水中の内分泌活性のスクリーニング市販の使い方<em&gt;インビトロ</em&gt;トランスバイオアッセイ

サマリー

処理された廃水や地表水を含む水サンプルの有機抽出物中の内分泌活性をスクリーニングするためのプロトコルは、市販の分割停止(「凍結融解」)in vitroトランス活性化バイオアッセイを使用して適応されました。

要約

試験管内トランスバイオアッセイではしかし、彼らの採用および広範囲のアプリケーションが原因で標準化された方法で堅牢な、ユーザーフレンドリーな技術の利用可能性の欠如に部分的に妨げられてきた、水質監視ツールとして有望であることが示されました。本研究では、市販されている、分割逮捕された細胞株を定量的環境の質の専門家への関心の水試料中に存在する化学物質の内分泌活性をスクリーニングするために使用しました。総合的な品質保証/品質管理（QA / QC）のチェックを含め、単一の、標準化されたプロトコルは、細胞ベースの蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）アッセイを用いて（それぞれERおよびGR）エストロゲンおよびグルココルチコイド受容体活性のために開発されました。カリフォルニア（米国）での淡水システムから処理された下水排水や地表水のサンプルは、固相抽出を用いて抽出し、標準化されたプロトを使用して、内分泌活性について分析しましたCOL。背景とエンドポイント固有の参照化学物質の用量反応は、信頼性の高い測定のために必要と認められるQA / QCのガイドラインを満たしました。地表水試料のバイオアッセイスクリーニング応答は、主に検出されませんでした。これとは対照的に、二次処理工場からの流出物サンプルは、ERのための392 ngのデキサメタゾンGR用/ Lおよび17 ngの17βエストラジオール/ Lまでの推定バイオアッセイ同等の濃度（BEQs）で、最高の測定可能な活性を有していました。三次流出物サンプルのためのバイオアッセイ応答は、高度処理後の内分泌アクティブな化学物質の低い残留を示し、二次排水のために測定されたものよりも低かったです。このプロトコルは、市販の利用ビトロトランスバイオアッセイで 、分割逮捕セル「キット」、水中の内分泌活性をスクリーニングするために適合させることができることを示しました。

概要

現在の水質のモニタリングを正確かつ精密に野生動物とヒトへの暴露の代用としての化学汚染物質の発生を測定する能力を前提としています。しかし、この化学・バイ・化学的モニタリングと評価のパラダイムは、我々が直面して刻々と変化する化学の世界でペースを維持することはできません。私たちは、合成および天然の化学物質の運命と影響についての詳細を学ぶように、私たちは期待生物学的影響に対処測定ツールを探し続け、同時にそれは、化学物質の生産、使用状況や環境入力の変化に免疫があります。このようなツールは、未知または新規化学物質、および変換製品は、私たちの注目に値するかどうかを理解するために特に関連しています。また、水中に存在する化学物質の複雑な混合物はあまり個々の化学モニタリングによって対処されます。したがって、私たちはより良い表層水の股関節にこれらの問題に対処するために既存の監視ツールボックスの近代化の課題に直面しますトン下水処理水排水と都市/雨水流出の排出を受けます。

近年、生物分析技術は、水の品質評価のためのスクリーニングツールとして有望であることが示されています。知ら介して作用する化学物質への対応、特に、in'vitroバイオアッセイでは、アクション^1,2の特定のモードは、環境モニタリングのコミュニティ³に大きな関心が持たれています。多数の調査は飲酒、表面および廃水^{4 -6}の内分泌活性を定量化するために....

プロトコル

1.収集し、プロセス水サンプル（エッシャーらから変更された^。9）

1. 関心の水試料でトップに1グラムのアジ化ナトリウムおよび50mgのアスコルビン酸を含む清浄な1 Lアンバーガラスボトルを埋めます。 72時間内のショップ4°Cでのサンプルおよびプロセス。
   注：アジ化ナトリウムは非常に毒性があり、慎重に取り扱わなければなりません。保護具（目/顔、手袋、衣服）を使用し、適切に機能してヒュームフード内で重量を量ります。計量のための金属へらを使用しないでください。
2. 1.6μmのガラス繊維フィルターを通して試料を通過した後、5-10 ml /分の流速で前処理固相抽出（SPE）カートリッジを通して。流量を制御するために、真空ポンプの圧力を調整します。
3. 真空を15分間カートリッジを乾燥させます。
4. ヘキサン（1：1、v / v）のアセトン10ml、続いてメタノール10mlでカートリッジを溶出します。
5. 高純度窒素の穏やかな流れの下で〜1mlに溶出液を濃縮します。溶媒ジメチルスルホキシド（DMSO）500μlのを追加し、ダウンを500μlの抽出液を蒸発させることによって交換。
6. アンバーガラスオートサンプラーバイアルに抽出液を転送します。 -20℃で保管してください。

2.アッセイ特定の参照化学物質の希釈液と水....

