非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのMxAのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション

Summary

この記事では、非変性PAGEとウェスタンブロット分析の組み合わせを使用して、ヒト細胞のライセートからのダイナミン様GTPase MxAタンパク質のオリゴマー状態を評価するための簡単で迅速なプロトコルについて説明します。

Abstract

オリゴマー複合体の形成は、多くのタンパク質の適切な構造と機能のための重要な前提条件です。インターフェロン誘導性抗ウイルスエフェクタータンパク質MxAは、多くのウイルスに対して広範な抗ウイルス活性を発揮します。MxAはダイナミン様GTPアーゼであり、高次のオリゴマー構造を形成する能力を持っています。しかし、MxAのオリゴマー化がその抗ウイルス活性に必要かどうかは議論の余地があります。ここでは、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)とウェスタンブロット分析を組み合わせて、ヒト細胞株の細胞質画分における内因性または異所的に発現したMxAのオリゴマー状態を評価するための簡単なプロトコルについて説明します。プロトコールの重要なステップは、酵素活性を妨げることなく、特にMxAなどの細胞膜に関連するタンパク質の凝集および/または沈殿を防ぐための界面活性剤の選択です。プロトコルのもう一つの重要な側面は、タンパク質の人工的な相互作用を防ぐために、ヨードアセトアミドによるシステイン残基の遊離チオール基の不可逆的な保護です。このプロトコルは、MxAのオリゴマー状態の簡単な評価に適しており、さらに、MxAインターフェース変異体の抗ウイルス活性とそれぞれのオリゴマー状態との直接的な相関関係を可能にします。

Introduction

タンパク質の四次構造は、多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしています。シグナル伝達経路、遺伝子発現、および酵素活性化/非活性化は、すべてのタンパク質複合体^1-4の適切なアセンブリに頼ります。また、ホモまたはヘテロオリゴマーとして知られるこのプロセスは不可逆的共有結合または可逆的な静電および疎水性のタンパク質 - タンパク質相互作用に起因します。オリゴマー化は、ゲノムサイズを大きくすることなく、異なる細胞過程を多様化するだけでなく、変性および劣化⁵に対してより耐性である安定な複合体を構築するためのタンパク質のための戦略を提供するだけでなく。オリゴマー化の欠陥は、タンパク質の機能に影響を与え、疾患の発症をもたらすことができます。例えば、酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼは、四量体複合体を形成します。タンパク質複合体の中のいくつかの変異は、四量体形成を弱め、病気のフェニルケトン⁶につながることができます。

人間のMxAタンパク質は、抗ウイルス、様々なRNAに対する幅広い抗ウイルス活性を発揮するエフェクタータンパク質ならびにDNAウイルス^7を誘発インターフェロン（IFN）です。これは、ダイナミンのような大GTPアーゼのスーパーファミリーに属し、 インビトロ ⁸ に大きなオリゴマー構造を形成する能力を有します。オリゴマー化は、迅速な分解^9,10からのMxAを保護するために提案されています。多くの研究グループによる激しい努力にもかかわらず、作用の分子機構は、主にとらえどころのないままで、その抗ウイルス機能のためのMxAのオリゴマー化状態の役割が議論^9,11,12の下にあります。この点で、ガオと共同研究者は、MxAのが大きなリング状オリゴマー構造¹¹の形でウイルス核タンパク質と相互作用することにより、その抗ウイルス活性を発揮するモデルを提案しました。しかし、最近では、我々は、のMxA二量体が抗ウイルス活性を示し、インフルエンザウイルス¹²の核タンパク質と相互作用することを実証しました。 BMxAの結晶構造にASED、ガオと共同研究者は、in vitroで 、そのオリゴマー化およびその抗ウイルス機能^11,13のために重要である界面領域におけるいくつかのアミノ酸残基を同定しました。したがって、抗ウイルス活性を発揮するのMxAのオリゴマーいる状態解明するために、我々は、急速に、内因性のMxAはIFNα刺激後に発現並びにヒト細胞において発現のMxAインタフェース変異体のoligmeric状態を決定するための簡単なプロトコルを確立しようとしました。

一般に、スプリット緑色蛍光タンパク質などのタンパク質の間の相互作用を研究するために使用される多くの技術があるが（スプリット-GFP）相補性アッセイ^14、表面プラズモン共鳴¹⁵と蛍光共鳴エネルギー移動^{（FRET）16、}それらが提供していませんオリゴマータンパク質複合体の正確な化学量論の情報。この特定の側面の調査のため、技術など多角度光散乱^（MALS）17および分析超遠心分離^18は非常に便利です。通常、これらの方法を用いて分析したタンパク質は、精製されたタンパク質です。オリゴマー化プロセスは、他の細胞因子に依存し得ます。これらの要因が不明である場合は、解析がより困難です。さらに、いくつかのタンパク質は、 大腸菌で発現することが困難であり、 coliおよび精製します。したがって、これらの方法は、細胞環境におけるタンパク質のオリゴマー化を分析するための最適な選択肢ではありません。また、これらの技術は容易に入手できない高価な機器を必要とします。

