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遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入

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DOI:

10.3791/54698

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2016年11月4日

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1Department of Comparative Biomedical Sciences, The Royal Veterinary College, 2Institute of Physiology I, Cardiology & Vascular Medicine, Eberhard Karls University of Tuebingen, 3Department of Clinical Science and Services, The Royal Veterinary College

この記事について

サマリー

多くの実験系は、免疫応答におけるT細胞の発達および機能を調節するメカニズムを理解するために利用されています。ここではレトロウイルス形質導入を用いた遺伝子アプローチは、調節経路を同定することに、経済的、時間効率的な、そして最も重要なのは、非常に有益である、記載されています。

要約

Helper T細胞の発生と機能は、特定の病原体を排除しながら自己免疫を防ぐ適切な免疫応答を誘導するために、厳密に制御されなければなりません。ヘルパーT細胞の発生と機能を制御するメカニズムを理解するために、さまざまなモデル生物を含む多くのアプローチが利用されてきました。しかし、マウスモデルを用いた研究は、遺伝的、細胞的、生化学的システムが利用可能であるため、非常に有益であることが証明されています。多くの研究室で使用されているマウスの遺伝的アプローチの1つに、一次ヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入があります。これは、比較的容易であるため、強力なアプローチであり、分子生物学と免疫学の基本的なスキルを持つほぼすべての研究室にアクセスできます。したがって、野生型または変異型の複数の遺伝子のヘルパーT細胞の機能について容易に試験し、その重要性と作用機序を理解することができます。このアプローチを最適化し、ここでは、高力価レトロウイルスの産生、初代マウスヘルパーT細胞の単離、レトロウイルスによるそれらの形質導入、および異なるヘルパーサブセットへの分化のためのプロトコルについて説明します。最後に、このアプローチの使用については、ヘルパーT細胞の発生と機能を制御する経路を制御するためにマイクロRNA(miRNA)が利用するメカニズムの解明で説明しています。

概要

免疫反応は、感染を排除するために高度に制御されなければなりませんが、自己免疫につながる自己組織への攻撃を防ぐ必要があります。ヘルパーT細胞は免疫応答の調節に重要な役割を果たしており、その発生と機能を理解するために多大な努力が払われてきました(最近のいくつかのレビュー1-3で示されています)。しかし、多くの疑問が残されており、ヘルパーT細胞の発生と機能を制御するメカニズムを研究するために多くのアプローチが利用されてきました。これらは、in vitro細胞培養システムの使用から動物全体まで多岐にわたります。細胞培養システム、特に細胞株を使用する細胞培養システムには、使いやすさと、高度な生化学分析を行うための大量の材料を生成する能力という利点があります。しかし、免疫応答で発生する実際の状態を再現する能力が限られていることに苦しんでいます。対照的に、全動物実験は関連性という利点がありますが、操作の難しさや正確な制御を行う能力に加えて、多額のコストと倫理的影響に苦しむ可能性があります。それにもかかわらず、今日のヘルパーT細胞研究の大部分は、細胞株が動物全体で発生する正確なステップを複製できないため、初代T細胞を含む全動物実験の使用を依然として必要としています。したがって、非常に情報量の多い費用対効果の高いアプローチを利用することが不可欠です。

遺伝学はヘルパーT細胞の発生と機能を研究するための強力なツールの一つですが、遺伝子ノックアウトや導入遺伝子を含む従来の方法は時間と費用がかかるため、小さな研究室では手の届かないことが多いです。しかし、レトロウイルス形質導入は、特定の遺伝子産物のメカニズムを研究するための強力で迅速、かつ費用対効果の高い遺伝的アプローチを提供します。そのため、ヘルパーT細胞の発生と機能を研究する論文で一般的に使用されています。

ヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入の手順を最適化しました。pMIG(Murine Stem Cell virus-Internal ribosomal entry site-Green fluorescent protein)レトロウイルス発現ベクターを利用しており、レトロウイルスの長末端反復(LTR)4から目的の遺伝子をクローニングして発現させることができます。さらに、挿入された目的遺伝子の下流には、内部リボソームエントリー配列(IRES)とそれに続く緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子があるため、形質導入された細胞はGFPの発現を容易に追跡できます。このベクターはもともとマウス幹細胞ウイルス(MSCV)ベクターに由来し、LTRのリプレッサー結合部位に変異が含まれており、サイレンシングに耐性があるため、ヘルパーT細胞5,6を含む多くの細胞タイプで高発現しています。高力価レトロウイルスの作製には、ヒト胚性腎臓(HEK)293T細胞の簡単な一過性トランスフェクションプロトコルと、MIGベクターとレトロウイルスGAG、Pol、およびEnv遺伝子を発現するヘルパーウイルスベクターが必要です。このために、pCL-Ecoヘルパーウイルスベクター7は、高力価の複製、無能なレトロウイルスの産生にうまく機能します。

