本明細書において、我々は、末梢T細胞受容体レパートリーの相補hemichainと、関心対象の抗原特異性を有する、既存のTCRのTCRα又はTCRβをペアリングすることにより、抗原特異的T細胞受容体（TCR）を生成する新規な方法を記載します。 デノボ生成されたTCRは、親和性を変化させて、抗原特異性を保持します。
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この記事について
サマリー
要約
T細胞受容体（TCR）は、免疫療法の有望なモダリティとして腫瘍を標的とするT細胞の特異性を指示するために臨床的に使用されます。そのため、様々な腫瘍関連抗原に特異的なTCRをクローニングすることは、多くの研究の目標でした。効果的なT細胞応答を誘発するために、TCRは、最適な親和性で標的抗原を認識しなければなりません。しかし、このようなTCRをクローニングすることが課題と多くの利用可能なのTCR同族抗原に対する準最適な親和性を有するとなっています。このプロトコルでは、我々はhemichain中心主義を利用することによって、既存のTCRを使用してデノボ高親和性抗原特異的TCRをクローン化する方法について説明します。いくつかのTCRのために、それぞれのTCRα又はTCRβのhemichainは抗原認識に等しく寄与しないことが知られており、ドミナントhemichainを中心hemichainと呼ばれます。我々はオリジナルのカウンターチェーンは異なるカウンター鎖を有する中心のhemichainを組み合わせることで、我々は抗原秒を維持することが可能であることが示されていますpecificity、同族抗原に対するその相互作用の強度を変調しながら。したがって、所与のTCRの治療可能性を中心とカウンタhemichains間の対形成を最適化することによって改善することができます。
概要
T細胞受容体（TCR）は、TCRαおよびTCRβ鎖からなるTリンパ球によって発現されるヘテロ二適応免疫受容体です。これらは、HLA /ペプチド複合体の実質的に無制限の構成を認識することができる非常に多様なレパートリーを産生するV（D）J遺伝子セグメントの体細胞再編成によって生成されます。臨床的には、腫瘍関連抗原に特異的なクローン型TCRを発現するように操作されたT細胞は癌1の様々な有効性が実証されています。しかし、この目的のためにクローニングされた多くのTCRは、それらの治療的適用を制限する目的の抗原に対して十分な親和性を欠いています。
ここでは、チェーン中心主義を利用することにより、既存のTCRのためにこの制限を克服する方法を説明します。それは1のTCR hemichainは、標的抗原2の認識で、より支配的な役割を果たし得ることが報告されている、ここでは中心主義と呼ばれます。結晶構造解析は、その1中心を示していますTCRのhemichainは3,4 MHC /ペプチド複合体上のフットプリントの大部分を占める可能性があります。この概念を使用して、我々は以前にSIG35αTCRαがTCRβ鎖の多様なレパートリーと対HLA-A2 5により提示MART1 27-35ペプチドに対する反応性を維持することができることを実証しました。同様の結果が中心TCRβのhemichainは、様々なTCRα鎖と対にし、HLA-A24 6により提示WT1 235-243ペプチドについて反応性を維持しTAK1 TCRで得られました。 MART1およびWT1の両方が腫瘍関連抗原です。チェーン中心主義は、異なるVβ11TCRβ鎖7を有するヒトのiNKT TCRの不変Vα24-Jα18（Vα24i）TCRα鎖を組み合わせることで、CD1d拘束不変ナチュラルキラー（iNKT細胞）TCRの抗原認識を研究するために適用されました。
全ての場合において、我々は、トランスによってTCRのデノボレパートリーを生成することができました導入hemichainが内因性TCRαまたはTCRβカウンター鎖と対になった末梢血T細胞、に中心のTCRのhemichainをducing。本質的には、中心hemichainは一緒に対に適切なカウンタ鎖を同定するために用いることができるベイトとして機能まだ親和性が異なる、目的の抗原特異性を維持するTCRを形成します。これらの新規レパートリーから、我々は既存のTCRと比較して、標的抗原に対する改善された相互作用の強度を有するクローン型TCRを単離することができました。したがって、我々は、この方法は、臨床応用のための最適なTCRを特定のパイプラインを加速すると考えています。
