表面および iii) Vn の機能的役割を推定するためのプロトコルについて述べる宿主細胞の表面に付着します。

フローサイトメトリーは、Vn を細菌にバインドを検証する一般的に使用される量的手法です。ただし、Vn 濃度を最適化する必要が、Vn 結合容量 (と種々 の受容体) は菌種によって異なることが。ここで説明アッセイ、1-100 μ g/mL (ヴァイオリン) の線形結合と彩度パラメーターを推定する使用されました。WT Hif のバインドのパターン、Hif M10Δlph変異陰性対照.......

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開示事項

著者は金融利益相反があります。

謝辞

この作品は、アンナの財団とエドウィン ・ ベルガー、Lars Hierta、o. e.、Edla ・ ヨハンソン財団、スウェーデン医学研究評議会からの補助金によって支えられた (許可番号 K2015 57 X-03163-43-4、www.vr.se)、大学でがん財団マルメ ・家庭的社会 (性の基礎) とスコーネ郡評議会の研究・開発財団の病院。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL サーモミクスターEppendorf5355ドライブロック加熱および冷却シェーカー
5 mL ポリスチレン丸底チューブ BD Falcon60819-13812 × 75 mm スタイル
5% CO2 供給インキュベーター サーモサイエンティフィック 
6mLポリスチレン丸底チューブ VWR89000-47812 × 75 mm スタイル キャップ付き
24 ウェルプレートBD ファルコン08-772-1H細胞培養グレード
30% 過酸化水素 (H2O2) 溶液Sigma-AldrichH1009-100MLラボ分析グレード
75 cm2 組織培養フラスコBD ファルコンBD353136 ベント
96ウェルブラックフラットボトムプレートGreiner Bio-One655090培養処理&マイクロ;透明な黒色のプレート
A549 細胞株ヒトSigma-Aldrich86012804-1VL
細胞剥離酵素 (Accutase) Sigma-AldrichA6964-500ML細胞培養グレード
AR2G センサーPall Life Science18-5095アミノカップリングによる固定化タンパク質へのセンサー 
アセトンVWR97064-786分析グレードの
ウシ血清アルブミン(BSA)Sigma-AldrichA2058培養に適した
ビビュラスペーパー VWR28511-007
バイオ層干渉計ポールライフサイエンスFB-50258二層干渉計 測定装置
クリスタルバイオレット溶液Sigma-AldrichHT90132-1L
C4BP (C4b binding protein)Complement Technology, Inc.A109冷凍液体形態として購入
塩化カルシウム (CaCl2)Sigma-AldrichC5670-500G
カルボルフクシン溶液Sigma-AldrichHT8018-250ML
クエン酸Sigma-Aldrich251275-500Gアメリカ化学会 (ACS) グレードの
脱色液Sigma-Aldrich75482-250ML-F
E. coli host (E. coli BL21)Novagen69450-3Protein expression host
F12 mediumSigma-AldrichD6421Cell Culture Grade Flow cytometer
 BD Biosciences651154研究用途向けの細胞解析グレード 
ウシ胎児血清(FCS)Sigma-Aldrich12003C細胞培養に適した
正常ヒト血清(NHS)Complement Technology, Inc.NHSPooled human serum
FITC-conjugated donkey anti-sheep anti-diesbodies AbD セロテックSTAR88Fポリクローナル
ゲンタマイシンSigma-AldrichG1397細胞培養グレード
グルコースSigma-AldrichG8270-1KG
ゼラチンSigma-AldrichG9391細胞培養に適した
血球計算盤マリエンフェルド640210
HRP標識抗Hisタグ抗体アブカムab1269ポリクローナル
ヒト因子HComplement Technology, Inc.A137
C4BPComplement Technology, Inc.A109凍結溶液
ヒト血清アルブミンSigma-AldrichA1653-10G凍結乾燥粉末
ヒスチジンアフィニティー樹脂カラム (HisTrap HP)GE Health Care Life Science17-5247-01Ni セファロー
His-タグ付きPH研究室で再組換え発現および精製された
ウ素溶液Sigma-AldrichHT902-8FOZ
メタノールVWRBDH1135-1LP分析グレード
 顕微鏡オリンパスIX73倒立顕微鏡
顕微鏡スライドSigma-AldrichS8902プレーン、サイズ 25 mm × 75 mm 
塩化マグネシウム (MgCl2)Sigma-AldrichM8266-1KG
バックボーンに C 末端 6x His-tag を含む プラスミド (pET26(b))Novagen69862-3DNA vector
Polysorb microtitre plates ELISAシグマ-アルドリッチM9410
グマ-アルドリッチ6009アメリカ化学会(ACS)グレード
羊抗ヒトVn抗体AbDセロテックAHP396ポリクローナル
シェーカー Stuart ScientificSTR6プラットフォームシェーカー
組織培養フラスコBD Falcon317516775 cm2
> サーモミキサー Sigma-AldrichT3317ドライバック加熱および冷却シェーカー
テトラメチルベンジジンSigma-Aldrich860336-100MGELISAグレード
ヒト血漿からのビトロネクチン(Vn)Sigma-AldrichV8379-50UG細胞培養グレード
BBD6220組織細胞 から冷凍液体として購入ス を充填したカラム 当社のヨ水酸化カリウム(KOH)用シ

参考文献

  1. Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
  2. Hallstrom, T., et al.

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タグ

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