結果

本研究では、処理された都市下水排水の4倍24時間の複合サンプル、南カリフォルニアの淡水システムからの地表水の6グラブサンプルおよび超純水からなるフィールドブランクは、このプロトコルを説明するために選択しました。 4廃液試料の3は、従来の活性汚泥排水処理プラント（「二次流出液」）、および砂/炭素ろ過追加後の生物学的処理（「三次流出液」）との高度な排水処理プラントから4分の1からのものでした。地表水のサンプルは（オープン、農業や都市部）の異なる土地利用を表す流域から収集しました。

水抽出物の希釈は、DMSO対照（ 表1）と比較して観察された20％未満の細胞死で明らかな細胞毒性を示しませんでした。無細胞（メディアのみ）バックグラウンドが低く、CDMSOの応答を有する細胞のみ-と細胞との間omparison溶媒は、蛍光測定には測定可能な影響を与えなかったことを示しました。スロープおよびEC ₅₀ログを含む.......

ディスカッション

このようなNG / L濃度^23,24でこれらの化学物質のための17βエストラジオール（E2）、ワラントのスクリーニングなどの環境エストロゲン、のよく文書効力。本研究では、汚水排水（BEQ範囲：2.3〜17 ngのE2 / L）のためのER応答は、オーストラリアのWWTPs ²⁰から二次処理水のために報告されたものよりやや高かった、表面水のBEQs一方（<0.5〜4 ngのE2 / L ^{）16（<1〜11} ngのE2 / L）面と他の場所で雨水のために報告された範囲内でした。地表水の試料で測定ER活性の低レベルにもかかわらず、このアッセイは、水の品質評価に関連するスクリーニング・エンドポイントを表しています。ビスフェノールA及びアルキルフェノール界面活性剤などのエストロゲンは、多くの場合、水生環境中で検出され、それらは、従来の分析化学を使用して定量化することは困難です。小島らによって示されるようにER-細胞アッセイはまた、現在新たに登録された農薬のスクリーニングに有用であることを証明することができます^25。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
GeneBLAzer ER alpha DAアッセイキット	ThermoFisher	K1393	Kitには、ER分裂停止(DA)細胞とLiveBLAzer FRETローディングキットが含まれています。
GeneBLAzer GR DAアッセイキット	ThermoFisher	K1391	Kitには、GR分裂停止(DA)細胞とLiveBLAzer FRETローディングキットが含まれています。
PrestoBlue細胞生存試薬	サーモフィッシャー	A-13261
トリパンブルー、PBS	Sigma-Aldrich	T8154	ThermoFisher
Corning 96ウェルブラックウォール、クリアボトムプレート	Corning	3603	個包装、蓋付き
Whatmanガラス繊維フィルター、GF/A、1.6 & マイクロ;M	シグマ-アルドリッチ
マイクロプレートアルミ封止フィルム	E&K Scientific	T592100
Oasis HLB 6 cc カートリッジ、吸着剤 200 mg	ウォーターズ	WAT106202
17&β;エストラジオール	Sigma-Aldrich	E2758	CAS #50-28-2
アスコルビン酸	Fisher Scientific	A61-100	Sigma-Aldrich
Dexamethasoneでも入手可能	シグマ・アルドリッチ	D4902	CAS #50-02-2
ジメチルスルホキシド(DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	分子グレード
溶剤(アセトン、ヘキサン、メタノール)	Fisher Scientific		HPLCグレード
アジ化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S2002	ケミカルは非常に毒性が高いため、取り扱いには注意が必要です。防護服を使用し、ドラフトの下で体重を量ります。EMD Milliporeでも購入できます。
自動セルカウンターまたは血球計算盤	さまざまな*		サプライヤーには、Bio-Rad、Fisher Scientific、Sigma-Aldrich、ThermoFisherが含まれます。
クラスII生物学的安全キャビネット	各種*
CO2インキュベーター	各種*
極低温冷凍庫	各種		*液体窒素貯留デュワーがおすすめです。
蛍光マイクロプレートリーダー	Various*		リーダーには、下部読み取り機能が必要です。
*推奨されるソースはなく、この機器の選択は予算、使用頻度、およびラボスペースによって異なります。

0.4% 滅菌 WHA1820025