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プロトコル
1.レトロウイルスは、利息のエンコーディングTCR Hemichainを構築する準備
- 以降のTCR遺伝子の挿入を可能にするようにするpMXベクターを線状化。 3時間37℃（ 表1）にEcoRIおよびNotI制限酵素でプラスミドDNAを消化8。
- 1.2％アガロースゲル上で消化されたプラスミドの電気泳動を行います。物品は約4,500塩基対（BPS）のバンド、および市販のゲル抽出キット9を用いて、30μlの滅菌水に溶出します。
- 設計5 'および3'にもそれぞれ8するpMXベクターのEcoRIおよびNotI消化部位と重複15-20 BPSをコードする目的のTCR遺伝子のためのプライマー。
- プライマーを用いてTCR遺伝子を増幅します。 PCR産物の電気泳動を行い、ステップ1.2で説明したように約1000 BPSのバンドを溶出させます。
- 市販のプラスミドをそれぞれ線状断片を組み合わせて消化したベクターにクローンTCR遺伝子組立マスターミックス試薬と1時間50℃でインキュベートします。
注：各成分の相対ボリュームに対して、製造業者のプロトコルを参照してください。この組立方法は、もともとギブソンら 10によって記載された技術に基づいています。 - 人間の神経成長因子受容体フリン切断部位、セリン-グリシンリンカー、および2Aシーケンス12,13によって分離された（ΔNGFR、アミノ酸1から277）11の切断型で形質導入された細胞をマークする（オプション）タグTCR遺伝子。断片の末端と重複し、工程1.3-1.5に記載されるようにプラスミドを組み立てる設計プライマーをコードする配列。
注：これらの配列は参考文献11-13に記載されています。 - 化学的にコンピテントE.を変換製造業者のプロトコル14次の組み立てプラスミドで大腸菌 。種子は、寒天プレート上の細菌（20 mg / mlでLB培地（LB）、15 mg / mlで寒天とを1μg/ mlのアンピシリン）を形質転換し、18時間37℃でインキュベートします。
- 文化37℃、毎分200回の振とう培養器で16時間50 LB培地1ml（20 mg / mlとLBとを1μg/ mlアンピシリン）で単一の細菌コロニー。
- 製造業者のプロトコルに従って、市販のミディプレップキットを使用してプラスミドを精製します。周りを1μg/μlの濃度にプラスミドを希釈します。
注：プラスミド精製プロトコルは、アルカリ抽出法15に基づいています。
2.安定したパッケージング細胞株を生成します
注：両方293GPGとPG13細胞が接着性です。ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養細胞を、10％ウシ胎児血清（FCS）および50μg/ mlのゲンタマイシンを補充しました。トランスフェクションの前に1μg/ mlのテトラサイクリンと文化293GPG細胞。すべてのステップの間、5％CO 2で37℃で細胞をインキュベートします。
- トランスフェクト293GPGは、ステップ1.9で得られたhemichainをコードするベクターでUSIを細胞T75フラスコ内で培養16をパッケージング製造者のプロトコル1 7以下の市販のトランスフェクション試薬をngの。注：50から60までパーセントの密集度でのトランスフェ293GPG細胞。
- 吸引293GPG細胞用培地と新鮮なDMEM培地1日後、トランスフェクションの10ミリリットルを追加します。
- 収穫は一過シリンジに培地を移し、0.45μmフィルターを通過させることにより2日ステップ2.2の後、トランスフェクト293GPG細胞からウイルスを産生しました。
注：ウイルスは、直ちに使用するか、または将来の使用のために-80℃で保存することができます。 - T25フラスコでの培養は、1×10 5 PG13細胞。血球計数器を用いて細胞を数えます。 1日、吸引培地とポリブレンの8 / mlのと一緒に、ステップ2.3および1.5ミリリットルDMEM培地から293GPG由来ウイルスの1.5ミリリットルを追加した後。
- 4日間1日1回のステップ2.4で説明したように、関心のTCRのhemichainをコードするレトロウイルスを産生する安定PG13パッケージング細胞株を確立するために、メディアを変更します。
