方法論記事

生きているバイオ フィルムにおける電子輸送特性評価

DOI：

10.3791/54671

⸱

2018年6月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory, 2George Mason University, 3Chemistry Division, Naval Research Laboratory, 4Departments of Physics, Biological Sciences, and Chemistry, University of Southern California, 5Department of Chemical Engineering and Materials Science, Michigan State University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生理学的に関連する条件の下で生きている細菌によるバイオ フィルムの電気伝導率測定のためのプロトコルが表示されます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここで関連する生理学的条件下で電極成長細菌によるバイオ フィルムの電気伝導性を特徴付けるために使用して電気化学的ゲーティング法を示します。1これらの測定値は水溶液中にソースを使用して生きているバイオ フィルムに対して実行され、ドレイン電極の櫛型電極 (IDA) 配列と呼ばれる特殊な構成でガラス表面のパターンします。バイオ フィルムは、ソースとドレインを接続するギャップを横切っている栽培されています。電位 (ESと ED) 電極に適用される電極間バイオ フィルム (ISD) ソース ・ ドレイン間の電流を生成します。ゲート電位に電気伝導度の依存性 (EGソース ・ ドレイン電位の平均値 = [ED + ES]/2) 体系的に潜在的なゲートを変更して結果のソース ・ ドレイン間の測定によって決定されます現在の。潜在的なゲートで導電性の依存関係は、機構調査中特定のバイオ フィルムの電気伝導率の基になる細胞外の電子輸送過程についてを説明します。ここで説明、電気化学的測定法の基づく M. S. Wrighton2,3と同僚と r. w. マレー4,5,6の同僚によって使用に直接1980 年の薄膜導電性高分子を調査します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞外の電子輸送 (EET) は特定の微生物の細胞内の代謝プロセスと不溶性の電子アクセプターやドナーから天然ミネラルを細胞外に存在する電子を輸送することができるプロセス電極。いくつかのケースでは、EET は、電極との直接接触ではなく細胞まだそれを利用できる代謝電子アクセプターやドナーとして、電極表面に導電性複数セル厚バイオ フィルムを形成する微生物を使用できます。7,8,9ストレージとリモート エネルギー生成不純物検出/除去、微生物ポリパラフェニレンなど様々 な用途のための電極触媒としてこのようなバイオ フィルムが注目されて ,10、11,12,13,14 のため微生物と微生物バイオ フィルムと比較しての耐久性によって実行される代謝過程の多様性酵素ベースの bioelectrodes。15,16また、EET 経路自然発生した電気制御または信号の変更に利用できる可能性がありますまたは、たとえば、目的の製品または検出の生産に関与する微生物の代謝過程を遺伝子組み換えターゲット analyte の刺激。他の生物学的材料から離れてそれらをセット、電極触媒のバイオ フィルムの電気伝導度は、電極触媒特性の中央部分で、まだ少しは電極では、基になる EET プロセスについて理解知られているが、競合の多い。17,18,19,20,21,22,23,24

櫛型電極アレイ (IDAs) を用いた生活、電極製のバイオ フィルムを通して電気伝導度を測定するため 2 電極法は、ここで説明しました。その結果の配列の両側に接続されているすべての他のバンドにフラットなガラス面に関連する並列長方形電極から成っている IDAs (ソースおよびドレイン) 2 つの電極の。慎重に審査、井田 (例えば、見なさい ref #1 の図 6.12b) 前後 2 つの電極を分離するアレイ全体を編む 1 つのギャップ形成するような方法で接続されている隣接するバンドを分離するギャップはまた明らかにします。結果は長くて狭いギャップ導電性材料が形成、キャスト、重合、または配列 (ここでは考慮するバイオ フィルムのタイプ) の場合成長してとき非常に高いソース-ドレイン電流を降伏、ソース ・ ドレイン電極を分離することです。さらに、電極のサイズが小さいが小さな背景する導電性材料の量が必要なので、潜在的なゲートの変更導電性材料の酸化状態の変化と静電容量の充電のために現在の結果します。IDAs を用いた測定はとても小さいです。井田ベースの技術は薄膜導電性ポリマーの特徴を開発電気化学的ゲーティング紹介、2,3,4,25はごく最近生きているシステムに適用されています。18生活バイオ フィルムの電気伝導度を測定するために使用する別の手法は、分割ソース ・ ドレイン電極とソース メートル潜在的なゲートを設定する大規模な形式を利用されています。26,27しかし、これらのメソッドに対する懸念が詳述されている以前。18