ここでは、レトロウイルス産生と初代マウスT細胞の形質導入のためのこれらのプロトコルが説明されています。また、このアプローチを使用して、ヘルパーT細胞の分化を制御する遺伝子発現のmiRNA制御を研究する結果の一部に加えて、miRNAは長さが約22ヌクレオチドの小さなRNAで、メッセンジャーRNAをコードするタンパク質の相同配列を標的とし、翻訳と誘導を抑制することにより、転写後的に遺伝子発現を調節しますメッセージの不安定性 8,9.miRNAは、発生遺伝子の制御に重要な役割を果たします。miRNAを産生できない胚は非常に早い段階で死滅するため、発生の最も早い段階で不可欠です10。さらに、miRNAは、多くの組織の後の発達において重要です。それらは、発生プログラム1に必要な遺伝子の発現を微調整することで機能すると考えられています。ヘルパーT細胞では、miRNAは複数の役割を果たし、制御性T細胞(Treg)の発達に必要です11-14。私たちは、Treg分化のmiRNA制御のメカニズムを解剖する手段としてレトロウイルス形質導入を使用しました15。このような研究を通じて、レトロウイルスを介した過剰発現によって重要な個々のmiRNAが決定されました。その後、これらのmiRNAによって制御される関連遺伝子を同定し、ヘルパーT細胞の分化におけるmiRNAによって制御される分子経路を理解しました。

プロトコル

これらのプロトコルで実行されるすべてのマウス作業は、動物のプロジェクトライセンス6965分の70の下で動物科学的手続法、英国に従って実施しました。

1.レトロウイルスの生産

進む前に遺伝的に改変された生物および哺乳動物細胞におけるレトロウイルスの使用を製造するために必要なすべての承認を取得。

  1. HEK 293T細胞の増殖
    1. HEK 293Tの（10％ウシ胎児血清（FBS）を有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、100単位/ mlのペニシリン0.1mg / mlのストレプトマイシン、および2mM L-グルタミン）培地中で10cmの組織培養皿上でHEK 293T細胞を成長させます。彼らは培地を除去し、新鮮なHEK 293T培地でプレートから細胞をピペットでコンフルエンスに達したときに、一般的な細胞継代、分割セル1時10分のため。
      注：細胞は2-3日でコンフルエンスに到達する必要があります。 293T HEK細胞は、そのようにトリプシン処理が必要とされていないプレートに緩く取り付けます。
    2. トランスフェクションの前に24時間は、conflueを分割しました翌日、細胞が約50％コンフルエントになるように、10cmプレート（トランスフェクションあたり1プレート）への細胞1:10 ntのプレート。
  2. リン酸カルシウム沈殿によるトランスフェクション
    1. トランスフェクションの前に約1時間、細胞から培地を除去し、慎重にプレートから取り外した細胞を防止するために、新鮮なHEK 293T培地の9ミリリットルを追加します。
    2. 表1に記載されているように2倍のHepes緩衝生理食塩水（2×HBS）と新鮮2.5 MのCaCl 2溶液を調製します。解凍するDNA取り揃えております。最も効率的なトランスフェクションのためのプラスミドプレップ品質のDNAを使用しています。
    3. 6ミリリットルの丸底または15ミリリットルの円錐管では、レトロウイルスDNA（PMIG）4、ヘルパーウイルスDNA（PCL-エコ）7、およびH 2 O 420μlで5μgの5μgのを追加します。 500μlのへの最終的なボリュームをもたらす2.5 MのCaCl 2の80μLを加えます。
      注：このを次のステップ（2×HBSの付加）と一緒に、一般的なアイドルマスターする限り、通常のベンチで行うことができますIleの技術が使用されています。
    4. 解決策は、継続的に混合されるとカーポ4は偶数サイズの結晶中に析出するように穏やかにボルテックスしながら、ゆっくりと上記のDNA混合物にドロップすることにより2倍HBS降下の500μlを添加します。
    5. 組織培養フードに移し、ゆっくりたCaPO 4 DNA混合物（1ミリリットル）を追加し、常に、静かにプレートを旋回しながら細胞をカバーする培地の9ミリリットルに滴下。再びプレートから細胞を剥離しないように注意してください。バックインキュベーターにセルを配置します。
      注：この時点でたCaPO 4沈殿物が細菌のサイズに関する小さな結晶として顕微鏡下で容易に見えるようになります。これらは容易に結晶がプレートの底に沈殿する機会があったときに30〜60分後に見られています。
  3. 培養上清におけるウイルスのコレクション。
    1. （どこでもトランスフェクション後12-24時間から）次の日、培地を除去し、10mlの細胞を養います新鮮なHEK 293T媒体の再びプレートから細胞を除去しないように注意してください。
      注：これは、HEK 293T細胞は、トランスフェクション時に培地中に分泌するリンパ球の阻害物質を希釈します。
    2. 二日目の夜に（〜24時間後、トランスフェクション）新鮮なHEK 293T培地の3.5ミリリットルで細胞を養います。一方の側をドライ残さないようにプレートをインキュベーター内で正確にレベルを置かれていることに注意してください。
    3. 培地を収集〜12時間後（4℃で保存）、新鮮なHEK 293T培地の3.5ミリリットルで食べます。およそ12時間間隔で繰り返しコレクション2回以上、約10 mlの培地のが収集されるようになっています。これは、ウイルスストックです。
    4. 5分間、600×gで遠心分離することにより、任意の残留HEK 293T細胞と細胞破片をスピンアウト。あるいは、結合0.45μmの低タンパク質、シリンジフィルターを用いてフィルター。 4℃で、そして最高の力価のStoreウイルス、力価はゆっくりと4℃で減少するように、一日か二日以内に使用します。 frとしないでくださいeezeは、このように大幅に力価が低下します。

