RNAの測定方法 N 6 -methyladenosine変更

Summary

N ⁶ -methyladenosine（メートル⁶ A）RNAに修飾を測定するための修正されたノーザンブロット法が記載されています。現在の方法は、様々な実験デザインの下で多様なRNAおよびコントロールで変更を検出することができます。

Abstract

N^RNAの6-メチルアデノシン(m⁶A)修飾は多様で、真核生物の間で遍在しています。mRNA、rRNA、tRNA、およびmicroRNAに存在します。最近の研究では、これらの可逆的なRNA修飾がRNAのスプライシング、翻訳、分解、および局在に影響を与えることが明らかになりました。概日リズム、幹細胞の多能性、線維症、トリグリセリド代謝、肥満などの複数の生理学的プロセスも、m⁶A修飾によって制御されます。免疫沈降/シーケンシング、質量分析、および改変ノーザンブロッティングは、m⁶A修飾を測定するために一般的に使用される方法の一部です。ここでは、^m6A修飾を測定するためのノースイースタンブロッティング技術を紹介します。現在のプロトコルは、RNAの良好なサイズ分離、さまざまな実験デザインのためのより良い適応と標準化、およびRNAのさまざまなソースにおける^m6A修飾の明確な描写を提供します。m⁶A修飾は、概日リズムと肥満に関連するヒトの生理機能に決定的な影響を与えることが知られていますが、他の(病的)生理学的状態におけるそれらの役割は不明です。したがって、m⁶A修飾の研究は、分子生理学に関する重要な洞察を提供する大きな可能性を秘めています。

Introduction

動的および可逆的なRNA修飾は、RNAの恒常性において重要な役割を果たしています。40年前、N6-メチルアデノシン(m⁶A)修飾は真核生物のトランスクリプトームに豊富に存在することがわかりました¹。メッセンジャーRNA(mRNA)、リボソームRNA(rRNA)、低分子核小体RNA、トランスファーRNA、マイクロ^RNA2において多様な機能を持っています。mRNAの^m6A修飾は、それらのスプライシング³、翻訳⁴、分解⁵、および局在²に影響を与える。さらに、それらはリボソームの生合成とマイクロRNA機能に影響を及ぼします⁶。RNAの^m6A修飾の進化的保存は、単細胞細菌から多^{細胞ヒト7}に見られます。m⁶Aの改造の役割の描写は、現在、広範な調査が行われています。この取り組みにより、転写制御に関する新たな知見が得られることが期待されます。最近の研究では、mRNA⁸の他の化学修飾もRNA代謝に重要な役割を果たしていることが明らかになっています。

概日リズム⁹、幹細胞多能性¹⁰、トリグリセリド代謝⁴、線維症¹¹、肥満¹²、大うつ病¹³は、m⁶A修飾が結果を制御することが知られているプロセスのいくつかの例です。多くの概日時計遺伝子転写産物は、m⁶A部位^{を有する 14}.m⁶Aメチラーゼまたはデメチラーゼの調節は概日周期の変化を誘発します¹⁵。Mettl3は、m⁶Aトランスフェラーゼであり、幹細胞の多能性を調節する因子です。Mettl3の欠損は、着床後のステージ¹⁰で早期の胚致死と異常な系統プライミングにつながります。脂肪細胞における脂肪量および肥満関連(FTO)であるm⁶Aデメチラーゼの欠乏は、Angptl4⁴の転写後調節を通じて脂肪酸の動員と体重に影響を与えます。これらの研究から、m⁶AはmRNAプロセシングを制御するだけでなく、発生学的な発生や病態生理学においても重要な役割を果たしていることが明らかになりました。m⁶A修飾の機能は、将来の治療上の考慮事項に影響を及ぼします。