以下のプロトコルは、リビングの電気伝導度測定を行うと私たちの経験をカプセル化しますGeobacter sulfurreducensと biocathode の MCL バイオ フィルム。G. sulfurreducensは唯一代謝電子受容体として電極を含む不溶性材料を使用することができる有機体を減らすモデル電極です。また、陽極細胞外長距離電子移動の研究に理想的なモデル生物となって、複数のセルの長さ以上の電子を輸送することができるバイオ フィルムの厚さを形成します。我々 は、biocathode MCL, 底生微生物燃料電池のカソードから分離された好気性独立栄養混合コミュニティ バイオ フィルムの調査のための詳細も含めます。(3 つの主な成分- Marinobacter、 Chromatiaceaea 、 Labrenziaの名前) Biocathode MCL はその唯一の電子供与体として電極の酸化、複数のセルの長さで電子を運ぶことができることそれを勉強する興味深い防食システム。さらに、biocathode MCL が生活システムのこれらのメソッドを使用して日付への最も高い報告された伝導率です。このプロトコルではこれらの多様な電子活性バイオ フィルムの包含は、この方法がすべて生きているバイオ フィルムの電気電極と対話することを通して電子の輸送現象を計測に適用されることを強調するものです。

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プロトコル

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1. 櫛型電極アレイ (IDA) 準備

  1. 市販の井田に非導べ電性基板上に電極を取得またはそれらを合成平版の標準的な方法を使用して。28
    注: 井田寸法や材料変えることができるさまざまな実験に必要な条件に基づいて。IDAs はここで使用される商業的に得られ、配列の両端に大きな電極パッドに接続されているガラス基板上パターン 2 つの櫛型金電極から成っていた。電極は、大きい接触パッドに電極を接続するバス路線は薄い絶縁材料で被覆されている間にさらされています。IDAs 使用ここで 2 つの構成は、10 μ m 幅と 2 mm 長い金電極バンド (ソースおよびドレイン) のセットの間隔 5 μ m 離れてフラット ガラス表面の模様します。IDAs 使用ここ 65 電極対で (130 合計櫛型バンド) を持っていた。縞模様は、配列の両端の電極パッドに接続されます。
  2. ワイヤーし、井田を絶縁
    1. 導電性銀エポキシを使用して各大きな電極パッドにワイヤを接続します。
      1. (手順は製造元によって異なる場合があります) 混合の棒またはピペット チップの使用に特定のエポキシの製造元の指示に従って導電性エポキシを準備します。
      2. 実習テープを使ってその場でセキュリティで保護された金パッドごとに線を配置します。銀エポキシ混合ロッドまたはピペットの先端を使用してワイヤーとパッドをカバーします。
      3. 慎重に治療法や治療法の使用特定の導電性銀エポキシの製造元の推奨事項に基づいた 1 h の 80 ° C のオーブンに移動します。
      4. エポキシが硬化後は、マルチメータを使用ワイヤーの端とパッドの間の電気接続を確保します。ワイヤーとパッドの間の抵抗は、< 5 Ω をする必要があります。また、マルチメータを使用して、配列を短いこれ導電性エポキシは複数の電極パッドを接続なしを確認します。導電性エポキシが複数のリードを接続している場合は、スクライブを使用してリード線を切り離します。
    2. 熱、電気、および防水絶縁材料との接続をコーティングすることにより epoxied 接続を絶縁しなさい。難燃性ポリウレタン樹脂は、適しています。
      1. 絶縁材料の金型として (約 2.5 mL マーク) で 15 mL の円錐形遠心管の先端を取り外します。21 g の針を使用してを介して突出するワイヤーのための底の 2 つの小さい穴を作る。
      2. 金型と金型の下の穴からワイヤーに IDA を挿入します。
      3. 特定の絶縁材料を準備します。得られる特定の樹脂と共に提供された指示に従います。
      4. 銀エポキシが完全に、金型内に絶縁体をピペット (~2.5 mL) をカバーし、製造元の仕様に従って乾燥することができます。