プライマリナイーブCD4 + T細胞の2の単離

  1. 白血球細胞の単離
    1. 頸椎脱臼、CO 2窒息、または機関の動物取扱規則に適切な他の人道的なプロトコルでマウスを安楽死させます。
    2. たて安楽死させたマウスを解剖し、脾臓および希望リンパ節15を除去します。 R10培地（10％FBS熱不活性化、100単位/ mlペニシリン、0.1mg / mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、および0.1％βメルカプトエタノールを含むRPMI培地）を含む6ウェル組織培養プレートのウェル中に臓器を置きます。培養物中の汚染の機会を最小限にするために、マウスおよびそれ以降のすべての操作の解剖のための細胞培養フードを使用してください。
      注：冷たいR10媒体を保持し、4℃で、すべての下流の精製の手順を実行します。
    3. 5に70μmの細胞培養ストレーナーを配置R10媒体の約5ミリリットルを含む0ミリリットルコニカルチューブ。最大3匹のマウスの脾臓およびリンパ節のための1つのストレーナを使用します。
    4. セルストレーナーに脾臓およびリンパ節を追加し、5ミリリットルのシリンジプランジャの先端を使って柔らかく。 R10培地1〜2mlので洗い流してください。
    5. 15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移し、R10と14ミリリットルまでのボリュームをもたらします。 4℃で5分間、600×gで遠心分離します。細胞ペレットを乱さないようにする1清潔な動きでそれをオフに注ぐことによって、上清を捨てます。
    6. 各チューブに冷（4℃）赤血球溶解緩衝液（ 表1）を2mlを加えます。静かにチューブを氷上に維持し、3.5分間混合します。
      注：赤血球溶解のタイミングは、リンパ球の死を防ぐことが重要です。したがって、赤血球溶解緩衝液の各バッチの正確なタイミングが最適化される必要があります。
    7. R10培地の≈12-13ミリリットルを追加します。直ちに遠心分離し、ステップ2.1.5のように上清を捨てます。もっとウィット約2倍の洗浄工程を行いますH R10培地を細胞から残留赤血球溶解緩衝液を除去し、リンパ球の死を回避します。
    8. 生細胞の収率を決定するために、トリパンブルーで1:20に希釈し、血球計数器で細胞をカウントします。マウス当たり約8-10×10 7細胞を期待しています。
  2. CD4 + T細胞、CD8 +を削除するために磁気ビーズにキットを使用して、のCD11b +、CD16 / 32 +、CD45R +、MHCクラスII +とのTer-119 +細胞の単離。
    1. アリコートステップ8から10×10 7細胞2.1.8 15あたりミリリットルコニカルチューブおよび4℃で5分間、600×gで遠心。細胞ペレットを乱さないようにする1清潔な動きに上清を捨て。 FBSは、その後キットから抗体混合物の100μlを添加する熱不活性化の100μlの各チューブで細胞を再懸濁します。ローラ上穏やかに混合しながら4℃で30分間インキュベートします。
    2. 上記細胞がインキュベートされている一方で、ビーズを準備。
      1. > 30秒間ボルテックスすることによりバイアル中で再懸濁ビーズは、その後、15ミリリットルコニカルチューブに8-10×10 7に調製した細胞あたりのビーズの1ミリリットルを転送します。ビーズ1ml当たりR10培地2mlを加え、穏やかに混合。
      2. 上清を捨てた後、1分間磁石にチューブを置きます。磁石からチューブを外し、R10培地4mlにビーズを再懸濁します。ビーズのこの量は、インキュベーションの2ラウンドのために十分です。
    3. チューブ当たりR10培地10mlを添加することにより、抗体インキュベーション（ステップ2.2.1）の終了時に細胞を洗浄します。静かに4℃で5分間、600×gでチューブと遠心分離機細胞の旋回とよく混ぜます。細胞ペレットを乱さないようにする1清潔な動きに上清を捨て。 R10培地1mlで細胞を再懸濁し。
    4. 抗体処理した細胞の各管に（各チューブのために用意量1/2）ステップ2.2.2.2からの洗浄したビーズの2ミリリットルを追加し、ROに穏やかに混合しながら4℃で30分間インキュベート充填剤。
    5. 静かに狭い先端開口を含むピペットで5回ピペッティングすることにより細胞 - ビーズ混合物を再懸濁します。発泡は避けてください。新しいチューブにマイナスに、選択された細胞を含む上清を転送後、2分間ビーズ磁石にチューブを置きます。彼らはCD4 +集団であるとして、これらの細胞を保管してください。
    6. 負の選択をもう一度繰り返します。 4℃で5分間、600×gでステップ2.2.5から細胞をスピン。 R10培地1ml中のステップ2.2.3および再懸濁のように上清を捨てます。フォローは再び2.2.4と2.2.5を繰り返します。最終的な磁気ビーズ選択後、（典型的な収率は10 8の白血球当たり15-20×10 6細胞である）回収率を決定するために、細胞をカウントします。
  3. 細胞分離カラムを使用して-ナイーブCD4 + T細胞（およびCD62L 高 CD25）の単離
    1. の150〜200μlの中で遠心分離したCD4 + Tは、4℃で5分間、600×gで細胞を再懸濁10 8個の細胞当たりR10培地。株式ビオチン化CD25モノクローナル抗体（クローン7D4）の2μlを添加します。ローラ上穏やかに混合しながら4℃で30分間インキュベートします。
