蛍光顕微鏡でストロミュール頻度を可視化

Summary

葉緑体の表面から伸びる間質で満たされた細管である葉緑体ストロミュールの動態を調査するためのプロトコルが説明されています。

Abstract

ストロミュール、または「間質で満たされた細管」は、葉緑体の表面から伸びる細い管状の延長線で、植物細胞で普遍的に観察されますが、その機能は謎のままです。ストレスに対する植物の応答を調整する上での葉緑体の役割に対する注目が高まる一方で、近年、蛍光顕微鏡法やストロミュールの動態を迅速かつ正確に可視化できるタンパク質蛍光色素の進歩により、ストロムルとその葉緑体シグナル伝達動態との関係への関心が高まっています。ここでは、葉緑体ストロミュールの生物学を調査するための優れたモデルシステムであるNicotiana benthamianaの表皮葉緑体におけるストロミュール周波数を測定するための詳細なプロトコルを提供します。また、葉から葉緑体を抽出することで、in vitroで葉緑体を可視化する方法も提供しています。最後に、環境ストレス、化学処理、遺伝子サイレンシングなどの刺激に応答したストローム周波数の違いを分析するためのサンプリング戦略と統計的アプローチについて概説します。研究者は、これらのプロトコルを出発点として、葉緑体がストロモアを作る方法と理由を探求するための革新的な実験のための新しい方法を開発することができます。

Introduction

葉緑体は、光合成や他の多くの代謝過程を担う植物細胞のダイナミックなオルガネラです。葉緑体からのシグナル伝達経路も植物の生理学と発達に大きな影響を与え、環境ストレス、病原体、さらには葉の形に対する植物の応答を調整します^1-6。最近、生物学者たちは、葉緑体の構造についてあまり理解されていない側面、すなわち、葉緑体⁷の表面から伸びる非常に細い間質で満たされた細管であるストロムに関心を寄せています。

ストロミュールの生物学的機能は不明のままですが、ストロミュールの周波数は環境刺激^7-9に応答して変化することが知られており、ストロミュールはオルガネラ⁶間でシグナル伝達分子を伝達することができるかもしれません。 すべての種類の色素体(緑色の光合成葉緑体だけでなく、透明なロイコプラスト、デンプンで満たされたアミロプラスト、色素体など)はストロムルを形成し、ストロムはこれまでに調査されたすべての陸上植物種に見られます。ストロミュールは動的に伸縮し、数秒以内に現れたり消えたりすることも、比較的長時間静止したままでいることもできます。ストロミュールの生物学者が直面する大きなハードルの1つは、ストロミュールが劇的に異なる方法、組織、種を使用して研究されることが多く、ストロミュール生物学の文献間での比較が困難になっていることです。今後、ストロミュールの研究に使用される実験システムの標準的な方法と徹底的な説明は、葉....

Protocol

注：このプロトコルのために、我々はNの表皮にストロミュール周波数を測定することに焦点を当てていますベンタミアナの葉。 FNRtp：EGFP ¹³とNRIP1：セルリアン ⁶いくつかの安定したトランスジェニック系統は_、PRO 35Sを含め、この目的のために使用することができる生成されています。これらの線の両方が広範囲の条件の下で成長した葉の葉緑体ストロマにおける蛍光体の強い発現を示しました。また、葉緑体を標的とするフルオロフォアは一過Nに表現することができますアグロバクテリウムを使用してベンタミアナは ^13を変換します。 アグロバクテリウム浸潤がNでいくつかの基礎的な防御反応を誘発するので、これは、トランスジェニック株未満理想的ですアグロバクテリウム ベンタミアナとの相互作用は、潜在的に結果の解釈を複雑にし、葉¹⁴にストロミュール周波数を変更することができます。最後に、in vitroでストロミュール形成を可視化し、以下のセクション5で説明したように葉緑体は、遺伝的にコードされたフルオロフォアまたは蛍光色素のいずれかを使用して、任意の植物種から抽出することができる^。9,15....

Results

このプロトコルは、若いNの子葉に一日で、夜はストロミュール周波数を視覚化するために使用されましたベンサミアナタバコの苗。 Z-スタックからのスライスは、単一の画像（ 図1A）に併合されました。間質が（ 図1B）、黒表示されるように、視覚的な目的のために、その画像は彩度と反転しました。葉緑体は全くstromules（緑アスタリスク）を有していないか、または少なくとも1ストロミュール（マゼンタアスタリスク）を有するとのいずれかを標識しました。可視化87表皮葉緑体のうち、33はstromulesを持っています。したがって、この葉でストロミュール周波数は37.9パーセントです。

この分析を使用して、プロトコルは、昼と夜で24植物の合計中に他の21の植物（植物当たり1枚の葉）のために繰り返しました。日で、平均ストロミュール周波数は20.8±1.......

Discussion

stromulesを調査すると、三つの重要な要因は全体で考えなければならない：植物組織の（ⅰ）操作は最小限に抑える必要があり、（ii）の実験システムの一貫性が保たれなければならない、および（iii）サンプリング戦略は慎重に計画する必要があります堅牢な、再現性のあるデータが分析されていることを確認します。

Stromulesが著しく動的である：彼らは拡張し、顕微鏡下で観察者の目の前で急速に後退することができます。また、ストロミュール周波数（例えば、葉の創傷など）stromulesを可視化するために避けることができない刺激を含む治療法の広い範囲に応じて大きく変化します。ここに記載されたプロトコルで対処されているこの問題に対する主要な解決策は、一貫性のあるすべての変数を保持し、よく制御された実験を実施することです。これは、すぐに顕微鏡に持ち込む前に、可視化のため、各サンプルを調製し、例えば、。植物が損傷することがないようにしてください可視化直前まで。この問題に対する第2の解決策は、プロトコルの複雑さを最小にすることである。理想的には、任意の治療は、葉の除去または損傷を引き起こすことな.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
レーザー走査型共焦点顕微鏡	Carl Zeiss Inc	モデル: LSM710
カルボキシフルオレセインジアセテート (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
ジメチルスルホキシド(DMSO)	EMD	MX1458-6
ワーリングブレンダー	ワーリング	モデル:31BL92
Fiji	fiji.sc		生物学的画像を分析するためのオープンソースソフトウェア