2. 電気化学リアクターのセットアップ、テスト、および接種

  1. 電気化学セルを設定します。
    1. 井田、カウンター電極、参照電極を電気化学セルに挿入します。
      注: 電極のすべてが収まる限り、電気化学リアクターを使用することができます広く、異なります。1 つの考慮事項は、参照電極が作用電極に可能な限り近い与えられるべきこと原子炉の実用的な限界です。ここでは、電極から参照電極 2 ~ 3 cm 単室炉を使用します。また、対向電極は、それは、システムで制限されていませんように作用電極より大きくなければなりません。
    2. 純粋培養で作業する場合、内部カウンター電極が付いているリアクターを殺菌します。10 分と 10 分間滅菌脱イオン水 5 の漂白剤に浸漬した IDA を滅菌するために漂白剤に浸漬によって参照電極を殺菌しなさい s に続いて 10 の無菌純水原子炉に挿入する前に s。
    3. 滅菌中のバイオ フィルムの成長に最適な電気化学セルを入力します。G. sulfurreducens17,18, フマル酸を除く淡水媒体を使用します。Biocathode MCL、9人工海水培地を使用します。9
    4. Bipotentiostat に電極を接続します。カウンターのリードに作業鉛 1 井田電極、ワーキング リード 2 に他の井田電極、参照電極基準リードを対向電極を接続します。
  2. IDAs の電気化学的テスト。
    注: このテストの主な目的は、2 つの電極は電気的に絶縁を確認してくださいすることです。すべての電気化学的手法が、bipotentiostat を制御するために使用するソフトウェアで使用可能です。
    1. 適切な IDA 機能、bipotentiostat を使用するために (前のバイオ フィルムの成長) に、制御導電性テストを実行します。
      1. 1 分の各電極の開回路電位を測定。
        注: いくつかの楽器の開回路電位達成されなければならない定電流コレクション プログラムを使用して、電流を 0 に設定して mA。
      2. 電極 2 20 mV/s でサイクリックボルタンメトリー (彼女) 対 +0.6 V に 0.2 V 間 1 電極上の実行中の開回路電位を測定。
        注: 必要な場合他の境界と CV のスキャン料金を使用することがことができます。しかし、水素または酸素の生成につながる可能性を避けるため。
      3. 電気化学測定装置のソフトウェアを使用して履歴書の中に 2 電極で測定開回路電位が電極 1 の可能性を反映しないを確認します。
        注: 電極 2 の開回路電位を変更可能性がありますが、それは電極 1 の可能性の独立したする必要があります。
      4. 2 電極と電極 1 の開回路電位測定の可能性、制御を除いて 2.2.1.3 を通じて 2.2.1.1 手順を繰り返します。
    2. Bipotentiostat ソフトウェアを使用して関連するゲルロボットのバイオ フィルムの必要な成長の可能性に電極の可能性を設定します。たとえば、 Geobacter sulfurreducensまたは biocathode MCL の (彼女) 対 +0.31 V の 0.5 V (彼女) の対を使用します。
  3. 関連するゲルロボットのバイオ フィルムを成長します。
    1. 標準的な無菌微生物技術を使用して目的の電気化学的活性微生物のストックの文化/濃縮から電気化学リアクターを接種します。標準的なテストのために、1:20 で接種率 (原子炉ボリュームに接種) 外径600 = 0.5 文化。
    2. 必要なレベル (~ 200 rpm) とインキュベーターに原子炉で攪拌を設定/興味のバイオ フィルムの成長条件に基づいて所望の温度を水のお風呂。G. sulfurreducens、最適な成長のため、30 ° C を使用します。
    3. バイオの 2 つの電極を分離するギャップを埋めるまで、関心の糖化の特定の要件に基づいてシステムを孵化させなさい。定常のg. sulfurreducensバイオ フィルム、7 〜 10 日間孵化させなさい。Biocathode MCL、~ 7 日を孵化させなさい。それぞれのケースで 30 ° C に温度を制御します。

