ImageJのプラグインを使用して細胞の計数手順の自動定量化と分析

Summary

この論文は、2つの新しいオープンソースImageJプラグイン、Cell Concentration Calculatorと遊走アッセイCounterを通じて、血球計算盤と遊走/浸潤顕微鏡写真の定量化について説明しています。 さらに、画像取得とキャリブレーションのプロトコルについて説明し、プラグインの入力要件についても詳しく説明します。

Abstract

健康のImageJの国立研究所は、強力な、自由利用可能な画像処理ソフトウェアスイートです。 ImageJのは、様々な生物学的粒子をカウントするために有効に利用することができる総合的な粒子解析アルゴリズムを有します。セルの多数のサンプルをカウントすると、血球計数器は、時間に関してボトルネックを提示します。同様に、ImageJのプラグインセルカウンターで移行/浸潤アッセイからの膜を数え、正確なものの、非常に労働集約的主観、および手首の痛みを引き起こすための悪名高いです。このニーズに応えるために、我々は、自動血球計数器（または知られているボリューム）と移行/浸潤細胞計数の唯一のタスクのためのImageJ内の2つのプラグインを開発しました。どちらのプラグインは、最小限の背景に高品質の顕微鏡写真を取得する能力に依存します。彼らは、使いやすいとカウントのキャリブレーションを支援する組み込みの分析ツールを持つ大規模なサンプルサイズの迅速な計数および分析のために最適化されています。コア原理を組み合わせることにより自動化された計数アルゴリズムおよびポスト計数分析による細胞カウンタのsが、これは非常に遊走アッセイ精度を失うことなく処理することができる容易さを増大させます。

Introduction

インビトロでの細胞計数では、組織培養実験の広い範囲の重要な基本的な技術です。正確に培養物中の細胞の数を決定する実験の再現性および標準化の^1,2のために不可欠です。細胞計数は、血球計を用いて、ならびに自動化された方法の様々な独自の利点と欠点^3,4,5でそれぞれを使用して手動で行うことができます。細胞計数のための自動化された方法のほとんどは、2つのクラス、コールター原理を使用するか、フローサイトメトリーもののいずれかに属しています。コールターカウンターは、細胞数およびサイズを決定するために、セルの電気抵抗を利用します。彼らは、高速で正確かつフローサイトメーターよりも安くなっています。しかし、彼らはほとんどマニュアルカウント³に比べて、それらのかなりのコストにのみ細胞計数のために使用されていません。フローサイトメーターは、一方で、高価であるが、それらは、細胞計数、細胞形状の解析、STのような多くの用途を有しますructureと内部細胞マーカーに^4,5を測定^します 。これら2つの原則のいずれかを使用するマシンは、多くのメーカーから入手可能です。自動化された方法は、手動計数のために必要な時間の一部が付属していますが、高価なマシン^6を使用しながら手動カウントが手頃な価格が、時間がかかり、バイアスの対象となります。

他の一....

Protocol

1.複合顕微鏡とカメラ設定（細胞濃度計算）

1. 、調光つまみで完全に電球の明るさを増やし4X対物レンズに切り替え、位相コントラストフィルタが選択されていることを確認します。
   注：暗い背景と組織培養のための任意の倒立位相差顕微鏡、 例えば、PHPの位相差は、標準的な顕微鏡及びカメラ手順に従って使用することができます。
2. 顕微鏡のソフトウェアの中では、デフォルト値に画像キャプチャ設定を行います。
   注：これらの設定の場所を見つけるために、顕微鏡のユーザーマニュアルを参照してください。
   1. 「明るさ」、「コントラスト」、および100％の「彩度」と「ガンマ」と1.0への「ゲイン」を設定します。
      注：ソフトウェアによっては、「明るさ」と「コントラスト」は0パーセントの値の代わりに、100％をデフォルトにすることができます。
   2. セットの画像は黒と白のは、最高解像度のご利用できますを使用して捕捉されます電子（1600 X 1200ピクセル（px）以上）。
      注：黒と白の設定が利用できない場合、0％の「飽和」は十分です。
3. 顕微鏡ステージ上に標準血球計数器を配置し（ 図1A）に示されるように画像を取り込みます。これは、「ボリュームキャリブレーション画像」です。必要に応じて露光タイミングを調整します。

Results

細胞濃度の計算

図1は、CCCのキャリブレーションと可算画像取得の全体的なプロセスを提示しています。 図1Aおよび1Bは 、ピクセル単位でP-正方形の長さのP-正方形のキャリブレーション画像や計算を示しています。 CCCは、式を使用して、指定されたボリューム内の細胞濃度を決定します。

血球計数器のP-四角は100 nLの（X 0.1ミリメートル1ミリメートル×1ミリメートル）の容積を有しており、この一定の与えられた、総画像ボリュームはミリメートルにピクセルを変換した後.......

