蛍光顕微鏡でストロミュール頻度を可視化

サマリー

葉緑体の表面から伸びる間質で満たされた細管である葉緑体ストロミュールの動態を調査するためのプロトコルが説明されています。

要約

ストロミュール、または「間質で満たされた細管」は、葉緑体の表面から伸びる細い管状の延長線で、植物細胞で普遍的に観察されますが、その機能は謎のままです。ストレスに対する植物の応答を調整する上での葉緑体の役割に対する注目が高まる一方で、近年、蛍光顕微鏡法やストロミュールの動態を迅速かつ正確に可視化できるタンパク質蛍光色素の進歩により、ストロムルとその葉緑体シグナル伝達動態との関係への関心が高まっています。ここでは、葉緑体ストロミュールの生物学を調査するための優れたモデルシステムであるNicotiana benthamianaの表皮葉緑体におけるストロミュール周波数を測定するための詳細なプロトコルを提供します。また、葉から葉緑体を抽出することで、in vitroで葉緑体を可視化する方法も提供しています。最後に、環境ストレス、化学処理、遺伝子サイレンシングなどの刺激に応答したストローム周波数の違いを分析するためのサンプリング戦略と統計的アプローチについて概説します。研究者は、これらのプロトコルを出発点として、葉緑体がストロモアを作る方法と理由を探求するための革新的な実験のための新しい方法を開発することができます。

概要

葉緑体は、光合成や他の多くの代謝過程を担う植物細胞のダイナミックなオルガネラです。葉緑体からのシグナル伝達経路も植物の生理学と発達に大きな影響を与え、環境ストレス、病原体、さらには葉の形に対する植物の応答を調整します^1-6。最近、生物学者たちは、葉緑体の構造についてあまり理解されていない側面、すなわち、葉緑体⁷の表面から伸びる非常に細い間質で満たされた細管であるストロムに関心を寄せています。

ストロミュールの生物学的機能は不明のままですが、ストロミュールの周波数は環境刺激^7-9に応答して変化することが知られており、ストロミュールはオルガネラ⁶間でシグナル伝達分子を伝達することができるかもしれません。 すべての種類の色素体(緑色の光合成葉緑体だけでなく、透明なロイコプラスト、デンプンで満たされたアミロプラスト、色素体など)はストロムルを形成し、ストロムはこれまでに調査されたすべての陸上植物種に見られます。ストロミュールは動的に伸縮し、数秒以内に現れたり消えたりすることも、比較的長時間静止したままでいることもできます。ストロミュールの生物学者が直面する大きなハードルの1つは、ストロミュールが劇的に異なる方法、組織、種を使用して研究されることが多く、ストロミュール生物学の文献間での比較が困難になっていることです。今後、ストロミュールの研究に使用される実験システムの標準的な方法と徹底的な説明は、葉緑体形態のこれらの遍在する特徴の機能を発見するために重要になります。

ここでは、Nicotiana benthamianaの葉の表皮葉緑体におけるストロミュール形成を視覚化する方法を説明します。葉肉では、葉緑体が大きな三次元細胞に密集しているため、共焦点顕微鏡でストロムを正確かつ迅速に視覚化することが困難です。 対照的に、表皮細胞は比較的平らで、葉緑体が少なく、葉の表面にあるため、ストロモアを簡単かつ迅速に視覚化できます。N. benthamianaは、多くの植物種とは異なり、N. benthamianaの表皮のすべての細胞が葉緑体を作るため、これらの実験に理想的なモデルシステムです¹⁰。 シロイヌナズナを含むほとんどの植物の表皮では、気孔ガード細胞のみが葉緑体を持っていますが、他の表皮細胞は透明で比較的非晶質で光合成されていない色素体である「ロイコプラスト」を持っています^9,11,12。 したがって、A. thaliana epidermis の 1 つの視野では、一対のガード細胞の一握りの葉緑体しか表示されないかもしれませんが、N. benthamiana epidermis の視野には、数十または数百の葉緑体が含まれます。ただし、ここで説明するすべての方法は、ストロミュール生物学の他の問題を調査するために変更できます。例えば、A. thaliana⁹のLeucoplast stromulesを研究するために同じアプローチを使用しました。