RNA^16-18のm⁶A修飾を測定するために、いくつかの方法が利用可能です。伝統的に、薄層クロマトグラフィー(TLC)および高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、いくつかの^RNA19,20における^m6Aの分布を研究するために使用される。質量分析は、RNA中のm⁶A修飾を検出するための高感度なツールです。しかし、質量分析による分析²¹では、RNAをRNaseによって短い断片に切り出す必要がある。Methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing (m⁶A-Seq)²² は、断片化された RNA を m⁶A 特異的抗体で免疫沈降させ、並行して RNA シーケンシングを行います。この方法では、トランスクリプトーム幅の m⁶A ランドスケープが生成されます。m⁶A個別ヌクレオチド分解能架橋および免疫沈降(miCLIP)の高分解能マッピングは、さらに、単一ヌクレオチド分解能²³でのm⁶A修飾をマッピングする。どちらの方法も、特定の遺伝子の情報とともに、トランスクリプトーム全体にわたるm⁶A修飾の詳細を提供します。しかし、実験で複数の条件の比較が必要な場合、どちらの方法でも定量化や標準化は困難です。さらに、m⁶A-SeqのRNAの断片化は元のRNA構造を変化させ、これが天然の^m6Aレベルに影響を与える可能性があります。RNAの全体的なm⁶A修飾と異なる実験条件下でのそれらの変化を検出するために、修正されたノーザンブロッティングプロトコルを採用した方法を報告します。この方法では、ゲル電気泳動¹⁸を用いてRNAを分子量で分離します。この手順により、複数の条件またはサンプルが関与する実験の標準化と定量化が向上します。また、rRNA、mRNA、microRNAなど、さまざまなRNAに対する特定のm⁶A修飾情報も提供します。

Protocol

注^：6レベルのrRNA、mRNAの、および他の小RNAを含むトータルRNAメートル。リボソームRNAが豊富メートル⁶ Aの変更を持っているので、メートルの測定⁶ Aレベルは、この事実を考慮する必要があります。

1. RNAの単離

1. （ペーパータオル上に噴霧）リボヌクレアーゼ除染液を使用して、ピペットと実験台の表面を拭いてください。ヌクレアーゼフリー水で濡れた紙タオル、再びピペットおよび実験台の表面を拭いてください。
2. RNA抽出
   1. 全RNA単離
      1. オーバーヘッド撹拌機を用いて、4℃に維持し、RNA単離溶液1mLに組織の50~100ミリグラムまたは5~10×10 ⁶個^の細胞をホモジナイズします。
         注：その他の組織（100-150 mg）をため、その中に低いRNA濃度のマウスからの脂肪組織サンプルのために必要となる場合があります。サンプルは、マウスの心臓、肝臓、骨格筋、肺、脳から供給、およびマクロファージは、以前⁴採用されています。
      2. に室温で5分間、試料ホモジネートをcubate。
      3. サンプルホモジネートの1ミリリットル当たり1-ブロモ-3-クロロプロパン（BCP）の100μLを加えます。 15秒間激しくチューブを振ると、製造元の指示²⁴に従って全RNAを単離するために進んでください。
   2. 単離された全RNAからポリアデニル化mRNA精製
      1. 入手可能なキットまたはプロトコルを使用してポリアデニル化mRNAを精製します。
         1. 次の各溶液を再懸濁するために徹底的に振る：結合液、オリゴ（dT）ポリスチレンビーズ、および洗浄溶液を2倍。オリゴ（dT）は使用前に室温に戻しビーズことを確認してください。
         2. 加熱ブロック中で70℃にチューブや熱に準備あたりの溶出溶液の120μLを転送します。
         3. マイクロ遠心チューブに全RNAの500μgのまでピペット。ヌクレアーゼフリー水で、250μLに音量を調整します。
         4. 全RNAを2倍結合溶液の250μLを追加しますので、内容物を混合するための簡単リューションと渦。
         5. オリゴの15μLを加える（DT）ビーズと渦が完全に混合します。
         6. 3分間70℃で混合物をインキュベートします。
         7. 加熱ブロックからサンプルを取り出して、それを10分間室温で放置しました。
         8. 2分間15,000×gで遠心分離します。
         9. 慎重に約50μLを残す、上清を除去します。
         10. ピペッティングによりペレットを再懸濁するために洗浄溶液の500μLを追加します。
         11. スピンフィルター/コレクションチューブセットにサスペンションをピペット。
         12. 2分間15,000×gで遠心分離します。コレクションチューブから列を削除し、フロースルーを捨てます。コレクションチューブにカラムを返します。
         13. スピンフィルター上に洗浄溶液500μLをピペット。
         14. 15,000 xでの遠心分離 2分間グラム。
         15. 新鮮なコレクションチューブにスピンフィルターを転送します。
         16. 加熱された溶出液のピペット50μL70°Cにスピンフィルタの中心へ。
         17. 70℃で2〜5分間インキュベートします。 1分間15,000×gで遠心分離します。
         18. スピンフィルターの中央に70℃に加熱し、溶出液の追加の50μLをピペット。
         19. 繰り返しステップ1.2.2.1.18。
      2. 100μg/ mLのグリコーゲン、3 M酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.2）、および無水エタノールの2.5倍量の0.1ボリュームを追加します。 -80℃で一晩沈殿させます。
      3. 4℃で25分間、15,000×gで遠心分離します。上清を捨てます。
      4. 75％エタノール1mLでペレットを洗浄。 4℃で15分間、15,000×gで遠心分離します。慎重にエタノールを除去。
      5. 3-5分間空気中で乾燥しました。
      6. ペレットを溶解するためにヌクレアーゼフリー水10μLを追加します。
      7. -70℃で保管してください。
3. RNA資格および定量
   1. 分光光度計を使用して、NotIでによってRNA濃度を測定260 nmおよび280 nmの吸光度をngの。 A ₂₆₀ / A ₂₈₀比は1.8〜2.2でなければなりません。
   2. 0.8％アガロースゲル電気泳動^25を用いて、RNAサンプルの品質を確認してください。
      注：無傷の真核生物の全RNAは、強烈な28Sおよび18S rRNAバンドを示すべきです。良いRNA調製のための18S rRNAのバンド強度対28Sの割合は約2です。

