非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのMxAのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション

Summary

この記事では、非変性PAGEとウェスタンブロット分析の組み合わせを使用して、ヒト細胞のライセートからのダイナミン様GTPase MxAタンパク質のオリゴマー状態を評価するための簡単で迅速なプロトコルについて説明します。

Abstract

オリゴマー複合体の形成は、多くのタンパク質の適切な構造と機能のための重要な前提条件です。インターフェロン誘導性抗ウイルスエフェクタータンパク質MxAは、多くのウイルスに対して広範な抗ウイルス活性を発揮します。MxAはダイナミン様GTPアーゼであり、高次のオリゴマー構造を形成する能力を持っています。しかし、MxAのオリゴマー化がその抗ウイルス活性に必要かどうかは議論の余地があります。ここでは、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)とウェスタンブロット分析を組み合わせて、ヒト細胞株の細胞質画分における内因性または異所的に発現したMxAのオリゴマー状態を評価するための簡単なプロトコルについて説明します。プロトコールの重要なステップは、酵素活性を妨げることなく、特にMxAなどの細胞膜に関連するタンパク質の凝集および/または沈殿を防ぐための界面活性剤の選択です。プロトコルのもう一つの重要な側面は、タンパク質の人工的な相互作用を防ぐために、ヨードアセトアミドによるシステイン残基の遊離チオール基の不可逆的な保護です。このプロトコルは、MxAのオリゴマー状態の簡単な評価に適しており、さらに、MxAインターフェース変異体の抗ウイルス活性とそれぞれのオリゴマー状態との直接的な相関関係を可能にします。

Introduction

タンパク質の四次構造は、多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしています。シグナル伝達経路、遺伝子発現、および酵素活性化/非活性化は、すべてのタンパク質複合体^1-4の適切なアセンブリに頼ります。また、ホモまたはヘテロオリゴマーとして知られるこのプロセスは不可逆的共有結合または可逆的な静電および疎水性のタンパク質 - タンパク質相互作用に起因します。オリゴマー化は、ゲノムサイズを大きくすることなく、異なる細胞過程を多様化するだけでなく、変性および劣化⁵に対してより耐性である安定な複合体を構築するためのタンパク質のための戦略を提供するだけでなく。オリゴマー化の欠陥は、タンパク質の機能に影響を与え、疾患の発症をもたらすことができます。例えば、酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼは、四量体複合体を形成します。タンパク質複合体の中のいくつかの変異は、四量体形成を弱め、病気のフェニルケトン⁶につながることができます。

人間のMxAタンパク質は、抗ウイルス、様々なRNAに対する幅広い抗ウイルス活性を発揮するエフェクタータンパク質ならびにDNAウイルス^7を誘発インターフェロン（IFN）です。これは、ダイナミンのような大GTPアーゼのスーパーファミリーに属し、 インビトロ ⁸ に大きなオリゴマー構造を形成する能力を有します。オリゴマー化は、迅....

Protocol

注：このプロトコルは、以前に公開された非変性PAGEプロトコル¹²に基づいています。その研究では、のMxAタンパク質のオリゴマー状態は、内因性のMxAを発現するのMxAを過剰発現するベロ細胞またはIFN-αで刺激されたA549細胞のいずれかを用いて評価しました。以下に記載されるプロトコルは、のMxAに加えて、任意のタンパク質のオリゴマー状態を分析するために使用することができます。しかし、さらなる最適化が必要とされ得ます。

非変性PAGEのための細胞溶解物の調製

注：いずれかのベロまたはA549細胞におけるヒトのMxAタンパク質のオリゴマー状態を分析するために、1.0×10 ⁶個^の細胞を採取しました。細胞型または分析するタンパク質の存在量に依存して、細胞数を調整すべきです。すぐに感光性ヨードアセトアミドを添加するように、露光から溶解バッファを保護することも重要です。

1. にウェル当たり0.3×10 ⁶ A549またはVero細胞をシード6ウェルディッシュに。ウェル毎に2 mlの増殖培地中で細胞を維持した （ 表1参照 ）。細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO _2）で一晩細胞をインキュベートします。
2. リン酸緩衝生....