プロトコル

注：このプロトコルのために、我々はNの表皮にストロミュール周波数を測定することに焦点を当てていますベンタミアナの葉。 FNRtp：EGFP ¹³とNRIP1：セルリアン ⁶いくつかの安定したトランスジェニック系統は_、PRO 35Sを含め、この目的のために使用することができる生成されています。これらの線の両方が広範囲の条件の下で成長した葉の葉緑体ストロマにおける蛍光体の強い発現を示しました。また、葉緑体を標的とするフルオロフォアは一過Nに表現することができますアグロバクテリウムを使用してベンタミアナは ^13を変換します。 アグロバクテリウム浸潤がNでいくつかの基礎的な防御反応を誘発するので、これは、トランスジェニック株未満理想的ですアグロバクテリウム ベンタミアナとの相互作用は、潜在的に結果の解釈を複雑にし、葉¹⁴にストロミュール周波数を変更することができます。最後に、in vitroでストロミュール形成を可視化し、以下のセクション5で説明したように葉緑体は、遺伝的にコードされたフルオロフォアまたは蛍光色素のいずれかを使用して、任意の植物種から抽出することができる^。9,15

注：植物栽培のための詳細な方法は、以前に記載されている¹⁶簡単に言えば、Nを育てます良好な排水を提供する任意のプロの土壌混合物を充填した4 "ポットでbenthamiana植物。。発芽のための湿潤環境を提供する最初の10-14日のための明確なプラスチック製のドームで苗をカバー14-に、製造元の指示に従って、任意の標準的な肥料ミックスを追加します。日齢の植物。〜100マイクロモル光子メートル^-2秒^-1の光強度を用いて、白色光の下で植物を育てる。水植物定期的に。

可視化のための1.準備葉試料

注：ストロミュールダイナミクスは^8を負傷の影響を受けているので、組織標本は、ストロミュールを可視化する直前に行われるべきです共焦点蛍光顕微鏡によってS。理想的には、サンプルは、植物から取り出した後15分で可視化する必要があります。

1. 非常に鋭いカミソリの刃を使用して、葉の小さな部分をカット。常に一貫性のために、葉の同じ領域を使用し、全ての実験において（向軸または背軸）と同じ面を視覚化するようにしてください。
2. すぐに水で満たされた5ミリリットル無針注射器で葉の部分を水没、葉の部分を切断した後、注射器から空気を除去し、指で注射器のオリフィスをカバーし、プランジャーを引くことにより真空を適用します。
   1. 葉の部分を損傷しないように静かにプランジャーを解放します。この2〜3回繰り返して、または空気の大部分が除去されているまで、葉は、深い緑であるように見えます。
      注：この手順はstromulesの正確な可視化を妨害する可能性が葉内の空気を除去します。
3. スライドに一滴の水を追加し、このドロップ上の葉の部分を配置します。その後、別のDRを追加葉の上部に水のオペアンプ、および葉の上にカバースリップを配置。気泡がある場合、それらが削除されるまで、静かにカバースリップをタップします。スライドは現在、顕微鏡検査のために準備ができて、すぐに可視化する必要があります。

共焦点蛍光顕微鏡2.可視化Stromules

1. 透過光では、（離れてかみそりの刃により損傷を受けた細胞からの）葉部の中心付近の視野に焦点を当てます。多くの葉緑体を同時に可視化することができるように、20X対物レンズを使用してください。細胞型は、後で識別できるように、必要に応じて、透過光で画像を保存します。
2. 使用している蛍光団のために適切な励起及び発光フィルターをレーザーに照明源を切り替えます。例えば、488nmのレーザーでGFPを励起し、500 nmから525 nmの間の排出量を収集します。
   1. 顕微鏡のソフトウェアを使用して、GFPのチャンネルを選択し、1愛にピンホール開口を調整するためにクリックRYユニット。 、レーザ走査を選択し、サンプルを可視化を開始し、その後、まだ明確stromulesを可視化しながら、レーザーパワーを最小化するために、レーザー強度および検出器の利得を調整するためにGFPチャンネルをクリックします。これらの設定が決定されると、それらはすべての実験を通じて、可能な限り一貫しておきます。
3. 視野内の葉の表皮を通過した一連の画像を収集するのz -stack実験を準備します。
   1. z -stackについては、（葉の表面付近の葉緑体は、試験した条件の下でより多くのstromulesを持っている場合、たとえば）のバイアスを回避するために、視野内のすべての表皮葉緑体が含まれます。
   2. すべてstromulesを含みますが、zの -stackに必要な時間を最小限に抑えることができますその最大間隔可能で画像を取ります。例えば、もし1エアリーユニットは、すべての2ミクロンの可能性が高い理想的な画像を撮影、2μmの深さでの合焦共焦点部分に相当します。
      注：葉epidermisが凹凸面であるので、サンプルによって異なります-stack のzの合計深さ;ほとんどのz -stacksは10月20日の画像が必要になりますが、それ以上を含むことができます。
   3. 走査速度と（可能ならば、通常5〜10分以内） のz -stackを迅速に収集されていることを確認するために、必要に応じて画像の解像度を調整します。後の分析のためのz -stackを保存します。