2.ゲル電気泳動および転送

注意：バッファ調製プロトコルを表1に示します。

1. ホルムアルデヒドゲル調製（1％）
   1. ジエチル（DEPC）水と、すべての電気機器をすすぎます。
   2. DEPC水215 mL中に完全に電子レンジでアガロース2.5gのメルト。
   3. 10倍3-（N-モルホリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）の12.5 mLの緩衝液および37％ホルムアルデヒドの22.5 mLを加え。
   4. 1.5ミリメートルの厚さのくしと電気泳動装置にそれを注ぎます。
   5. トン気泡を排除またはプッシュきれいな櫛でのゲルのエッジに裾。
   6. ゲルは室温で固化することを可能にします。
2. 試料調製
   1. サンプルバッファの全RNAの1-10μgの11.3μLを混ぜます。
   2. サンプルバッファの11.3μLとRNAマーカー（を1μg/μL）の2μgのを混ぜます。
   3. 2.2.1および2.2.2からの16μLの総容量にサンプルにヌクレアーゼフリー水を追加します。
   4. 5分間60℃で加熱し、次いで氷上で冷やします。
   5. 氷の上では0.1μg/μLのエチジウムブロマイドが含まれている追跡用色素の4μL、と2.2.3からの試料16μLを混ぜます。
      注意：吸入するとエチジウムブロマイドはおそらく催奇形性や毒性があります。エチジウムブロマイド安全データシートをお読みください。
3. 電気泳動
   1. 10×MOPSの200 mLの1×MOPSランニングバッファーを作るためのddH ₂ Oの1800 mLにバッファを追加します。
   2. ゲルのウェルを洗浄するために、1×MOPSランニングバッファーを使用してください。
   3. プレラントン彼は5分間、20Vでゲル。
   4. ゲルのウェルにRNAサンプルをロードします。
   5. 光暴露を避けるためにホイルで覆います。約17時間（一晩）35 Vで実行します
   6. 調べ、UV光下でゲルを撮影。
4. 移転
   1. 未使用部分を除去するためにゲルをカットします。
   2. 10×SSC緩衝液（20×SSC緩衝液の250ミリリットルとDEPC水の250 mL）を500 mLのを準備します。
   3. 50 rpmで振とうしながら20分間、10×SSC緩衝液で2回ゲルを洗浄してください。
   4. 搬送用トレイ（ 図1）から転送バッファを吸収芯紙、として機能するのに十分な大き1フィルタ紙をカットします。
   5. ゲルと同じ大きさにろ紙の4枚をカット。
   6. ゲルと同じ大きさに正に帯電したナイロン膜の1シートをカット。
   7. ゲル上のノッチと適切な向きを確保するためのマーカーとしての膜をマークします。
   8. 15分間、2×SSC緩衝液中で膜を浸します。
   9. 500 mLのOを注ぎますF 10倍SSC転送トレイにバッファー。
   10. ガラス板を横切って大きなフィルタ紙を置き、転写緩衝液で濾紙を濡らします。
   11. ピペットで気泡をロールアウト。
   12. 転送バッファにプレカットろ紙の2枚を浸し、ステップ2.4.5からろ紙の中央に配置します。任意の気泡を除去。
   13. ろ紙上にゲルのトップ側を下にして置きます。
   14. ゲルの上に膜を置きます。ゲルとメンブレンのノッチを合わせます。
   15. 膜の上にプレカット濾紙の2枚を配置し、転写緩衝液で濾紙を濡らします。
   16. 層の間の任意の気泡を除去。
   17. タオルだけゲルと膜を通過バ​​ッファを吸い取ることを保証するために、ゲルの周りにラップを適用します。
   18. ろ紙の上にペーパータオルをスタック。
   19. タオルの上に特大のガラス板を置きます。
   20. スタックの一番上に重量を配置します。
   21. RNAは、膜にゲルから転送できるようにするために一晩保管してください。