    2. 細胞分離カラム緩衝液（ 表1）を10mlを添加することによって細胞を洗浄します。 4℃で5分間、600×gで遠心分離します。できるだけ多くの上清を除去し、残りのバッファ/細胞の量を推定します。 10 7個の細胞あたり約90μlの最終体積に再懸濁します。
    3. 10 7個の細胞あたりストレプトアビジンビーズの20μl加え、穏やかにフリックして混ぜます。 4℃で15分間インキュベートします。
    4. 細胞がインキュベートされていますが、手動のアプローチのための媒体細胞分離（MS）のカラムを準備します。各MSカラムは、10 7個の細胞を保持し、以降CD25 +細胞は、典型的には10 8のCD4 + T細胞あたり1列を使用し、総CD4 +細胞の約10％を占めます。列に細胞分離カラム緩衝液500μlを追加そして、を通して流します。さらに2回繰り返します。
    5. 細胞/ビーズインキュベーションの終わりに、細胞分離カラムを緩衝液10mlを添加し、4℃で5分間、600×gで遠心分離して細胞を洗浄します。 10 8個の細胞あたりの細胞分離カラムを緩衝液500μl中で細胞を再懸濁したが、少数の細胞が存在する場合、まだ500μLを使用します。
    6. 列にセル/ビーズ懸濁液の500μlのを適用し、フロースルーを収集します。 1列目より時間をかけてこれを通過し、再び通る流れを集めます。回収した細胞に、これらのリンスからを通じて各フローを追加し、細胞分離カラム緩衝液500μlでカラムを3回洗浄します。これらは、CD25である-細胞。収量を決定するために、細胞をカウントします。
    7. Tregsの（CD25 +細胞）を希望する場合は、次のように分離します。
      1. セパレーターから列を削除し、無菌性を維持するために注意しながら、オープンユニバーサルチューブの上にそれを保持します。迅速COL上に細胞分離緩衝液500μlをピペットUMNしっかりと列に付属のプランジャーを使用して、陽性画分を洗い流します。
      2. フラッシング手順をさらに2回繰り返します。新鮮なMS細胞分離カラムに陽性画分を渡し、このフロースルーを捨てます。しっかりとR10培地1ml中に4℃で再懸濁細胞で5分間、600×gで前と遠心細胞として陽性細胞を3回、洗い流すと収量を決定するためにカウントされます。
    8. CD62L high T細胞、遠心分離機CD25 - - 10 7個の細胞当たりR10培地の150〜200μlの4度再懸濁で5分間600×gでステップ2.3.6で上記の単離されたT細胞CD25を入手します。 CD62Lモノクローナル抗体（クローンMEL-14）をビオチン化株式の5μlを添加して、以前のようにローラー上に穏やかに混合しながら4℃で30分間インキュベートします。
    9. Treg細胞単離プロトコール（2.3.7）に記載のように洗浄を行い、ストレプトアビジン結合ビーズ、および細胞分離カラムの準備。この時間の使用10 8個の細胞の容量を有する大きな細胞分離（LS）カラム。
      1. 10 8個の細胞あたり1 LS細胞分離カラムを使用して、細胞- CD62L high T細胞は、典型的には、CD25の約60〜70％を表しているからです。ステップ2.3.6で説明したように、LSの細胞分離カラムへの細胞/ビーズ混合物を追加 - カラムはリンスを通って、この時間は、最終的な流れを廃棄します。 CD25 +細胞の収集のためのステップ2.3.7で説明したようにCD62L high T細胞を収集します。
      2. R10の1ミリリットル中に4℃で再懸濁細胞で5分間600×gで遠心分離細胞と収量を決定するためにカウントされます。 R10培地1ml当たり0.75から1 X10 6個の細胞に希釈します。
  4. 蛍光活性化細胞選別（FACS）によって細胞の純度を分析します。
    1. FACS染色戦略
      1. CD4-FITC、CD8a-PerCPを-のCy5.5（ヘルパーおよび細胞傷害性T細胞）、およびMHCIを有する細胞の分離のすべての段階を前後、染色I-PE（MHCクラスII発現細胞）。
      2. 細胞についてはCD25アイソレーション、CD4-FITCおよびCD25-PE（他のヘルパーT細胞に対するTregの）で汚れを前後。
      3. CD4-FITC、CD62L-PEと（メモリやエフェクターヘルパーT細胞対ナイーブ）CD44-APCによる前細胞と後のCD62L分離染色のため。
    2. 各分析の場所のための96ウェルU底プレートのウェル中の10 5個の細胞。 4℃で5分間、600×gで遠心分離します。メディアをオフに注ぎ、200μlのDPBSで細胞を1回洗浄します。遠心分離は、上記のようにし、DPBSをオフに注ぎます。
    3. ウェルあたりDPBS50μlの各抗体の0.5μlを添加し（2.4.1に示されるように）と蛍光標識の退色を避けるために、暗所で室温で30分間インキュベートします。
    4. 洗浄細胞は、2.4.2のようにDPBSで2倍、すぐに手元の楽器に特有のプロトコルおよびガイドラインを使用して、フローサイトメーターで分析します。
      注記：良好な製剤の最終的な単離工程の後に、細胞の90％〜95％であろうCD62L high T細胞- CD4 + CD25です。