3.画像処理

1. 任意の画像解析ソフトウェアを使用してストロミュール周波数を決定します。このプロトコルのために、我々は、国立衛生研究所（http://imagej.nih.gov/ij/）、またはImageJを、フィジーの人気のアップグレードから公的に入手可能であるImageJを、（http://fiji.scを使用することをお勧めします/フィジー）。
2. ソフトウェアにおける最大値投影を使用して、単一の画像へのz -stackをマージします。
3. 特定し、手動でイメージ内のすべての葉緑体を数えます。
4. 各葉緑体について、目視か一つ以上のstromulesを決定マージされたZ -stack画像内の葉緑体から伸びる見られています。例については、 図1を参照してください。
   注：stromulesの生物学的機能が知られていないので、葉緑体から任意の薄い、間質で満たされた、管状延長が長さに関係なく、「ストロミュール」と考えることができます。それは約1μm、長さ⁷の大部分に沿って直径よりも小さい場合、原則として、葉緑体から間質で満たされた拡張子はストロミュールです。 1人が葉緑体がストロミュールを持っているかどうかを決定する際の主観的な差異を制御するために、すべての画像を分析していることを確認してください。第二の研究者は、独立して、さらに主観的な偏りを減らすためにストロミュール周波数を確認する必要があります。

4.実験計画およびサンプリング

注：ストロミュール周波数は葉の間に非常に可変であるが、いくつかの報告がINDIVI内ストロミュール周波数でほとんど変化があることを示唆していますデュアル葉^9,17。