3. 電気化学的ゲーティング実験

  1. ゲート測定用電流-電位依存性を決定するため使用する実験的パラメーターを選択します。
    1. ゲート システムの潜在的な (EG) 曲線と (ISD) 伝導電流を取得する IDA に適用されますゲート電位の範囲を決定します。
      注: 可能な酸化還元活性を持つすべての電位は、ゲート電位検査の範囲がカバーするべき。興味のシステムに関する情報がない場合広い潜在的な範囲は使用される (+0.6 V 対彼女に-0.55) をする必要があります。調査の下でシステムに基づく範囲を微調整する試行錯誤手法を使用できます。潜在的なゲート、として定義されます。
      figure-protocol-1
      EDはドレイン電極の潜在性、ESはソース電極の潜在性。使用されるゲート電位の範囲は、要件および興味の特定のシステムの制限事項によって制限されます。18
      注: これらのプロセスは、バイオ フィルムを損傷することとして、酸素と水素の進化になりますソース ・ ドレイン電位を避けるべき。
    2. ソースからドレインにフィルムを通して電子輸送の原動力として使用、ソース ・ ドレイン間電圧 (VSD) を決定します。ソース ・ ドレイン間電圧、として定義されます。
      figure-protocol-2
      注:、VSDに比例して私のSDは、ソース ・ ドレイン間電圧を十分に小さくなければなりません。17
    3. EGはシステムで各ゲート電位の定常状態で近似できるので、私はSDの独立した時間と線形変更されたスキャン レート (v) を選択します。
      注: より小さい 0.002 V/秒のスキャン レートは生物学的システムのよく使用されます。29,30
    4. ゲートの測定を実行する bipotentiostat ソフトウェアをセットアップ (すなわち掃引ゲート潜在的な) 選択範囲、選択したソース ・ ドレイン間電圧、上記の考慮事項に基づいて目的のスキャン率。
      注: g. sulfurreducens、17,19 EGを使用した前のゲート測定の (彼女)、対 0.6 V まで-0.55 V = VSD = 0.01 V または 0.1 V、v = 0.001 V/s。EG Biocathode MCL の = 0.25 V (彼女)、対 0.7 V を VSD = 0.002 V は、v = 0.0002 V/s。
      1. さらに、VSDとベースライン測定を実行 = 0.000 V (すなわち、同時に撮影した各個々 の電極で CV) 3.1.3 のステップで選択した同じ v で。
    5. 3.1.4 (水溶性の電子供与体と受容体の存在) の両方の売り上げ高の下で条件と非回転率 (水溶性電子供与体や受容体) なしの条件を使用してゲートの測定を実行します。
      注: 非回転条件が有利な測定は酸化や細胞代謝の可溶性化合物の還元によって隠されていないので後使用条件に関係なく同様の結果を得ることが必要バック グラウンド電流 (3.1.8 の詳細) を減算します。
      1. 電極の細菌の増殖の使用として同じ原子炉媒体を使用して売り上げ高の条件を達成します。この媒体には、 g. sulfurreducens、17またはアクセプター Biocathode MCL の酸素などの酢酸などの水溶性の電子供与体が含まれています。
      2. 水溶性電子ドナーやアクセプタを省略すると、同じの原子炉媒体を除き、電極の細菌の増殖に使用することによって非回転条件を達成します。ポテンショスタットがオフであることを確認、したら無菌培地を削除し、陽極システム用電子供与体やカソード用アクセプターなし新鮮な培地で追加します。また、連続的な流れのシステムはゆっくりと nonturnover 条件の目的の中でメディアの交換を設定できます。
        注: 場合、酸素 (biocathode MCL) は水溶性の電子アクセプター、sparge ~ 15% CO2と 85% N2 (または媒体で正しい pH を維持するガスの混合物) の混在するシステム。