3.レトロウイルス活性化CD4 + T細胞の形質導入および特異的Tヘルパーサブセットへの分化

  1. レトロウイルス導入
    注：レトロウイルスの統合と遺伝子の発現は、細胞分裂を必要とします。したがって、T細胞は、O / Nを有効にする必要があります。
    1. ナイーブT細胞を、DPBS中で希釈した抗CD3および抗CD28抗体でコート24ウェル組織培養プレートを単離します。ウェルあたり250μlのを追加します。 1μgの/ mlの抗抗CD3を使用してください。細胞は最終的にTh0の、のTh1、Th2およびiTregs条件で区別される場合を2μg/ mlで抗CD28を使用します。 TH9とTh17の条件については10μg/ mlで抗CD28を使用してください。組織培養インキュベーター中、37℃で約2時間インキュベートします。
    2. 直前に細胞を培養し、unbouを除去するために、抗体溶液を除去し、ウェルのDPBS〜250μlのプレートを洗浄ND抗体。プレートはそのように一度に6ウェルの最大を処理乾かす入らないように注意してください。 DPBSで洗浄し、1mlあたり0.75から1×10 6個の細胞でR10培地中のナイーブCD4 + T細胞の1ミリリットルを追加、削除。細胞O / N（14-16時間）をアクティブにします。
    3. 30℃で5分間、900×gでプレートで翌日、遠心細胞がウェルの底に細胞を付着させます。
    4. 収集した細胞を置換しないように注意してメディアを保存し、ウイルス産生プロトコルから調製された1ミリリットルのウイルス培養上清と交換してください。細胞がそのように一度に4つのウェルの最大を処理乾かすせてはいけません。
      1. それぞれによくウイルスの取り込みを助け、次の遠心分離中に周囲のCO 2の大幅なアルカリ化を防ぐために、8 mg / mlでポリブレンの1μlを、そして1M HEPES pH7.5の10μlのを追加します。 30℃で90分間、900×gでプレート内の細胞を遠心
  2. 具体への細胞の分化FICサブセット
    1. 慎重に、ウイルス培養上清を除去し、それはIL-2および他のT細胞増殖因子が含まれているとして、ステップ3.1.4で上記集め培地1mlと交換してください。特定のサブセットに細胞を区別するために3-4日間表2および培養細胞で示された試薬を追加します。
  3. 細胞の分析
    1. サイトカインの細胞内染色のために、1 / mlのホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）およびイオノマイシンの各4時間で細胞を扱います。刺激の最後の2時間の間に、ブレフェルジンAの1 / mlのを追加します。
    2. ピペッティングにより数回ダウンし、各ウェルの底から細胞を再懸濁し。固定および染色のために（Th細胞の培養物1mlから通常100μl）を96ウェルU底プレートに約10 5個の細胞を転送します。
    3. より長いインキュベーション時間がGFP Aを漂白れるようにGFP染色のために、正確に5分間RTで2％パラホルムアルデヒド100μlで細胞を固定NDのFoxp3染色を妨害します。 5分間22℃で600×gで各ウェル遠心分離機にDPBS100μlを加えることによって、細胞を洗浄。上清を捨て。
      注意：パラホルムアルデヒドは有毒です。皮膚や眼の保護とヒュームフードでそれを扱います。
    4. 再びのFoxp3染色キット（希釈剤の3ボリュームへの固定バッファの1の体積）から作られた100μlの1×固定バッファーを用いて細胞を固定します。 RTで45分間、細胞をインキュベートするか、あるいは16時間4℃でインキュベートします。
    5. 固定後、同キットの透過化緩衝液100μlを添加することにより細胞を透過性。その後、5分間22℃で600×gで遠心分離し、30〜45分間室温でインキュベート。
    6. 抗体染色のために、固定/透過化緩衝液を除去し、新鮮な透過化緩衝液50μlを追加します。サンプルあたり50μlのバッファーあたり0.5μlので透過化緩衝液で希釈し、必要な抗体を追加します。インフルエンザの漂白を避けるために、暗所で室温で30-45分間インキュベートorescentラベル。
    7. 5分間22℃で600×gで150μlの透過化バッファと遠心を追加します。透過化バッファーを捨て、200μlのDPBSを追加します。手元の楽器に特有のプロトコルおよびガイドラインを使用して、フローサイトメーターで分析します。
      注： など 、非アクティブ化またはTh0を活性化した細胞を分析し、アイソタイプコントロール抗体での染色としてサイトカイン染色のための適切なコントロールを含めるようにしてください