非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、サイズ排除クロマトグラフィー又は従来のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-PAGEに続く化学的架橋は、細胞溶解物^2,19,20からのオリゴマーの形成の特徴付けのために有用なツールです。これらの方法は、特別な装置を必要とせず、簡単にPEすることができます標準的な実験室でrformed。我々は、最初に不変非特異的凝集のMxAの沈殿を導いた種々の化学架橋プロトコルを評価しました。したがって、我々は次の非変性PAGEプロトコルをテストしました。非変性PAGEは、SDSの使用を排除するように、タンパク質の移動は、母国の電荷に依存します。ブルーネイティブPAGEは、SDSに似て全体的に負電荷を有するタンパク質をロードするためにクーマシーブリリアントブルーG250を使用しますが、タンパク質^21を変性させません。残念ながら、多くの場合、溶解緩衝液に含まれている（ 例えば、マグネシウム^2+）高塩および二価カチオンの存在下で鮮やかな青色の沈殿物をクーマシー。使用される緩衝剤によっては、オリゴマータンパク質複合体に影響を与える可能性の手順をさらに最適化することなくサンプルを分析することは困難です。

ここでは、のオリゴマー化を決定するために、以前に発表された方法²²に基づいて簡単なプロトコルを提示非変性PAGEを使用して細胞溶解物由来のヒトのMxAタンパク質。

Protocol

注：このプロトコルは、以前に公開された非変性PAGEプロトコル¹²に基づいています。その研究では、のMxAタンパク質のオリゴマー状態は、内因性のMxAを発現するのMxAを過剰発現するベロ細胞またはIFN-αで刺激されたA549細胞のいずれかを用いて評価しました。以下に記載されるプロトコルは、のMxAに加えて、任意のタンパク質のオリゴマー状態を分析するために使用することができます。しかし、さらなる最適化が必要とされ得ます。

非変性PAGEのための細胞溶解物の調製

注：いずれかのベロまたはA549細胞におけるヒトのMxAタンパク質のオリゴマー状態を分析するために、1.0×10 ⁶個^の細胞を採取しました。細胞型または分析するタンパク質の存在量に依存して、細胞数を調整すべきです。すぐに感光性ヨードアセトアミドを添加するように、露光から溶解バッファを保護することも重要です。

1. にウェル当たり0.3×10 ⁶ A549またはVero細胞をシード6ウェルディッシュに。ウェル毎に2 mlの増殖培地中で細胞を維持した （ 表1参照 ）。細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO _2）で一晩細胞をインキュベートします。
2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）1mlで洗浄することにより細胞を回収し、0.25％トリプシン - エチレンジアミン四酢酸0.5mlを室温で約5分間（EDTA）1X溶液を添加することによって切り離します。
3. すぐに細胞がディッシュから剥離として、0.5ミリリットルの増殖培地を追加し、注意深くピペッティングにより混合します。
4. 各ウェルに1 2ミリリットルチューブの細胞を転送し、テーブルトップ遠心機（5,000×gで、4℃、5分）を使用して、それらをペレット化。
5. 慎重に細胞ペレットを乱すことなくピペットで上清を除去します。
6. 慎重に上下細胞懸濁液をピペットで1ミリリットルの氷冷PBSで細胞を洗浄。
7. テーブルトップ遠心機（5,000×gで、4℃、5分）で細胞をペレット化。
8. 慎重のwiをピペットで上清を除去し細胞ペレットを取り外すthout。
9. 上下にピペッティングし、氷上に置くことにより、200μlの氷冷溶解緩衝液中に再懸濁細胞（ 表1参照）。
10. 直ちに、スズ箔を使用して管を覆うことにより光から溶解物を保護し、氷上で30分間インキュベートします。
    注：遊離チオール基の保護が不可逆的であるため、氷上で30分間インキュベートした後、それは、もはや露光からの溶解物を保護するために不可欠です。
11. あらかじめ冷却テーブルトップ遠心機（13,000×gで、4℃、20分）での遠心分離により細胞破片を除去します。
12. 遠心分離工程の間に20分間の4℃の冷室で透析緩衝液（ 表1）に透析カラムを平衡化します。万の分子量カットオフでカラムを使用してください。
    1. フロートブイに列を取り付け、透析緩衝液で満たされたビーカーに入れます。穏やかな攪拌を確保するために、磁気撹拌機を使用しています。膜には触れないでください。
       注：Dialysカラムは、購入またはフィアラおよび共同研究者ら¹⁹によって記載されたプロトコルに従って、1.5ミリリットルのチューブから調製することができるされています。
13. 透析緩衝液とフロートブイから列を削除します。膜に触れることなく、ピペッティングにより準備された透析カラムにクリアされた溶解物を転送します。フロートブイに列を取り付け、透析緩衝液で満たされたビーカーに戻ってそれらを置きます。
14. 慎重にマグネチックスターラーを用いて攪拌しながら4℃で少なくとも4時間（好ましくは一晩）氷冷透析緩衝液（ 表1）を含有するビーカー中で溶解物を透析します。 200μlの溶解液のために少なくとも100ミリリットルの透析緩衝液を使用してください。
15. 1.5ミリリットルチューブに透析サンプルを転送します。テーブルトップ遠心機（13,000×gで、4℃、20分）で遠心分離によって沈殿物を除去します。オリゴマータンパク質複合体の解離を防ぐためにすぐに透析した後、プロトコル（セクション2）に進みます。凍結しないでください調製した溶解物。

