の検出トリパノソーマバリアント表面糖タンパク質の切り替え

サマリー

アフリカのトリパノソーマは、抗原の変動が低率で発生し、その結果、集団は優勢な変異体である表面糖タンパク質(VSG)タイプを発現する寄生虫と「切り替えられた」変異体の小さな集団で構成されています。 このプロトコルでは、これらの集団を迅速に検出および定量化する方法について説明します。

要約

Trypanosoma bruceiは、人間と動物のアフリカのトリパノソーマ症(それぞれ睡眠病とナガナとして知られています)を引き起こす原虫で、ツェツェ媒介生物と哺乳類の宿主の間を循環します。それは、その表面を覆う高密度の変異体表面糖タンパク質(VSG)を定期的に切り替えることにより、哺乳類の宿主免疫系を回避します。Trypanosoma bruceiの抗原変異の検出は、面倒で労働集約的な場合があります。ここでは、特定の集団で新しいVSGを発現するために「切り替えた」寄生虫の数を定量化する方法を紹介します。寄生虫は、最初に開始VSGに対する抗体で染色され、次に磁気ビーズに付着した二次抗体で染色されます。次に、開始VSGを発現する寄生虫は、磁石に取り付けられたカラム上に寄生虫を走らせることにより、他の集団から分離されます。優性である開始VSGを発現する寄生虫はカラム上に保持されますが、フロースルーには新しいVSGを発現する寄生虫と、開始VSGを発現する汚染物質が含まれています。このフロースルー集団を、汚染物質を標識するための開始VSGに対する蛍光標識抗体と、死んだ細胞を標識するヨウ化プロピジウム(PI)で再度染色します。フローサイトメトリーで見える既知の数の絶対計数ビーズがフロースルー集団に追加されます。次に、収集された細胞数に対するビーズの比率を使用して、サンプル全体の細胞数を推定できます。フローサイトメトリーは、開始する優性VSGに対して陽性に染色されないPI陰性細胞の数をカウントすることにより、スイッチャーの集団を定量化するために使用されます。その後、母集団におけるスイッチャーの割合は、フローサイトメトリーデータを使用して計算できます。

概要

寄生原虫、 トリパノソーマは 、サハラ以南のアフリカ全域（ トリパノソーマブルセイを介して）や動物（ トリパノソーマガンビアとトリパノソーマローデシア経由）人間に影響を与える疾患の原因物質です。なお、ツェツェバエベクターの唾液を介して哺乳動物宿主に伝達されます。人間と動物、アフリカトリパノソーマ症の両方が流行地域に深刻な経済的負担を引き起こす、といくつかの薬が利用可能であるか、またはいずれかの疾患を治療するために開発中です。免疫回避のメカニズムを理解することは、トリパノソーマ症用薬の開発のために重要です。寄生虫をカバーして密な、バリアント表面糖タンパク質（VSG）コートの抗原性の変化は、主要な手段の一つであることでT.トリパノソーマは、哺乳類の抗体応答を逃れます。 VSG遺伝子の約2,000の変異体は、トリパノソーマのゲノムに存在するが、一つだけは〜15 EXPRESの1から任意の時点で転写されますシオンサイト。表現VSGの「切り替えは、「アクティブ発現部位にVSG遺伝子をコピーすることによって、または^（1件）以前にサイレント発現部位の転写活性化のいずれかによって発生する可能性があります。

多くの仕事は、Tにおける抗原変異を理解することに専念してきたがトリパノソーマは 、スイッチング周波数の影響を与える要因は、まだよく理解されていません。これまでの研究では、約10 ⁶セル² 1の順に、スイッチングがインビトロで確率的に発生している間、スイッチング周波数が非常に低いという事実によって妨げられてきました。これは、それが困難なスイッチングが最初の場所で検出が困難であるため、スイッチング周波数を減少させ、所定の係数が大きくなるかどうかを測定することができます。 2009年以前には、所定の集団でスイッチャーを単離するための方法は、長く、労働集約的でした。これらには、が支配的VSGに対して免疫化したマウスを通じてトリパノソーマを継代した後、細胞を回収日後^3、または免疫蛍光^4,5によって細胞の数百を数えます。別の戦略は、スイッチャー^6を単離するために^、薬剤耐性の選択に依存しています。 インビトロで増殖アフリカトリパノソーマは、典型的には、1つの主要な変異体、および代替変異体を発現スイッチャのはるかに小さい人口を表現する大集団で構成されているので、我々は支配的な、出発VSGとしてこの論文を通じて、主要なバリアントを参照してください。そうすることで、私たちは決してこの主要な変異体は、集団内の他の変異体よりも大きな適応度を持っていることを暗示したいです。