N ⁶ -methyladenosineの3検出

1. 膜架橋
   1. 2×SSC緩衝液で湿った膜を保管してください。
   2. UVクロスリンカーに10×SSC緩衝液で浸した濾紙の2枚を置きます。
   3. RNA吸着側を上に向けて、ろ紙の上に膜を配置します。
   4. 「autocrosslinkモード」（12万μJ）を選択し、照射を開始するために、「スタート」ボタンを押してください。
   5. ゲルからメンブレンへのRNA転写を確認するために、UVゲルイメージキャッチャーを有する膜およびゲルを調べます。
2. 免疫ブロット法
   1. 1時間室温でトゥイーン20（TBST）緩衝液を用いてトリス緩衝生理食塩水、5％脱脂乳で膜をブロックします。
   2. 15分間、TBST緩衝液で3回洗浄します。
   3. 一晩メートル⁶ A（中膜をインキュベート N ⁶ -methyladenosine）抗体溶液（1：5％脱脂乳TBSTバッファー1,000）4℃。
   4. 15分間、TBST緩衝液で3回膜を洗浄します。
   5. 室温で1時間（5％の脱脂乳TBST緩衝液中2,000 1）HRP結合ロバ抗ウサギ抗体溶液中で膜をインキュベートします。
   6. 15分間、TBST緩衝液で3回膜を洗浄します。
   7. 強化された化学発光基質（膜の1cm ²当たり0.125ミリリットル）を適用します。
   8. 製造元の指示²⁶に従って、デジタルイメージャの最適な設定で化学発光をキャプチャします。
3. メートル⁶定量
   1. ImageJソフトウェアを使用して相対メートル⁶ A化学発光強度を測定します。
      1. ImageJソフトウェアのメニューで、該当するファイルを開くには、「ファイル」オプションを選択します。
      2. ImageJのから「矩形」ツールを選択し、周囲に枠を描きます信号。
      3. リボソームRNAは、実験の焦点でない場合は、計算のための18Sおよび28SリボソームRNAメートル⁶ Aバンドを避けます。
      4. 選択された車線を確認するために「コマンド」と「1」をクリックしてください。
      5. 押して「コマンド」と「3」が選択されたプロットを表示します。
      6. 「ストレート」ツールをクリックし、セグメント化された領域を分離するために線を引きます。
      7. 測定値を記録するために「ワンド」ツールをクリックします。
      8. データをエクスポートします。
      9. 臭化エチジウム染色から18SリボソームRNAのバンドを持つメートル⁶ Aのレベルを標準化します。

Results

通常の明暗概日相で14日後に、野生型マウスは、一定の暗闇の中に入れました。肝臓からのRNAは、4時間間隔でサンプリングし、変更されたノーザンブロット法で検討しました。 rRNA、mRNAを、と小さなRNAのメチル化は、明らかに（ 図2）を検出しました。別の概日時間（CT）との間の比較は、正確に、18S rRNAの標準を用いて計算することができます。 rRNAを、mRNAを、および低分子RNAでメートル⁶ Aレベルの堅牢な概日振動がありました。