結果

この実験系の成功は、T細胞および高力価のレトロウイルス調製物の純度の高い集団を必要とします。代表的な結果は、成功した実験の例として示されている。 図1ナイーブヘルパーT細胞単離プロトコールの各段階で前後選択集団の典型的な純度を示す。 図2及び図3は、GFPの発現を介して、レトロウイルス産生の分析を示しますトランスフェクトされたHEK 293T細胞において（ 図2）および形質導入T細胞（ 図3）。 HEK 293T細胞のトランスフェクション効率は、異なるレトロウイルス構築物で有意に変化し得るが、これは多くの場合、GFP + T細胞の数で観察レトロウイルス産生のレベルと相関しません。また、GFP + T細胞の数は、偏光状態に依存して変化し得ます。また、メートルGFPのEAN発現レベルと集積ウイルスコピーの数に応じて変化することができ、挿入された遺伝子、転写の組込み部位の効果、およびウイルスの転写に影響する転写後調節機構。

最後に、 図4は、miRNAののmiR-15bは/ 16が過剰発現されたときに我々は、ヘルパーT細胞の分化と観察しているいくつかの典型的な結果を示しています。これらの結果は、そのように真の効果は、ヘルパーT細胞の異なる調製物を使用して複数回の反復実験の統計分析によって実証されている必要があり、個々の実験内で発生することができ変動のいくつかを示しています。これらの実験において、Th2応答は、それらがTh1応答の傾向があるので、ここで使用されるC57BL / 6行目に観察することは困難です。同様に、IL-9染色は、バックグラウンドを上回る検出するのが困難であることができます。したがって、アイソタイプコントロールを行い、正しいGAを確保するために適切な補償を設定することが不可欠ですサイトカイン発現のティン。我々の結果では、我々は、miR-15bは/ 16が部品のRictorおよびmTOR 15の発現を抑制することを通じてシグナル伝達経路のmTORを阻害することにより、iTregの誘導を増強することを発見しました。 miR-15bは/ 16は時々、個々の実験でTh0の、のTh1およびTh17細胞の分化に影響を与えることができるが、複数回の反復実験で調べ有意な影響はありません。対照的に、のmiR-15bは/ 16過剰発現は有意に（18を参照する参照）TH9の分化を抑制しません。

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分離の各段階でのヘルパーT細胞の図1.標準的な純度。示された抗原の結果代表的なフローサイトメトリーは、前方散乱（FSC）および側方散乱光（SSC）プロットに指定された生細胞のゲートから示されています。 （A）前後のCD4陰性選択。 CD4の発現プロファイル、CD8a、およびMHCIIが示されています。これらは、ヘルパーT細胞の濃縮および細胞傷害性T細胞およびMHCクラスIIを発現する細胞の損失を示します。良好な精製は、この段階で〜90％のCD4 + T細胞をもたらすはずです。 （B）CD25選択。左側にはCD4、CD8a、およびMHCIIの発現プロファイルであり、右側にCD4とCD25の発現は、事前と事後選択をプロファイルしています。この時点で> CD25陰性に選択された細胞の95％がCD4 + CD25であるべきです- 。 （C）CD62L選択。 CD4、CD8a、およびMHCII発現プロファイルは、左側に示されています。右側にはCD62LおよびCD44のための発現プロファイルは、ポスト、選択された細胞のCD4とCD62L発現プロファイルと一緒に前後のCD62L選択したセルについて示されています。 CD62L選択した後、実質的に全てのメモリセル（CD44 +）は、10〜15％のエフェクター細胞（CD62L 低）が含まナイーブヘルパーT細胞の高度に濃縮された集団を残して除去されます。すべてのためにFACSプロファイルは、特定のパラメータのための同等の設定とスケールが全体で維持しました。数字は、ゲート集団内の細胞の割合を表します。最初の選択後の細胞の大きさのわずかな減少は、プロトコル中の機械的ストレスにおそらくある。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-2
レトロウイルストランスフェクションHEK 293T細胞の図2分析。GFPの発現は、ウイルス培養上清を回収した後、非トランスフェクトまたはトランスフェクトし、分析のいずれかであったHEK 293T細胞において示されています。 GFP分析はFSCと最初のパネルでSSCプロット上のゲートからの生細胞で行いました。数値は、ゲート領域内のGFP +細胞の割合を表します。典型的なトンransfection効率は30から90までパーセントの範囲である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-3
レトロウイルス形質導入されたヘルパーT細胞の図3.分析。GFPの発現は3日間Th0を、のTh1、Th2を、TH9、Th17細胞およびTregの偏光状態の分化した後、レトロウイルス形質導入ヘルパーT細胞において示されています。分析は、FSC / SSCパネルに示されているライブや活性化細胞にゲートされました。形質導入効率は、構造と偏光状態に応じて10-75％の間で変化することができます。同様に、GFP発現の平均蛍光強度が変化することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