2.電気泳動

注：いくつかの変更²²で前述したように電気泳動を行いました。以下に記載されたプロトコルでは、プレキャスト勾配ゲルを使用した（4〜15％勾配）。あるいは、ゲルは、実験室で調製することができます。 SDSのオリゴマータンパク質複合体の解離を防止するような任意の変性剤を排除することが非常に重要です。電気泳動の時間は人間のMxAタンパク質の異なるオリゴマー状態のために最適化されました。しかし、それは、オリゴマー複合体の大きさ、ならびに複合体を分析するために達成されることになっている分離の範囲に応じて、他のタンパク質のために変化することができます。したがって、電気泳動の最適な時間は、経験的に決定されるべきです。オリゴマーの最適な解像度を分析するために電流が25ミリアンペアを超えてはなりません。

1. ゲルチャンバ内の非変性PAGEゲルを組み立てます。トンを埋めます予冷ランニング緩衝液（ 表1）と彼の内側および外側チャンバ。
2. 4℃の低温室で15分間ゲル当たり25ミリアンペアで予備冷却したランニング緩衝液でゲルを事前に実行します。
3. 4×サンプル緩衝液（ 表1）の5μlの上記で調製した溶解物の15μlのを混ぜます。サンプルを沸騰しないでください。
4. サンプルの負荷15μlを、ゲル上の任意の天然タンパク質の標準。 4℃の低温室で4時間25ミリアンペアでゲルを実行します。
   注：半定量的分析のため、タンパク質定量化プロトコル（ 例えば、Bradfordタンパク質アッセイ^23）はレーンあたり総タンパク質の等量の充填を確実にするために行うことができます。

3.ウエスタンブロット

注：以下で説明するには、湿ったウェスタンブロットシステムのプロトコルです。任意のブロッティング膜を使用することができます。 BUFブロッティングで平衡化する前に、100％メタノールにポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜を活性化させますFER。セミドライウエスタンブロット法を代わりに使用することができるが、大きなオリゴマー複合体のために最適化されなければなりません。

1. ゲルを分解し、慎重にSDS緩衝液（ 表1）にそれを転送します。
2. 穏やかに振盪しながら室温で10分間インキュベートします。
3. 2スポンジ、4セルロース濾紙シートとゲルあたりブロッティング膜を準備します。バッファ（ 表1）をブロッティングでそれらを浸します。
4. 1スポンジ、2セルロース濾紙シート、膜、ゲル、2セルロース濾紙シート、1スポンジ：（下から上）を次のようにサンドイッチを組み立てます。
5. ブロッティングタンクにサンドイッチを入れてください。ゲルはマイナス極に直面しながら、膜がプラス極に直面していることを確認します。
6. あらかじめ冷却ブロッティングバッファーでブロッティングタンクを埋めます。
7. 最高のタンパク質導入の結果を得るために4℃で一晩90ミリアンペアで吸い取ります。
8. サンドイッチを分解し、PONC中で膜をインキュベートすることにより、タンパク質標準を可視化室温で5分間オーSソリューション。
9. あなたは明らかにタンパク質標準のバンドが表示されるまで、慎重に脱イオン水でポンソーSを洗浄することにより、膜脱色。
10. ペンを使用して、タンパク質標準のバンドをマークします。
    注：残留ポンソーSは、免疫染色を妨げる可能性があります。これを回避するために、膜を脱イオン水で1分間、およびその後の洗浄のために、0.1M NaOH中でのインキュベーションによってさらに脱色することができます。
11. ブロッキング緩衝液で膜をブロックし、室温で少なくとも1時間または一晩4°Cのため（ 表1参照）。
12. 分析されるタンパク質に対する抗体を用いた免疫染色により、目的のタンパク質（単数または複数）を視覚化します。
    注：緩衝液（ 表1）をブロック1,000：ヒトのMxAタンパク質は、ヒトMx1の1に希釈するための具体的なウサギポリクローナル抗体を用いて可視化しました。抗体溶液を4℃で一晩インキュベートしました。あるいは、モノクローナルANTI-のMxA抗体（クローン143）を使用することができる（データは示していない^）24。