リボソームRNAによって差し出さ干渉を回避するために、ポリアデニル化RNAは、ステップ1.2.2のように、精製することができます。精製後、rRNAが大きく、他のRNA（ 図3）のより良好な視覚化を可能にするために除去することができます。

グラム>図1：ブロットトランスファーユニットの組み立て。メンブレンへのRNAをブロッティング用のキャピラリートランスファーユニットが示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：C57BL / 6Jマウスにおけるメートル⁶ Aレベルの概日リズム。この図はメートル⁶野生型マウスの肝臓からの全RNAのブロットは、4時間の間隔で、通常の明暗相の14日後に暗暗期の最初の日に犠牲に示しています。定量化は、M ⁶ 18Sおよび28S rRNAの間の画像の濃度差を用いて行きました。メートル⁶存在量は一番下にホルムアルデヒドゲルから18S rRNAのバンドに標準化しました。ら= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：メートル⁶ Aブロットを持つかのrRNAなし。代表的なmが野生型マウスの肝臓からの全RNAおよびポリアデニル化RNAの⁶ Aブロットが示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

表1：バッファおよびソリューションを提供しています。

1	10×MOPS緩衝液（pH 7.0、光から保護します）
	MOPS			41.85	グラム	0.2 M
	酢酸ナトリウム			4.1	グラム	0.05 M
	EDTA、二ナトリウム塩			3.7	グラム	0.01 M
	DEPC水
	合計			1	L
	室温で撹拌
2	20×SSC緩衝液（pH7.0）
	塩化ナトリウム			175.3	グラム	3 M
	クエン酸三ナトリウム			88.3	グラム	0.3 M
	DEPC水
	合計			1	L
	室温で攪拌し、その後、オートクレーブ
3	追跡用色素
	10×MOPS緩衝液			500	μL	1倍
	フィコール400			0.75	グラム	15％
	ブロモフェノールブルー			0.01	グラム	0.2％
	キシレンシアノール			0.01	グラム	0.2％
	DEPC水
	合計			5	mLの
	-20°Cで保存
4	DEPC水
	1割合を希釈：DEPCの1,000のddH 2 Oに
	室温で一晩攪拌し、その後、オートクレーブ
5	サンプルバッファー（光から保護）
	10×MOPS緩衝液			200	μL
	37％ホルムアルデヒド			270	μL
	ホルムアミド			660	μL
	-20°Cで保存

Discussion

RNAの修飾は、細胞機能と生理学において重要な役割を果たします。これらの修飾の調節、機能、および恒常性に関する現在の理解はまだ調査され、拡大されています⁸。したがって、RNAの修飾を評価するための正確でゴールドスタンダードな方法が必要です。修正ノーザンブロッティング法は、RNA修飾の正確な定量と、多様なRNAにおける修飾の明確な描写を提供します。この方法は少なくとも3日かかりますが、標準化でき、さまざまな実験計画に使用できます。さらに、異なる抗体を使用して、異なるRNA修飾を検出できます²⁷。

RNA修飾を分析する際には、異なるRNAを分離することが重要です。リボソームRNAは、RNAの総量の大部分を占める^28,29。トータルRNAのみでRNA修飾を解析した結果は、主にrRNAの変化を表します。rRNAのメチル化やその他の修飾は、他のRNAの変化を隠す可能性があります。ゲル分離の手順により、mRNAやその他の低分子RNAの修飾をより正確に分析できます。

m⁶Aの免疫沈降とシーケンシングによるトランスクリプトームワイドマッピングは、各タイプのRNAの修飾に関する詳細な洞察を提供します²²。特定のRNAに関する情報と約80〜120 bpの分解能を提供します。m⁶A-Seqは異なる実験条件間の修飾を比較できますが、そのような実験のための適切な標準とコントロールの選択は困難です¹⁸。免疫沈降は再現が難しく、多くの場合、繰り返し間で大きな変動が生じます。さらに、m⁶A-Seqは、免疫沈降およびシーケンシングの前にRNAサンプルの断片化を必要とします³⁰。断片化プロセスは、元のRNA修飾に過度の影響を誘発する可能性があります。実験で特定の遺伝子の情報は必要ないが、比較のために異なる条件が必要な場合、現在の方法では、さまざまな実験セットアップに対してより優れた視覚化と制御が提供されます。