：FO小娘= "jove_content" figure-results-4
異なる偏光条件でのヘルパーT細胞の分化に対するのmiR-15bは/ 16過剰発現の図4.影響。代表的サイトカインプロファイルは、 図3からの細胞のGFP +集団に示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-5
表1： これらのプロトコルで使用されるバッファの Excelスプレッドシートとしてこの表をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

ヘルパーT細胞の分極条件
Th0を抗IL-4 5μg/ mlの
抗IFN-γ 5μg/ mlの
Th1 組換えIL-12 20 ng / mlで
抗IL-4 5μg/ mlの
Th2の組換えIL-4 40 ng / mlで
抗IFN-γ 5μg/ mlの
TH9 組換えTGF-β 2.5 ng / mlで
組換えIL-4 40 ng / mlで
抗IFN-γ 10μg/ mlの
Th17細胞組換えTGF-β 2.5 ng / mlで
組換えIL-6 50 ng / mlで
抗IFN-γ 5μg/ mlの
抗IL-4 5μg/ mlの
抗IL-2 5μg/ mlの
Tregは組換えTGF-β 2.5 ng / mlで
組換えIL-2 5 ngの/ mlの

表2： ヘルパーT細胞サブセットの偏光状態。

ディスカッション

その開発と機能は、多くの場合、重要な調節因子の発現レベルによって決定される遺伝子のレトロウイルス媒介過剰発現は、ヘルパーT細胞における機能を解析するための強力な方法です。大幅に内因性遺伝子のもの上記の発現レベルは、多くのアーチファクトを生じることがあるので、しかし、結果の慎重な解釈が必要です。従って、この技術は、機能の妥当性を確認するために他のものと組み合わされるべきです。例えば、過剰発現が可能な場合のsiRNAまたは遺伝子ノックアウトを使用して発現低下によって補完されるべきです。 miRNAにより、我々は、miRNA 15のための競合的阻害剤として作用した部位を標的人工のmiRNAを過剰発現したウイルスを使用することにより、ブロッキングのものと過剰発現実験を補完します。レトロウイルス形質導入された細胞はまた、RNAおよびタンパク質の分析を伴う生化学アッセイにおいて利用することができます。しかし、これらの実験の主な制限は、形質導入解像度の効率であります形質導入および非形質導入細胞の混合集団でulting。したがって、これらのアッセイは、最も可能性の高いGFP +集団のソートが必要になります。最後に、 インビトロ分化アッセイは、 インビボ実験と結合されるべきであり、これを達成することができる一つの方法は、養子マウスに形質導入したT細胞を転送し、それらの分化し、免疫応答に対する効果以下のことです。

このシステムの主要な制限の一つは、レトロウイルスキャプシドにパッケージングすることができるRNAゲノムの大きさです。我々の経験では、良好なウイルス産生を与えるMIGレトロウイルスシステムの最大挿入サイズは3〜3.5キロバイトです。それらが悪いウイルス力価を与えるしたがって、より大きな遺伝子は、このシステムを用いて分析することができません。このシステムは、遺伝子研究の広範囲に有用であるのでしかし、ほとんどの遺伝子は、このサイズよりも小さいです。

これらprotoco内のレトロウイルス形質導入すると、いくつかの選択肢LSが使用されています。多くの研究者は、安定したレトロウイルス遺伝子（例16を参照）を発現するパッケージング細胞株を利用しています。しかし、我々は、PCL-エコヘルパーウイルスベクターの同時トランスフェクションを用いて標準HEK 293T細胞を使用して最高の力価を得ました。ナイーブヘルパーT細胞の単離は、磁気ビーズと細胞分離カラムのプロトコルではなく、細胞選別によって達成することができ、これは、細胞ソーターへのアクセスを必要とし、ソート時間のコストは、典型的には、ビーズ試薬よりも高いです。最後に、異なるサブセットにヘルパーT細胞を区別するために使用される活性化条件のバリエーションが存在します。例えば、長すぎるために細胞のTCR刺激は、Tregの誘導条件への曝露の前に誘導16を阻害することができます。レトロウイルス発現細胞の刺激により誘導される細胞分裂を必要とするので、これは問題となり得ます。それにもかかわらず、我々はO / N ACTIVで、このプロトコルを使用して効率的なTregの誘導を発見しましたレトロウイルス形質導入に先立ってエーション。