4時間 - ここでは、確実に3に与えられた集団における非支配的なVSGを発現しているトリパノソーマの数を測定することができる方法について説明します。この方法は、1つの与えられた遺伝子操作または薬物治療が集団に切り替え細胞の数を増加させるかどうかを確認したい場合に特に有用です。代わりにDOを発現する細胞の集団をなくししますminantは、薬を介して、または免疫学的手段によってVSGを開始し、これらの細胞を最初に支配VSGに対する抗体に結合された磁気ビーズでそれらをコーティングした後、磁気カラム上でそれらを分離することによって除去されます。切り替え集団は、フロースルーに回収し、汚染物質を識別するためのフルオロフォア標識した抗VSG抗体で再度染色します。定量化は、細胞に対するビーズの比を決定し、集団⁷にスイッチャの数を定量するために使用することができるように、各サンプルの絶対計数ビーズの定義された数を加算することによって達成されます。

プロトコル

注：手順を通して、それを氷上で細胞を維持することが必要です。コールドメディアも全体で使用されるべきです。

1.サンプル収穫

1. 100万/ mlの - 0.5の密度にリスター427株血流のトリパノソーマを成長させます。これは、寄生虫数の少ない培養を開始するのが最善の方法です。 1500×gで10分間、50×10 ⁶細胞/サンプルをスピンダウン。正と負の抗体コントロールとして後で使用するために文化の中で1×10 ⁶個^の細胞を残すようにしてください。
   注：このプロトコルは、（詳細説明を参照）、動物の血液から単離されたトリパノソーマに使用することができます。
2. ピペットまたは上清の大部分を捨てる（約750μLを残します）。 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに細胞を移します。
3. 微量で5200×gで4分間、4℃で細胞をスピンし、上清を除去します。

2.磁気標識

1. 150μlの培養培地中で再懸濁細胞（HMI-9のwi適切な希釈で例えば番目血清）+一次抗VSG抗体。
   注：抗VSG抗体は、家の中で作られ、1時50分の希釈で使用されています。フルオロフォアで標識されていない一次抗VSGの抗体を使用することが重要です。
2. 10分間、4℃の低温室に8 - スピード6で渦アダプタ-60を使用して、渦細胞。血清で千μlの冷間HMI-9から800で洗います。
3. 5200×gで4分間、4℃でスピンし、上清を吸引除去します。血清を1ミリリットルHMI-9で洗浄し、上記のようにスピン。上清を吸引除去します。血清とHMI-9の100μlの再懸濁ペレット。
4. （MSC）マイクロビーズをソートする磁気活性化細胞の110μLを加えます。一次抗VSG抗体に応じて抗マウス、抗ウサギ、または抗ビオチンビーズを使用してください。よく混ぜます。 10分間、4℃の低温室での渦細胞。
5. 細胞はボルテックスされているが、分離磁石に1磁気活性化分離カラム/サンプルを設定します。再を持っているようにしてくださいフロースルーを収集する列の下ceptacle（私たちは15ミリリットルの遠心分離管を使用します）。低温室で装置を設定します。
6. プライムカラムに血清を使用して、HMI-9の2ミリリットルを追加します。フロースルー各試料から収集する列の下に15ミリリットルの遠心分離管場所をプライミングした後。
7. ステップ2.4で10分間インキュベーションした後、血清をコールドHMI-9 800〜μlを添加します。 5200×gで4分間、4℃でスピンし、上清を除去し、未結合抗体を除去します。血清およびリピートは100μlの上清を残して、HMI-9の1ミリリットルで洗浄します。
8. 激しく視覚的に遠心管をフリックペレットを完全に再懸濁されていることを確認するために、チューブを点検します。細胞が十分に再懸濁されていることを確認するには、上下の血清およびピペットでHMI-9の1ミリリットルを追加します。

3.磁気分離

1. 上記のように列がプライミングされていることを確認します。カラムに細胞を適用します。フロースルー非支配VSを発現する細胞とを収集カラムを通って流れるように7分 - G. 1 mlの培地+トリパノソーマは、一般的に6を取ります。
2. ウォッシュ血清とHMI-9の1ミリリットルで2回およびフロースルー同じチューブのステップ3.1のように集めます。
3. 除算フロースルー（3ミリリットル）2 1.5ミリリットルのマイクロチューブに。
   注：これらは、後に組み合わせることができるか、半分など 、RNAを単離することができます
4. 磁石から列を削除します。カラムに血清を使用して、HMI-9の3ミリリットルを追加し、開始、支配的なVSGを発現する細胞を得るために15ミリリットルの遠心分離管に列を急落。後の分析のために溶出した物質の300μLを削除します。氷の上でこれらの細胞を保管してください。
5. 陽性および陰性対照として使用するために、37℃で増殖対照細胞の出発培養物からの約100万個の細胞を取り1.5ml微量チューブに、それらをピペット（それらは頻繁に切り替えることが予想されていません）。
   注：ポジティブコントロール細胞はステップ4.1でフルオロフォア標識抗体で染色されます。ネガティブコントロール細胞REMAプロトコルの残りの部分全体に染色されていないインチ
6. スピンフロースルーサンプルおよび抗体陽性対照試料4℃で4分間、5200×gで、上清を除去します。
   注：溶出セルの別の300μlのアリコートを、抗VSG染色の陽性対照として使用することができます。