RNAの修飾は、転写制御を調節する上で重要なステップです³¹。しかし、多様な生理学的領域におけるさまざまなRNA修飾の恒常性と調節メカニズムはまだ不明です。現在の修正ノーザンブロッティング法を使用すると、さまざまなRNA修飾を定量化および比較できます。さらに、RNA修飾の変化と規制をより詳細に調査することができます。将来的には、古典的なノーザンブロッティングと修正されたノーザンブロッティングプロトコルの両方からの実験データを組み合わせることも可能になり、RNA生物学に関するより深い洞察が得られる可能性があります。

修正ノーザンブロッティングプロトコルの成功を決定する最も重要な要因は、RNAサンプルの完全性です。ある程度の分解を伴うRNAは、良好な古典的なノーザンブロッティング結果をもたらす可能性がありますが、これは修正されたノーザンブロッティングの結果に大きな影響を与える可能性があります。異なる組織や細胞株におけるRNAの修飾も大きく異なる可能性があります。最終実験を行う前に、さまざまな組織に適したRNAサンプルロードをテストすることが重要です。

ブロッティング手順は伝統的にサザン博士とさまざまな地理的方向にちなんで名付けられてきたため、現在の技術には「北東部」ブロッティングという名前を提案します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNaseZapの解決	Ambion	AM9782	のプロトコル1.1
TRIの試薬の解決	Ambion	AM9738	1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP)	Σ	B9673	プロトコル1.2.1.3
エタノール	JTbaker	8006	プロトコル1.2.1.3
Isopropanol	ΣI9516	のプロトコル1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit	Σ	MRN70	プロトコル 1.2.2.1
グリコーゲン	Ambion	AM9510	プロトコル 1.2.2.2
酢酸ナトリウム	Fluka	71183	プロトコル 1.2.2.2
ヌクレアーゼフリー水	Ambion	AM9930	プロトコル 1.2.2.6
DEPC	Σ	D5758	プロトコル 2.1.1
アガロー	JT Baker	A426	プロトコル 2.1.2
MOPS	シグマ	M1254	プロトコル 2.1.3
37% ホルムアルデヒド 溶液	シグマ	F8775	プロトコル 2.1.3
EDTA、二ナトリウム塩	JT Baker	8993	プロトコル 2.1.3 10x MOPS バッファー
ホルムアミド	Σ	F7503	プロトコル 2.2.1
RNA ミレニアムマーカー	Ambion	AM7150	プロトコル 2.2.2
臭化エチジウム	Amresco	X328	プロトコル 2.2.5
Ficoll PM400	GE Healthcare	17-0300-10	プロトコル 2.2.5 トラッキング染料
ブロモフェノールブルー	Sigma	114391	プロトコル 2.2.5 トラッキング染料
キシレンシアノール FF	Σ	X4126	プロトコル 2.2.5 トラッキング染料
塩化ナトリウム二水和物	JT Baker	3624	プロトコル 2.4.2 20x SSC バッファー
クエン酸三ナトリウム	Sigma	S1804	プロトコル 2.4.2 20x SSC バッファー
Hybond ブロッティングペーパー	GE ヘルスケア	RPN6101M	プロトコル 2.4.4
GE Hybond-N+ 膜	GE ヘルスケア	RPN303B	プロトコル 2.4.6
Stratalinker UV クロスリンカー 2400	Stratagene	400075	プロトコル 3.1.2
ゲルキャッチャー1500	ANT技術	ゲルキャッチャー1500	3.1.5
抗m6A(N6-メチルアデノシン)	シナプスシステム	202003プロトコル	3.2.3
Amersham ECL抗ウサギIgG、HRPリンク全Ab	GEヘルスケア	NA934	3.2.5
ChemiDoc MPシステム	BIO-RAD	1708280	プロトコル3.2.8