これらのプロトコルの中で、成功したアプリケーションは、いくつかの要因が必要です。高力価のレトロウイルス調製物は、非常に高い品質のDNAと正確に準備された2×HBS HEK 293T細胞の効率的なトランスフェクションを必要とする重要です。トランスフェクトされたDNAの良好な発現は、細胞があまりに疎または密である場合、細胞が活発に増殖している、これが阻害されることを必要とするので、また、HEK 293T細胞の細胞密度はトランスフェクションの時点で約50％であることが必要です。トランスフェクション時の最適な密度の細胞を、ウイルス回収ステップの間にいくつかの点で合流に達する必要がありますが、彼らはすべての方法最後の収集まで、高力価のウイルスストックを生産継続します。ヘルパーT細胞の効率的な分化は、良好なセルの品質がので、単離された細胞は、 図1に示した純度であることを確認が必要である。同様に、細胞の品質は、マウスFRに依存しますそれらは単離されたOM。これらの研究のために、我々は6〜8週齢のC57BL / 6マウスを使用しています。古いマウスは少ないナイーブ細胞を持つことができ、他の株は、それらの分化に異なる場合があります。上述したように、例えば、BALB / cマウスは、C57BL / 6マウス17よりTh2応答をより受けやすいように、C57BL / 6 T細胞はTh2応答を誘導することは困難です。また、分化条件のいずれかが研究室に研究室から若干異なる場合があり、そして様々な偏光条件でのサイトカイン濃度を滴定する必要があるかもしれないので、遺伝子の過剰発現の効果は、サブ最適な条件で明らかになるであろう。最終的に、細胞増殖の過剰発現遺伝子の作用や偏光状態は、目的の遺伝子のように測定することの効果は、偏光試薬のタイミングおよび濃度を最適化する必要ができる形質導入効率に影響を与えることができます。すべてのこれらの要因を最適化すると、このシステムでの有益な結果をもたらすはずです。

開示事項

著者らは、この作品の出版に相反する利害関係はありません。

謝辞

この作業は、バイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会（BBSRC）の助成金（BB/H018573/1）およびBDバイオサイエンスの助成金によって支援されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RPMISigmaR8758
DMEMSigmaD5671
ペニシリン ストレプトマイシン溶液ΣP4333
L-グルタミンΣG7513
&β;-メルカプトエタノールΣ M3148
DPBSΣD8537
MIG ベクトルAddgenePlasmid 9094
pCL-EcoベクターAddgenePlasmid 12371
Cell strainerBD Falcon352350
Magnetic beads mouse CD4 cell kit Invitrogen (Dynabeads)11415D
ストレプトアビジンビーズ Miltenyi Biotech130-048-102
MS細胞分離カラムMiltenyi Biotech130-042-201
LS細胞分離カラムMiltenyi Biotech130-042-401
CD25 Biotenylated MAb BD Biosciences85059クローン7D4
CD62Lバイオテニル化MAb BD Biosciences553149クローン MEL-14
ポリブレン (臭化ヘキサジメトリン)Sigma107689
Anti-CD3eBiosciences16-0031-85clone 145-2C11 
抗CD28eBiosciences16-0281-85クローン37.51 
抗IL-4BD Biosciences559062クローン 11B11
抗IFN-γBD Biosciences559065クローン XMG1.2
抗IL-2BD Biosciences554425cloneJES6-5H4
組換えIL-12 p70eBiosciences14-8121
組換えIL-4BD Biosciences550067
組換えTGF-βeBiosciences14-8342-62
組換えIL-6eBiosciences14-8061
組換えIL-2eBiosciences14-8021
PMA シグマP8139
イオノマイシンシグマI0634
ブレフェルジン AeBiosciences00-4506
パラホルムアルデヒドシグマ16005パラホルムアルデヒドは有毒ですので、取り扱いには十分な注意を払ってください 
Foxp3染色バッファーセットeBiosciences00-5523
抗CD4 FITCeBiosciences11-0041クローンGK1.5 
抗CD8a perCP-cy5.5eBiosciences45-0081-8053-6.7 
抗MHCII PEeBiosciences12-0920 クローンHIS19
抗CD25 PEeBiosciences12-0251-82 クローンPC61.5 
抗CD62L PEeBiosciences12-0621-82クローンMEL-14 
抗CD44 APCeBiosciences17-0441クローンIM7 
反IFN-γ FITC eBiosciences11-7311-81XMG1.2
Anti-IL-4 PEBD Biosciences 554435クローン11B11
Anti-IL-9 PEまたはAPCeBiosciences/Biolegend50-8091-82/514104クローンRM9A4
Anti-IL-17a PEBD Biosciences 559502クローンTC11-18H10
Anti-Foxp3 APCまたはPEeBiosciences17-5773-82/12-5773-80 クローンFJK-16s
NaClΣS7653
KClΣP9333
Na2HPO4-2H2OΣ71643
デキストロース/グルコースΣG7021
HEPES、遊離酸ΣH3375
NH4ClΣA9434
EDTAシグマD2900000
KHCO3Sigma237205
 CaCl<サブ >2 シグマC5670
クローンクローン二ナトリウム

参考文献

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