Results

非変性PAGEを使用して、我々は、ヒト野生型のMxA、二量体界面の突然変異体のMxA（R640A）とのMxA（L617D）ならびに細胞溶解物¹²から単量体インターフェース変異体のMxA（M527D）のオリゴマー状態を分析しました。細胞は（ 図1参照 ） は 、タンパク質の可溶化および遊離チオール基の保護を確実にするために1％のオクチルフェノキシポリエトキシエタノール（NP-40）及びヨードアセトアミドを含有する緩衝液中で溶解しました。前述したように、塩、小代謝産物を透析¹⁹により除去しました。タンパク質分離は、非変性PAGEによって行いました。効率的なウエスタンブロットを容易にするために、ゲルをブロッティングの前にSDS緩衝液中でインキュベートしました。 MxAタンパク質はのMxAに対するウサギポリクローナル抗体を用いた免疫染色により可視化しました。ワークフローは、図2に記載されています。

Discussion

ここでは、ウェスタンブロット分析を行った非変性PAGEによって哺乳動物細胞で発現するタンパク質のオリゴマー状態の急速な決意を可能にする簡単な方法を説明します。このアプローチの主な利点は、所定のタンパク質のオリゴマー状態は、従来のタンパク質精製せずに全細胞溶解物から決定することができるということです。これは、オリゴマー化または補助因子に関連してその機能を発揮するタンパク質のために重要であり得ます。また、タンパク質は、その天然の状態のままであり、さらに、ゲルから抽出された場合、酵素活性または他のタンパク質の機能を決定し、オリゴマー状態と相関させることができます。

このプロトコルの重要な側面は、サンプル調製時の洗剤の選択です。これは、細胞膜に関連するタンパク質のために特に重要です。 MxAのは、主に、滑らかな小胞体²⁵の膜に関連すると思われます。細胞溶解のための非イオン性界面活性剤NP40をのMxAの沈殿を防止する、最適でした。以前¹⁹に記載のように緩衝液交換し、透析による溶解物の低分子量不純物を除去した後、0.1％3の存在-...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 ml	Thermo Fisher Scientific	69570	透析緩衝液中での事前平衡化(グリセロール除去が必要な場合) Fiala et al. 2011
4&ndashに従って自作可能;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well,	Bio-Rad	456-1083	Pre-run in running buffer system
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche	11836170001	50 ml
PBS、pH 7.4  ボトル 500 ml あたり 1 錠を使用 Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S solution	Sigma-Aldrich	P7170	TOXIC 手袋を着用し、目を保護します
NativeMark Unstained Protein Standard  50 & micro;l	Invitrogen	P/N 57030	負荷 5 µl/well
A549 細胞	ATCC	ATCC CCL185	増殖培地で増殖 (表 1参照)
ベロ細胞	ATCC	ATCC CCL81	増殖培地で増殖 (表 1参照)
抗 Mx1 抗体	Novus Biologicals		H00004599_D01P 1:1,000 希釈液で使用
ECL 抗ウサギ IgG、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合全抗体 (ロバ)	GE-Healthcare	NA934V	1:10,000希釈で使用
0.5% トリプシン-EDTA (1x)       Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
ヨードアセトアミド  5 g	Sigma-Aldrich	I-6125	ストック  100 mM
ブロムフェノールブルー	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies	サーモフィッシャーサイエンティフィック	41966-029
ペン 溶連菌感染症 100 x    100ml              ライフテクノロジー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140 - 130
グルタマックス 100x ストック、100 ml    ライフサイエンス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	350500-038
ウシ胎児血清、透析、米国原産 500 ml Gibco ロット:42G9552K	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10270-106
セルロースフィルターペーパー	バイオ・ラッド	1703965
PVDF ブロッティング  メンブレン	GE-ヘルスケア	10600022
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン	バイオソルブ	0020092391BS
フッ化ナトリウム (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cOmplete, Mini, EDTA-free	Roche
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS 10% solution	Amresco	N907
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glycine	Biosolve	0007132391BS
オルトバナジン酸ナトリウム (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
グリセロール	Sigma Aldrich	G7757
β-グリセロホスペート	Sigma Aldrich	G9422
粉乳	ミグロス/スイス
メタノール	ミリポア	1.06009
クロライドナトリウム (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
塩化マグネシウム (MgCl<サブ>2)	アムレスコ	288
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
水酸化ナトリウム (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045