    6. ゲートの測定が完了したら、再 (2.2.2 と同じ値を使用して) を安定させるためのシステムを許可するように潜在的な成長に戻る各電極の電位を設定するのにポテンシオスタット ソフトウェアを使用します。
    7. 上記のすべての条件が満たされた場合 (私SD v とは無関係ですが、VSDに比例) 前述31として次の方程式を用いた電気伝導SD値を変換私
      figure-protocol-3
      figure-protocol-4
    8. ここで G はコンダクタンスと S スケール ファクターはシステムに依存し、電極サイズ、ギャップ サイズ、およびバイオ フィルムの高さなどの変数の要因です。特定のシステムは、あらかじめ決められた方程式から S を決定できます。31また、S で計算できます数値モデリング ソフトウェア詳細として以前。17
    9. 形状と伝導電流の大きさを識別するためにバック グラウンド電流を減算します。VSDで発生する電流を引くか =0.00 V VSDで生成された、現在から 0.01 V または VSDで生成する現在のソースからドレインを電流を引く削除いずれかメソッド バック グラウンド電流で、残して (動) 0.01伝導の電流だけ。
  2. 温度依存の電気化学的ゲーティング測定
    1. 興味の温度の範囲を決定します。この範囲、しかし生理学的関連性の高い温度を使用する必要があります調査の下でシステムに大きく依存。
      注: 以前の研究は中温微生物の生理学的条件下での電子輸送の研究に 10 ° C ~ 30 ° C の温度範囲を使用しています。17
    2. 循環式水槽や原子炉温度とセット ポイントと媒体の実際の温度が同じであることを確認するコントロールの原子炉を規制するインキュベーターを取得します。
      1. 井田はどこにある温度計か熱電対を制御原子炉に配置します。
    3. 私の売り上げ高の下で選択した温度および nonturnover (3.1.5 の手順で説明します) の範囲 (3.1.4 参照)SD測定を行う条件を以下の 2 つの手順のいずれか、次の bipotentiostat を使用します。
      1. (3.1 参照)、上記私の EG曲線対SDを生成興味の温度範囲にわたって各温度の。G. sulfurreducensと Biocathode MCL, 各温度からピーク電流を使用して、私の T 依存性対SDを決定など、導電性酸化還元を展示材料。
        注: このメソッドは、完全私 EG対SDは各温度のカーブが、2 番目のオプションより多くの時間を必要がありますを生成する使用は。
      2. 代わりに、設定を押し実施の最大の収穫で潜在的なゲート IDA 現在、bipotentiostat を使用して (私のSDから得られる対 EGカーブ、ステップ 3.1.4) しながら bipotentiostat を使用して最大の伝導電流を記録温度が温度水浴やインキュベーターのオンボードのコントロールを使用して選択範囲内の循環します。
        注: ここでは、電極/原子炉ジオメトリを持つ私SDと T が安定するまで少なくとも 20 分・平均私はSDを安定のため、各温度に使用されます。もっとまたはより少なく安定時間必要があります特定のシステムに基づきます。このメソッドは、最初のものより高速ですし、バイオ フィルムに少ないストレスの原因します。ただし、完全ゲーティング曲線は生成されません。
      3. 他に 1 つのセット ポイントから温度をサイクルし、オンボードのコントロールを使用して、再度バックアップ孵卵器の温度を確保することへの反応の可逆性を決定するため風呂の水循環に害のないバイオ フィルム。
    4. インキュベーターまたは水浴のオンボードのコントロールを使用して正常な成長温度に温度をリセットでき、システムを安定させます。
      注: 酸化還元コンダクターの私のSDと 1/T のデータが適合するアレニウス率式で次のように活性化エネルギーの計算を可能にします。
      figure-protocol-5
      figure-protocol-6
      場所 E、隣接する酸化還元補因子とkとの間の電子移動の活性化エネルギーはボルツマン定数。