- 吸引し培地と交換してください24時間さらに培養のための最後の感染後PG13細胞株のための新鮮なDMEM培地で。
注：0.05％トリプシン-EDTA溶液で剥離することにより凍結またはサブ培養細胞。 - 三日間細胞を播種した後、ステップ2.3に記載のように形質導入PG13細胞株からのウイルスを生成するために、T75培養における2×10 6個の細胞を10mlのDMEM培地、および収穫ウイルスフラスコ。
注：ウイルスは最高のすぐに使用されますが、2つまでの数ヶ月のために-80℃で保存することができます。
3.アクティベーションおよび形質導入ヒトT細胞の
注：ヒトサンプルを得て、機関の倫理委員会承認プロトコールに従って使用されます。ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）の代わりにFCSの10％ヒト血清を添加した培地および50μg/ mlのゲンタマイシンで培養初代ヒト細胞です。すべてのステップの間、5％CO 2で37℃で細胞をインキュベートします。
- 密度によってヒト末梢血単核細胞（PBMC）を単離し製造業者のプロトコル18以下の勾配分離。
- レトロウイルス感染のために必要な増殖を誘導するためにT細胞を活性化。組換えヒトインターロイキン2抗CD3モノクローナル抗体の（のrhIL-2）および50 ng / mlでの100 IU / mlのRPMI培地5ml中の6ウェルプレート中のウェルあたり文化2×10 7新鮮なまたは解凍したPBMC、 （クローンOKT3）。
- 三日は、刺激を投稿4分間350×gでピペッティングし、遠心分離することによってT細胞を収集します。上清を捨て、ステップ2.7からPG13ウイルスの1ミリリットル中に再懸濁し、24ウェルプレートにウェル当たり0.5〜1×10 6 T細胞を播種する、とのrhIL-2の200 IU / mlを添加したRPMI培地の1ミリリットル。 1時間1,000×gで32℃での遠心分離プレート。
- 24時間後、4分間350×gでピペッティングし、遠心分離することによってT細胞を収集します。ステップ2.7からPG13ウイルスの1ミリリットルで上清と再懸濁細胞を捨てて、のrhIL-2の200 IU / mlを添加したRPMI培地の1ミリリットル。 6未感染の合計に対して、この手順を繰り返しイオン。
注：感染症の数は、細胞株をパッケージングすることにより産生されたウイルスの力価に応じて最適化する必要があります。必要に応じて、毎日の細胞の20-30％を除去することにより流路T細胞が異常増殖を防止します。 - 24時間最後の感染後、4分間350×gでピペッティングし、遠心分離することによってT細胞を収集します。さらなる培養のためのrhIL-2の100 IU / mlのRPMI培地中で上清と再懸濁細胞を捨てます。
- 2~3日ステップ3.5、15分間、4℃で30分間、4℃でHLAマルチマーで染色T細胞は、抗ヒトCD3および共受容体モノクローナル抗体（mAb）の後。フローサイトメトリーによって分析します。 19 - （3 図1）陰性対照として無関係の多量体および/または非形質導入細胞を使用してください。
- 導入された中心hemichainがTCRα鎖である場合は、20フローサイトメトリーにより、市販のVβ特異的抗体のパネルを使用してデノボ多量体陽性細胞のVβの使用状況を分析。
4.クローニング・デ・ノボ TCRカウンターhemichains
- フロー支援細胞選別によって、ステップ3.6で新たに多量陽性集団をソートします。
- 酸グアニジンチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出法21,2 2を使用してソートT細胞からRNAを単離します。
注：RNAを-80℃で保存することができるが、できるだけ早くのcDNAを生成するために使用されるべきです。 - 製造業者のプロトコル23,24以下の市販の逆転写酵素PCRキットを用いて抽出したRNAからcDNAライブラリーを合成します。
- TCRβカウンター鎖をクローニングした場合、ステップ3.7で決定されるように、Vβ遺伝子とTCRβ定常領域特異的なプライマーを設計し、ステップ1.3から1.9に記載されているように、全長TCRβ遺伝子をクローニングします。カウンターチェーンがTCRαであればそうでない場合は5.1に進み、ステップ4.5を参照してください。