Discussion

重要なステップ、トラブルシューティング、および制限

自動化された計算方法の性質上、粒子解析の特にそれらは、これらの粒子を定義するための数学的能力を必要とします。その結果、細胞濃度の計算および遊走アッセイカウンタの両方の精度が撮影した画像は、細胞試料または遊走アッセイ膜に似ているつまり、どのように密接に、画像の忠実度にすぎなかっ依存しています。したがって、可能な限り最高のような顕微鏡及び関連するソフトウェア較正プロトコルに従う最上重要です。これは、バックグラウンドノイズを制限する不要パーティクルを低減すること、明るく均一に合焦画像を撮影し、TIFFなどの非非可逆ファイル形式で保存含みます。したがって、両方のプラグインは、これらの要件が満たされていない場合、誤った結果を生成する可能性があります。彼らがDOUBにするときの視覚的期待に一致するかどうかを決定するために、常にそのため、二重チェック細胞数にお勧めしますトン。実際の結果が一致しない場合は、二値画像と元の画像を比較すると、この問題（10.4ノートを）解明に役立つことがあります。いくつかのケースでは、より暗い遊走アッセイ画像はカラーしきい値.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HyClone Classical Liquid Media: RPMI 1640 - L-Glutamine	Fisher Scientific	SH3002702	Cell Cultureing Media
胎児ボビアン血清(FBS)	GIBCO BRL	P00015	培地供給
HTR8/SVneo栄養膜細胞株	細胞は、チャールズ・グラハム博士(女王)から入手しました。s University, Kingston, Canada)		ソフトウェアは、あらゆる細胞株で動作するように設計されています。
トリプシン	GIBCO BRL	27250-018	10 & micro で 0.20% (w/v) として調製;M EDTA 1x PBS
Accutase	革新的な細胞技術	AT104
10 cm細胞培養プレート	SARSTEDT	833902	任意の組織培養処理プレートが適しています
トランズウェルポリエステルメンブレンインサート - 8.0 &マイクロ;m 細孔径	Costar 3422 フィッシャーサイエンティフィック7200150から注文		24ウェルプレート用;細孔径:8.0&マイクロ;m;直径6.5mm;0.33 cm2成長領域
HARLECO 血液学の汚れおよび試薬、EMD Millipore - Soluntions 1、2 & 3	EMD Millipore、VWR	65044A、B、&から注文C	Hemacolorの汚れセットは3つの500のmlの(16.9オンス)のポリびん及びメタノールの固定剤(解決1)、エオシンまたは酸の汚れ(解決2)、およびメチレンの青または基本的な汚れを含んでいます(解決3)
綿の先端を付けられたアプリケー	ターPuritan Medical	806-WC
の単一の端の産業かみそりの刃VWR		55411-055	:0.30のmmの(0.012")
顕微鏡のスライド-precleaned/plain	フィッシャーサイエンティフィック	12550A3	寸法:25 mm x 75 mm x 1.0 mm
フィッシャーブランドカバーグラス-長方形番号1	フィッシャーサイエンティフィック	12-545E	厚さ:0.13〜0.17 mm;サイズ:50 mm x 22 mm
フィッシャーケミカルパーマウント 取り付け媒体	フィッシャーサイエンティフィック	SP15-500
ライカステレオ解剖顕微鏡	ライカマイクロシステムズ		マイクロソープにはライカ顕微鏡カメラモデルMC170 HDが搭載されており、カメラソフトウェアはライカアプリスイート(LAS E2)バージョン3.1.1 [ビルド:490]。顕微鏡部品: LED3000スポットライト照明モデル:MEB126、ライカM80光学キャリアモデルM80、対物レンズアクロマート1.0X、WD=90 mmモデル:MOB306&対物レンズ アクロマート 0.32X, WD=303 mmモデル:MOB315、ビデオ対物レンズ0.5倍モデル:MTU-293
血球計算盤	アシスタントドイツ		0.100 mm 深さ - 0.0025 mm2
>オリンパス倒立光学顕微鏡	オリンパス株式会社	CKX41SF	マイクロソープにはLumenera Infinity 1-2 2.0メガピクセルCMOSカラーカメラが装備されています。カメラソフトウェアは、Infinity analyzeバージョン6.5.2
層流キャビネット1300シリーズA2	Thermo Scientific	モデル:1375	細胞培養作業用の任意の層流キャビネットが適しています
細胞培養インキュベーター	Thermo Scientific	モデル:370	任意の細胞培養インキュベーターが適しています-細胞は加湿環境下で培養されました、5%CO2、37°;C
ImageJ	NIH	Version 1.50e	必要な最小バージョン
Java Runtime Environment	Oracle	Version 1.8.0_66	必要な最小バージョン