1. 1つのリーフの1つの視野からのリーフストロミュール周波数を計算します。葉を捨てて、この独立したサンプルを検討してください。独立したサンプルのように1つのリーフからの眺めの別々のフィールドを考慮していません。
   注：そこストロミュール活動のどのように最良の指標の変化には強いコンセンサスがなく、stromulesの機能をより明確に定義されるまで、研究者はストロミュールダイナミクスを定量化することで創造的であり続けなければなりません。文学全体の比較のために、しかし、報告の一般的な基準は、より創造的なアプローチに加えて使用する必要があります。最低でも、必ず一つ以上のstromulesを持っている葉緑体の頻度を報告しています。
2. 視野内のstromulesを持っている葉緑体の頻度を決定します。視野内の全ての葉緑体を識別するためのImageJを使用してください。その後、各葉緑体のために、葉緑体は、少なくとも1ストロミュールを形成しているかどうかを判断します。 percentaとしてストロミュール周波数を報告ストロミュールと葉緑体のGE。
   注：一部の研究者は、ストロミュール周波数を報告する前に、アークサイン変換を持つ例えば、パーセンテージを変換します。これは統計分析のためのオプションであるが、ストロミュール周波数のアークサインは、直感的な値ではなく、研究の主なテキストまたは数値で報告する必要はありません。
   1. 別のアプローチとして、stromulesの合計数をカウントし、葉緑体の合計数で割り。
      注：ほとんどの状況下では、これは4.2に近づくように、同様の結果が得られます。単一葉緑体は多くstromulesを形成した場合には、しかしながら、ストロミュール頻度を過大評価することができます。代表的な結果の下に示す例では、例えば、いくつかの葉緑体は（87分の33のストロミュール対周波数）87分の40に葉緑体当たりstromules数を上げ、二つ以上のstromulesを持っています。
   2. また、代わりにストロミュール周波数のストロミュールの長さを決定します。長さを測定することができます。ImageJの中のフリーハンドラインツールでストロミュールをトレースすることもできます。
      注：stromulesの生物学的役割は不明のままであるので、それはストロミュール長さは、その機能に影響を与えることは明らかではありません。 （4.2に記載されているように）、それらが認められた場合ストロミュール長さに有意差を報告するだけでなく、ストロミュール周波数を報告しています。
      注：ストロミュール周波数が同じ成長条件下での異なる葉の間で高度に可変することができます。したがって、時間のかかることがストロミュール周波数を決定するが、実験は慎重に大きなサンプルサイズを含むように設計されるべきです。我々の研究室からのデータセットを用いて、標準で（各処置について少なくとも16の植物のサンプルサイズは、2つの条件の間でストロミュール周波数の少なくとも1.5倍の変化の統計的有意差があるかどうかを決定するために、通常は十分に強力であると判断しα= 0.05、β= 0.80）。
3. 結果の統計的分析。
   1. 私を比較するために、2つの治療のストロミュール周波数、（また、異分散t検定または不等分散を仮定し、t検定として知られている） ウェルチのt検定を使用します。
      注：このテストは、従来のスチューデントのt検定ほど強力ではありませんが、それはストロミュール頻度分布の分散は、治療間類似していることを想定していないので、 ウェルチのt検定が有利です。
      注：ストロミュール周波数が「割合」であるので、その標本分布は、理論的にスキュー統計分析を、サンプルサイズが非常に低い場合、またはストロミュール周波数（近い0％に）または非常に非常に低い場合に可能性があり、二項はなく正常であると予測されます高い（100％に近いです）。いくつかのレポートは、正規分布に二項分布を変換し、したがって、 スチューデントt検定またはANOVAの標準的な要件を満たすように意図されている統計的分析の前にアークサイン変換を使用しています。実際には、しかしながら、rcsine変換は、統計分析にほとんどまたは全く影響を持っているので、お勧めできません。代わりに、統計的検出力を増加させ、データの解釈の誤りを減少させるサンプルサイズを増加させるために実験を繰り返します。
   2. 統計的手法が使用されているものは何でも、慎重にサンプリング戦略、サンプルサイズ、統計的検定、および各実験のためのp値を報告してください。
      注：研究者は確実に得る正確なp値を報告する必要がありますが、生物学の他の分野と同様に、0.05未満のp値は、「統計的に有意な」と考えることができます。 Pは、2つまたは3つの実験でサンプルサイズを増加させる、わずかに0.05を超える場合観察された差は、再現性と統計的に有意であるかどうかを明確にするために役立つことができます。

5.ストロミュールダイナミクスを可視化するために無傷葉緑体の抽出

注：いくつかの方法試験管 ¹⁵ 内ストロミュール形成に関する最近の研究では、わずかに異なるプロトコルを含む、葉から葉緑体を単離するために使用されてきました。以下に詳述するプロトコルは、生化学的に純粋な葉緑体のサンプルが得られない、比較的簡単な方法を使用しますが、その代わりに、無傷の、健全な葉緑体^9,18の大量を分離ありません。