Results

非変性PAGEを使用して、我々は、ヒト野生型のMxA、二量体界面の突然変異体のMxA（R640A）とのMxA（L617D）ならびに細胞溶解物¹²から単量体インターフェース変異体のMxA（M527D）のオリゴマー状態を分析しました。細胞は（ 図1参照 ） は 、タンパク質の可溶化および遊離チオール基の保護を確実にするために1％のオクチルフェノキシポリエトキシエタノール（NP-40）及びヨードアセトアミドを含有する緩衝液中で溶解しました。前述したように、塩、小代謝産物を透析¹⁹により除去しました。タンパク質分離は、非変性PAGEによって行いました。効率的なウエスタンブロットを容易にするために、ゲルをブロッティングの前にSDS緩衝液中でインキュベートしました。 MxAタンパク質はのMxAに対するウサギポリクローナル抗体を用いた免疫染色により可視化しました。ワークフローは、図2に記載されています。

Discussion

ここでは、ウェスタンブロット分析を行った非変性PAGEによって哺乳動物細胞で発現するタンパク質のオリゴマー状態の急速な決意を可能にする簡単な方法を説明します。このアプローチの主な利点は、所定のタンパク質のオリゴマー状態は、従来のタンパク質精製せずに全細胞溶解物から決定することができるということです。これは、オリゴマー化または補助因子に関連してその機能を発揮するタンパク質のために重要であり得ます。また、タンパク質は、その天然の状態のままであり、さらに、ゲルから抽出された場合、酵素活性または他のタンパク質の機能を決定し、オリゴマー状態と相関させることができます。

このプロトコルの重要な側面は、サンプル調製時の洗剤の選択です。これは、細胞膜に関連するタンパク質のために特に重要です。 MxAのは、主に、滑らかな小胞体²⁵の膜に関連すると思われます。細胞溶解のための非イオン性界面活性剤NP40をのMxAの沈殿を防止する、最適でした。以前¹⁹に記載のように緩衝液交換し、透析による溶解物の低分子量不純物を除去した後、0.1％3の存在-.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml	Thermo Fisher Scientific	69570	透析緩衝液中での事前平衡化(グリセロール除去が必要な場合) Fiala et al. 2011
4&ndashに従って自作可能;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well,	Bio-Rad	456-1083	Pre-run in running buffer system
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche	11836170001	50 ml
PBS、pH 7.4  ボトル 500 ml あたり 1 錠を使用 Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S solution	Sigma-Aldrich	P7170	TOXIC 手袋を着用し、目を保護します
NativeMark Unstained Protein Standard  50 & micro;l	Invitrogen	P/N 57030	負荷 5 µl/well
A549 細胞	ATCC	ATCC CCL185	増殖培地で増殖 (表 1参照)
ベロ細胞	ATCC	ATCC CCL81	増殖培地で増殖 (表 1参照)
抗 Mx1 抗体	Novus Biologicals		H00004599_D01P 1:1,000 希釈液で使用
ECL 抗ウサギ IgG、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合全抗体 (ロバ)	GE-Healthcare	NA934V	1:10,000希釈で使用
0.5% トリプシン-EDTA (1x)       Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
ヨードアセトアミド  5 g	Sigma-Aldrich	I-6125	ストック  100 mM
ブロムフェノールブルー	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies	サーモフィッシャーサイエンティフィック	41966-029
ペン 溶連菌感染症 100 x    100ml              ライフテクノロジー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140 - 130
グルタマックス 100x ストック、100 ml    ライフサイエンス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	350500-038
ウシ胎児血清、透析、米国原産 500 ml Gibco ロット:42G9552K	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10270-106
セルロースフィルターペーパー	バイオ・ラッド	1703965
PVDF ブロッティング  メンブレン	GE-ヘルスケア	10600022
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン	バイオソルブ	0020092391BS
フッ化ナトリウム (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS 10% solution	Amresco	N907
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glycine	Biosolve	0007132391BS
オルトバナジン酸ナトリウム (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
グリセロール	Sigma Aldrich	G7757
β-グリセロホスペート	Sigma Aldrich	G9422
粉乳	ミグロス/スイス
メタノール	ミリポア	1.06009
クロライドナトリウム (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
塩化マグネシウム (MgCl<サブ>2)	アムレスコ	288
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
水酸化ナトリウム (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045