- 市販のVα特異的抗体が限られている、したがって、Vα遺伝子の使用はできませんフローサイトメトリーによって決定されます。市販の5 'RACEキット6を用いて、cDNA末端の5'迅速増幅（RACE）25を介してクローンTCRαカウンター鎖、。
- 製造業者のプロトコルに従ってステップ4.2で抽出されたRNAから5 'RACE互換性のcDNAを合成。
- 表2に記載したように第1ラウンドのPCRを行います。
- PCR産物の電気泳動を行い、ステップ1.2で説明したように、1,100 bpsのバンドを溶出します。
- テンプレートとして第1回目のPCR産物を使用して、 表3に記載されているように第2ラウンドのPCRを行います。
注： 表3の下に示すプライマー配列をEcoRIおよびNotIにクローニングするために設計されたのPMXベクターを消化しました。 - PCR産物の電気泳動を行い、ステップ1.2で説明したように、約1000 BPSのバンドを溶出します。
- EcoRIとNotIにクローンTCRα遺伝子をするpMXベクターおよびプリ消化しましたステップ1.5から1.9に記載されているように年度のプラスミド。
5.再構成新規抗原特異的TCRクローン
注：培養ジャーカット細胞を76及び10％のFCSおよび50μg/ mlのゲンタマイシンを補充したRPMI培地中でその後の細胞株。すべてのステップの間、5％CO 2で37℃で細胞をインキュベートします。
- ステップ2.3で作製293GPGウイルスを使用して中心のTCR hemichainと（ - / -ヒトT細胞株または同等TCR）ジャーカット76セル26に伝達します。ジャーカット76、シードRPMI培地の1ウイルスのミリリットルと1ミリリットルで24ウェルプレート中のウェルあたり5×10 4細胞について。 1時間1,000×gで32℃での遠心分離プレート。
- 感染後24時間は、4分間350×gでピペッティングし、遠心分離によってhemichain形質導入されたジャーカット76細胞を収集します。さらなる培養のための新鮮なRPMI培地で上清と再懸濁を捨てます。
- hemichainは2-3日ステップ5.2後にタグ付けされた分子である場合に染色することによって、形質導入された細胞を精製流れアシストまたは磁気アシストセル（オプション）27をソートすることによって、その後抗NGFRモノクローナル抗体コンジュゲート蛍光体でる。
- ステップ2.1〜2.3に続いて、293GPGウイルスはステップ4.4または4.5からクローン化TCRを反鎖をコード生成します。
- 完全にTCRを再構成するには、安定的にステップ5.4からウイルスを用いて、ステップ5.1から5.3で生成された中心のTCRのhemichainを発現するT細胞株を形質導入します。ステップ5.1から5.2に記載されているように形質導入を行います。
- 2-3日ステップ5.5 27の後に、製造業者のプロトコルに従って抗CD3磁気補助セルソーティングを使用して、CD3 +トランスフェを精製します。
- 、抗原特異性を検証し、抗CD3および/またはコレセプターモノクローナル抗体、およびHLA多量で、様々なカウンター鎖と対をなす中心のTCRのhemichainで構成されるクロノタイプTCRを発現するトランスフェクタントを染色するために、3~5日は、CD3精製を投稿してください。 19 -フローサイトメトリーによる細胞（5 図4）を分析します。
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結果
チェーン中心であるhemichainの予備知識なしに、TCRα及びTCRβ鎖を別々にクローン化されるべきであり、HLA-A24 / WT1反応TAK1 TCR（ 図1）の場合に行われた末梢血T細胞への形質導入します。 TAK1βの形質導入は、抗原特異的T細胞の顕著に高い頻度が得られました。逆に、非中心hemichainの形質導入は、TAK1α鎖（ 図1）で見られるように、 デノボ多量体陽性T細胞が得られないでしょう。分析中、NGFR +細胞上のゲートは、TCR遺伝子は、具体的には（ - 2 図1）形質導入細胞を分析するためにタグを付けられた場合。支配的であることが知られている一方、単一中心hemichainは、例えばSIG35α不変Vα24TCRα鎖（ 図2及び3）、形質導入することができます。それぞれのcognに特異的なT細胞中心...