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結果

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IDAs いた有線、絶縁および 2 つの電極がお互い (図 1) から電気的に絶縁を確認するテストします。原子炉完成、 g. sulfurreducens、接種、バイオ フィルム、電極間のギャップを橋渡しするまでインキュベートしました。G. sulfurreducensバイオ フィルムは配列をカバーすることを視覚的に見ることができます。他のバイオ フィルムは、研究者は 2 つの電極を電気的に接続されているかどうかを電気化学的ゲーティング測定を行う必要があります。配列の電極との間の接続を確認する顕微鏡を使用もする必要があります。電気化学的ゲーティング実験は EG (図 2) 私はSDの依存性を決定するため行われました。生活映画の伝導性ゲーティングの実験で測定実施の電流を使用して計算されます。精度とこれらの測定値の精度が高い信号対雑音比井田構成可能のため高かった。私はS...

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ディスカッション

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IDA のセットアップ中に、ソースとドレインを短絡していない一緒に電気化学のゲート計測前に EGカーブ対私にSDを変えるし、誤った結果と解釈につながるテストに不可欠です。また、現在が線形的 VSDに依存し、v の独立になるよう VSDと v を選択する重要です。そうでない場合は、伝導率を計算する上記方程式を利用することはできません。

少なくとも 2 つのバック グラウンド電流を考慮、電流計測を実施から削除する必要があります。最初のゲートの電位を掃引として酸化還元補因子のファラデー充電/放電のため現在の背景です。レドックスの電極表面に接続されている電気的アクセスされる補因子の量現在背景が大きく影響します。第二の背景現在、二重層キャパシタです。現在 3 番目のバック グラウンドは、代謝電子アクセプタ/ドナー細胞の売り上げ高によるものです。この背景の現在のみ売り上げ高条件の下で適用されます。本研究ではバック グラウンド電流が VSDで得られた電流から現在のソースを減算することによ...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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M.D.Y、S.M.G S と主張を認める、海軍研究局 (賞 #N0001415WX01038 ・ N0001415WX00195)、海軍研究所と海軍研究所ナノサイエンス研究所M.Y.E. N米国部門のエネルギー付与デ-FG02-13ER16415 はサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
IDAsCHインスツルメンツ012125ALS-Japan製 販売元 CHインスツルメンツ
WireDigikeyW7-ND
導電性銀エポキシ電子顕微鏡科学12670-EE
絶縁材料3M2131-Bスコッチャスト難燃剤
15mL 円錐形遠心管VWR89004-368
21g針VWRBD-305165
5 mLピペットチップVWR82018-842
5 mLピペットVWR89079-976
淡水媒体成分Sigma Aldrichすべての標準的な実験用化学薬品
   塩化
   リン酸ナトリウム一塩基性
   重曹
人工海水 中型成分Sigma Aldrichすべての標準的な実験室用化学薬品
   塩化
   塩化マグネシウム六水和物
   硫酸マグネシウム七水和物
   塩化
   重炭酸
   塩化カルシウム二水和物
   塩化
   リン酸カリウム二塩基性
Ag/AgCl参照電極BasiMF-2079
グラファイトロッド対電極電子顕微鏡科学70230
再循環水浴Thermo Scientific152-5256
BipotentiostatPine InstrumentsWD-20http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user
攪拌子VWR58947-114
G.硫黄還元剤培養ATCC51573
ジャケット付き原子炉松器械RRPG085
社 アンモニウムナトリウムカリウムナトリウムアンモニウム

参考文献

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