4.染色は、汚染物質やスイッチャーを識別するために、

1. 再懸濁し、フロースルーサンプルおよび100μlのHMI-9適切な希釈で血清+一次、フルオロフォア標識、抗VSG抗体とにおけるポジティブコントロール細胞。
   注：標識抗VSG抗体は家で作られ、1の希釈で使用されている：1,000。フルオロフォア標識、抗VSGはstep.Thereは、ステップ3.5以下の二つのマイクロ遠心チューブ内のフロースルーサンプルの3ミリリットルであるべきMACS分離で非標識抗体と同じソースからすることができます。
2. フローサイトメトリーによってフロースルーのすべてを分析するために、一方の再SUS 2マイクロ遠心チューブ内でペレットを結合血清+抗VSG抗体を使用して、HMI-9の100μl中のサンプルを保留中。よく混ぜます。
3. 10分間、4℃の低温室での渦細胞。千μlの冷間HMI-9血清との - 800を追加します。スピンサンプル5200×gで4分間、4℃で、非結合抗体を除去するために、上清を除去します。
4. 血清とHMI-9の1ミリリットルで細胞を洗浄。スピンサンプル5200×gで4分間、4℃で、上清を除去します。この最後のスピンの間に、ステップ3.4および陰性対照試料から溶出し、サンプルをスピンダウン。
5. 血清で148.5μlのHMI-9、25μlの絶対計数ビーズと1.5μlのヨウ化プロピジウム染色溶液（175μlの合計）：内のすべてのフロースルーと溶出サンプルを再懸濁します。 175μlの正および負の抗体対照試料を再懸濁HMI-9の血清で。絶対計数ビーズ/使用される特定のロットの25μlの数を記録してください。
6. フローサイトメーターを介してすべてのサンプルを実行し、データを収集します。死細胞は、PIとして染色します ^{+。 VSGの+ - PIなどの汚染物質の染色。 VSG - -スイッチャーは、PIとして染色8。}
7. フローサイトメトリーデータを使用してスイッチング周波数計算します。
   注：スイッチング周波数を計算する方法については、補足ファイルを参照してくださいフローサイトメトリーCalculations.docxおよび表1。

結果

ここで説明する方法は、VSG発現部位内の二本鎖切断は、人口⁸にスイッチャーの数を増加させたことを実証しました。ここでは、同様に発現部位で二本鎖切断を生成するように誘導されているトリパノソーマの集団からの代表的結果を示します。私たちは、二本鎖切断を生成するように誘導されていないものにこれらのトリパノソーマを比較する。 図1は、フロースルーの列をソートする磁気活性化細胞からに集め、非誘導し、誘導された細胞からのプロット代表的なフローサイトメトリーを示しています。この特定の実験のために支配的な出発VSGはVSG2ました。 図1Aの左側のパネルは、前方に表示され、ゲートが生細胞の特徴である前方および側方散乱シグネチャを示す絶対計数ビーズと細胞の周りに描かれることを可能にする側方散乱、。ゲートができることに注意してください死細胞はPI染色を用いて除去することができるので、より多くの細胞を含むように描かれます。しかし、ゲートがすべての試料について同じに維持されなければなりません。

ディスカッション

実験技術に関しては、プロトコルの最も重要なコンポーネントは、冷たいすべてのサンプルを保っています。トリパノソーマは非常に迅速に、それらの表面⁹に結合した抗体の内在化が、このプロセスは、運動性に依存し、細胞を4℃に維持される限り、アッセイに影響を及ぼしません。全てのサンプルは、常に氷上で保存されるべきで、ピペッティングを25℃の実験室環境への暴露を最小限にするために迅速に行われるべきです。コールドHMI-9血清では、実験の開始時に利用可能であるべきであり、全体を通して氷上に保持する必要があります。カラムを通って1ミリリットルのサンプルを実行するには、7分 - それは5を取るように、列の上にそれらを実行して、トリパノソーマの単離は、低温室で行わなければなりません。利用可能な磁気分離ユニットよりも多くのサンプルが存在する場合、磁気分離であれば積極的に分離されていない試料を氷上に保持されるように、順序で行うことができます。

試料が非常によく混合AFであることも重要です磁石上のマイクロビーズと、単離前にとのインキュベーション後の最後の洗浄ター。これは、遠心分離管または光...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
非標識抗VSG抗体	n/	a n/a	VSG抗体は自社製
蛍光色素で標識された抗VSG抗体	n/a	n/a	VSG抗体は自社製
HMI-9培地	n/	a n/a	HMI-9は自社製
ヨウ化プロピジウム	BD Pharmingen	556463
CountBright アブソリュート計数ビーズ	サーモフィッシャー科学	C36950
LDのコラム	Miltenyi Biotech	130-042-901
MACSの磁石	Miltenyiの	バイオテクノロジー130-042-303
MACSの磁気分離器	Miltenyi Biotech	130-042-302
ボルテックスのアダプター-60	ThermoFisherの科学的な	AM10014
の流れのサイトメーター	コールター	n/a
フローサイトメーター解析ソフトウェア	FloJo	n/a