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ディスカッション
この方法の成功した適用のための最初の要件は、関心のhemichain一次T細胞の十分な変換効率を達成することです。我々の経験、ヒト一次T細胞における導入遺伝子の安定的かつ効率的な発現のレトロウイルスベクターの結果として、パッケージング細胞株とするpMXとしてPG13を用いて組み合わせました。 PG13パッケージング細胞を形質導入効率を向上させるために高力価のパッケージング細胞を選択するためにクローン化された単一細胞であることができます。さらに、T細胞の増殖はまた、レトロウイルスによる高導入効率のために必要とされます。記載されたプロトコルでは、のrhIL-2の高濃度と共に可溶性抗CD3モノクローナル抗体OKT3による刺激は、細胞分裂を誘導するために必要な活性化シグナルを提供します。単球はおそらくFc受容体との結合を介して、可溶性OKT3の刺激能力のために必要とされます。したがって、バルクPBMC、及びませんが、T細胞を精製し、この特定の刺激プロトコルのために必要とされます。 T細胞をRPMI中で培養されるべき最適な実験結果のためのヒト血清を補充しました。ここに記載の他の全ての細胞は、ウシ胎仔血清の存在下で培養することができます。
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開示事項
University Health Network は、N.H.、M.N.、および TO が発明者として指名されているこの方法論に関連する特許を申請しました。他の著者には金銭的な利益相反はありません。
謝辞
この作業はNIH助成金R01 CA148673 (NH); The Ontario Institute for Cancer Research Clinical Investigator Award IA-039 (NH);BioCanRX触媒助成金(NH);プリンセスマーガレットがん財団(MOB、ニューハンプシャー州);カナダ衛生研究所カナダ大学院奨学金(TG);カナダ自然科学工学研究評議会大学院奨学金(TG);オンタリオ州(TG、MA);グリエッティフェローシップ賞(TO)。HLAおよびCD1dモノマーは、NIHテトラマーコア施設から提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.05% Trypsin-EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL | |
| 293GPG cells | Generated by Ory et al. (ref 8) | ||
| 寒天 | Wisent Bioproducts | 800-010-CG | |
| Agarose Wisent | Bioproducts | 800-015-CG | |
| Ampicillin ナトリウム塩 | Wisent Bioproducts | 400-110-IG | |
| クロロホルム | バイオショップ | CCL402 | |
| デオキシヌクレオチド (dNTP) 溶液ミックス | ニューイングランドバイオラボ | N0447L | |
| DMEM、高グルコース、ピルビン酸 | ライフテクノロジー | ||
| エコリ | ニューイングランドバイオラボ | R0101S | |
| EZ-10 スピンカラム DNA ゲル抽出キット | BS353 | ||
| ウシ胎児血清 | ライフテクノロジー | ||
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| フィルター | Corning | 431220 | 0.45 mm 細孔 SFCA 膜 |
| FITC 標識抗ヒト CD271 (NGFR) mAb | Biolegend | 345104 | クローン ME20.4 |
| FITC 標識抗ヒト CD3 mAb | Biolegend | 300440 | クローン UCHT1 |
| ゲンタマイシン | ライフ テクノロジー | ||
| ギブソン アセンブリ マスター ミックス | ニューイングランド バイオラボ | E2611L | マルチピース DNA アセンブリに使用 |
| HLA-A2 ペンタマー | プロイミューン | 抗原ペプチドに依存する | HLA-A2/MART1 マルチマー ここで使用するマルチマーは、プロイミューン |
| HLA/CD1d モノマー | NIH テトラマー コア施設 | から購入しましたNIHテトラマーコア施設によって提供されるプロトコルに従ってモノマーを多量化 | |
| ヒトAB血清 | バレーバイオメディカル | HP1022 | |
| ヒトCD3マイクロビーズ | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | |
| IOTestベータマークTCR Vベータレパートリーキット | ベックマンコール | ターIM3497 | |
| Jurkat | Heemskerkによって生成された76細胞 et al. (ref 10) | ||
| LB Broth | Wisent Bioproducts | 800-060-LG | |
| LS MACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | ニューイングランド・バイオラボ | C2987I | |
| NEBuffer 3.1 | ニューイングランド・バイオラボ | B7203S | EcoRIおよびNotI消化に使用 |
| NotI | ニューイングランド・バイオラボ | R0189S | |
| NucleoBond Xtra Midi | Macherey-Nagel | 740410 | プラスミド精製に使用 |
| PC5-結合抗ヒト CD8 mAb | ベックマン・コールター | B21205 | クローン B9.11 |
| PG13 細胞 | ATCC | CRL-10686 | |
| Phusion HF バッファーパック | ニューイングランド バイオラボ | B0518S | |
| Phusion ハイフィデリティDNAポリメラーゼ | ニューイングランドバイオラボ | M0530L | |
| pMX レトロウイルスベクター | Cell Biolabs | RTV-010 | |
| ポリブレン | Sigma-Aldrich | H-9268 | |
| プロロイキン(組換えヒトインターロイキン-2) | ノバルティス | Rxによる同等の製品のみ | Sigma-Aldrich |
| 精製抗ヒトCD3抗体 | バイオレジェンド | 317301クローンOKT3、T細胞刺激に使用 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875119 | |
| SA-PE | Life Technologies | S866 | NIHテトラマーコア施設のモノマーの多量体化に使用 |
| SMARTer RACE 5'/3' キット | Clontech | 634858 | |
| 滅菌水 | Wisent Bioproducts | 809-115-LL | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen | 18080051 | for cDNA synthesis |
| Syringe | BD | 301604 | 10 ml, slip tip |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| TransIT-293 | Mirus Bio | MIR 2700 | を使用して 293GPG 細胞をトランスフェクション |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596026 |
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