1. 50mMのヘペスのNaOH、330 mMのソルビトール、2mMのEDTA、1.0のMgCl _2、および1.0mMののMnCl _2：コールド抽出緩衝液を準備します。使用前のNaOHとHCl、および冷蔵で6.9にpHを調整します。
   注：冷たいバッファを使用し、可能なが無傷の葉緑体の高い比率をもたらすときにサンプルを氷上で維持し、必要ではないが。
2. 50mMのヘペスのNaOH、330 mMのソルビトール、2mMのEDTA、1.0mMののMnCl _2、1.0のMgCl _2、10mMのKClと1.0のNaCl：分離バッファを準備します。使用前にNaOHおよびHClおよび冷蔵で7.6にpHを調整します。
3. 葉がない場合はジメチルスルホキシド（DMSO）中の50mM CFDAストック溶液（1.0ミリリットルDMSOあたり2.3ミリグラムのCFDA）：遺伝的にエンコードされた間質蛍光団を発現している、カルボキシフルオレセインジアセテート（CFDA）溶液を調製。
   注：正確な濃度は重要ではありません。すべての回で暗所にCFDA在庫を保管してください。 -20℃で50 mMのCFDAの少量のアリコートを保管してください。
4. 葉緑体を単離するために、いくつかの植物から〜5〜10グラムの葉を除去し、簡単に冷たい水ですすいでください。すぐに50ミリリットルの冷抽出緩衝液に移します。いくつかの短いパルスでブレンダーを使用して葉を挽きます。 （50ml×2回）遠心管に抽出葉緑体を分割し、葉の破片を除去するために、チーズクロスの二、三の層を通して濾過し、750×gで1分間遠心。
5. 上清を捨て、10mlの単離緩衝液中で緑の葉緑体を懸濁します。 750×gで1分間再び遠心分離し、上清を捨て、そして5ミリリットルに最終容量をもたらすために分離バッファに葉緑体を懸濁します。
6. 転送201;スライドに葉緑体のlは、カバーガラスでカバーし、顕微鏡検査を開始します。
   注：プラスチド標的蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック植物からの葉緑体は現在、共焦点蛍光顕微鏡による可視化のための準備が整いました。
7. stromulesを可視化するためにプラスチド標的に蛍光タンパク質を発現していない植物から葉緑体を染色します。
   1. 5ミリリットル単離緩衝液中に葉緑体懸濁に50 mMのCFDAの株式の5μlを添加します。 50μMに最終濃度を持参してください。
   2. 葉緑体を5分間インキュベートし、その後、スライドに少量（〜50μl）を転送し、カバースリップでカバーし、顕微鏡検査を開始することを許可します。
   3. FITCまたはGFPフィルターセットを使用してください。単一の孤立した葉緑体を可視化するために、同時に多くの葉緑体を可視化する20Xの目的、またはより高い目標を使用します。
      注：CFDAは無傷の葉緑体のストロマ内部に蛍光を発します。
   4. 強いバックグラウンドの蛍光が存在する場合、chloを洗いますCFDA、750×gで1分間遠心分離器で5分間のインキュベーション後に10ミリリットル単離緩衝液中で再びroplasts、上清を捨て、そして5ミリリットル単離緩衝液中に再懸濁。

結果

このプロトコルは、若いNの子葉に一日で、夜はストロミュール周波数を視覚化するために使用されましたベンサミアナタバコの苗。 Z-スタックからのスライスは、単一の画像（ 図1A）に併合されました。間質が（ 図1B）、黒表示されるように、視覚的な目的のために、その画像は彩度と反転しました。葉緑体は全くstromules（緑アスタリスク）を有していないか、または少なくとも1ストロミュール（マゼンタアスタリスク）を有するとのいずれかを標識しました。可視化87表皮葉緑体のうち、33はstromulesを持っています。したがって、この葉でストロミュール周波数は37.9パーセントです。

この分析を使用して、プロトコルは、昼と夜で24植物の合計中に他の21の植物（植物当たり1枚の葉）のために繰り返しました。日で、平均ストロミュール周波数は20.8±1...

ディスカッション

stromulesを調査すると、三つの重要な要因は全体で考えなければならない：植物組織の（ⅰ）操作は最小限に抑える必要があり、（ii）の実験システムの一貫性が保たれなければならない、および（iii）サンプリング戦略は慎重に計画する必要があります堅牢な、再現性のあるデータが分析されていることを確認します。

Stromulesが著しく動的である：彼らは拡張し、顕微鏡下で観察者の目の前で急速に後退することができます。また、ストロミュール周波数（例えば、葉の創傷など）stromulesを可視化するために避けることができない刺激を含む治療法の広い範囲に応じて大きく変化します。ここに記載されたプロトコルで対処されているこの問題に対する主要な解決策は、一貫性のあるすべての変数を保持し、よく制御された実験を実施することです。これは、すぐに顕微鏡に持ち込む前に、可視化のため、各サンプルを調製し、例えば、。植物が損傷することがないようにしてください可視化直前まで。この問題に対する第2の解決策は、プロトコルの複雑さを最小にすることである。理想的には、任意の治療は、葉の除去または損傷を引き起こすことな...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
レーザー走査型共焦点顕微鏡	Carl Zeiss Inc	モデル: LSM710
カルボキシフルオレセインジアセテート (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
ジメチルスルホキシド(DMSO)	EMD	MX1458-6
ワーリングブレンダー	ワーリング	モデル:31BL92
Fiji	fiji.sc		生物学的画像を分析するためのオープンソースソフトウェア