受粉エコロジーのフィールド実験：の事例<em&gt;ヒガンバナ属sanguinea</em&gt; VAR。<em&gt; sanguinea</em

サマリー

所与の植物種の花粉の有効性を明らかにするために、フィールド実験の複数の方法が開発されています。この研究は、 ヒガンバナ属sanguinea VAR。sanguineaのケーススタディおよび新規受粉機構、破壊-蕾受粉を使って受粉生態学のためのフィールド実験の基本的な方法を示しています。

要約

植物と花粉媒介者の相互作用は、約100年間研究されてきました。その間、訪問した花に対する各花粉媒介者の受粉効果を明らかにするために、多くのフィールド方法が開発されました。花粉媒介者の観察は、花粉媒介者を特定するための最も一般的な方法の1つであり、特定の花粉媒介者の有効性を示すために、袋詰めおよびケージ実験が行われてきました。Lycoris sanguinea var. sanguineaに関する以前の研究では、その効果的な花粉媒介者、各花の訪問者の訪問頻度、およびその繁殖戦略は特定されていませんでした。この研究では、小さなミツバチが部分的に開いた花(つぼみを壊す)を訪れたという観察結果が報告されています。私たちの知る限り、この現象はこれまでに報告されていません。さらに、この研究では、小さなミツバチがその開花段階で受粉できるという仮説を調査します。本研究は、L. sanguinea var. sanguineaを用いた受粉生態学の野外実験の基本的な方法を示すものである。花粉媒介者の観察とデジタルビデオは、各花の訪問者の訪問頻度を示しました。袋詰めとケージの実験により、これらの花は完全に受粉でき、この植物種の受粉にはつぼみの受粉が重要である可能性があることが明らかになりました。各方法の長所と短所について説明し、実験室での実験を含む最近の開発について説明します。

概要

植物花粉媒介の相互作用は、進化生物学や生態学の研究のための主な例です。花と花粉媒介間の共生関係は、他の生物と非生物的要因も影響^3,4,5を発揮しているが、自然選択の結果として、被子植物^1,2の多様化を促進したと考えられています。また、花の形質が最も効果的な花粉媒介に適応するために、より果実や種子^6を生成するために変更されていると考えられています。これらの信念は、様々な解釈^7を伴うような受粉効果など、さまざまな指標に基づいて大規模研究、けれども構築されています。

受粉システムを一般化している草花は花粉媒介⁸の様々な種類が訪れています。ここで、花の訪問者は、花の報酬を得るために訪問し、花粉媒介が受粉花の訪問者のように定義された動物種と定義しました。これらの訪問者の中には、訪問した花の徴候に同種花粉を運ぶと花粉媒介として分類することができます。他の訪問者はまた、いくつかの種内花粉を有していてもよいです。彼らは花粉媒介と花の間の行動や形態学的なミスマッチに起因少ない受粉を行う可能性があります。植物再生への寄与におけるこれらの同等の違いは、花の形質⁹に選択圧の様々な程度を生産する可能性があり、開花植物の適応発散を引き起こす可能性があります。したがって、花粉媒介コミュニティの組成と相対的な種の豊富さは¹⁰重要であるが、各訪問者の有効性の正確な評価はまた、植物の適応および/または進化のプロセスを決定することが重要です。

本研究では、訪問頻度あたりの果実と種子生産のように定義された授粉効率の定量的な推定値は^、11を決定しました。スペックIES各花の訪問者の頻度を観察し、訪問花の生殖影響を推定しました。人間の観察を通して花の訪問の記録は、受粉生態学における古典的な方法です。しかし、この方法は、植物の前に留まることと慎重、長期的測定を行うために必要な観察者、に大きな負担を課します。最近では、撮影及び録音の技術が急速に発展しており、低コストのデジタルビデオカメラは、授粉の観察^12,13にビデオ録画の導入を有効にしています。これらのメソッドは、花の訪問者に関する基本的な情報の収集を容易にすることができるし、標的植物種の受粉生態の理解を開発するために助けることができます。

しかし、花粉媒介の訪問頻度は、必ずしもそれらの受粉効果^7,14に相関し、各花粉媒介者の質的な効果を評価することが重要であるされていません花のフィットネスに。受粉の有効性は聖痕^15,16、花粉管の成長^17,18と果物および/または種子生産^19,20上の花粉粒の数によって推定されています。実験を袋詰め、ビジター専用の袋を使用して行われ、自己の互換性をテストするための典型的な方法であり、自家受粉^21,22、およびapomixisの複数形²³の存在。また、訪問者の集合体で、特定の花粉媒介のための受粉の有効性の評価は、しばしば、他の花の訪問者があることも大きいの授粉を除外するのに十分に小さいメッシュで（ すなわち、ワイヤーケージ、ネット、またはバッグを制限されている環境で行われています顕花植物で設定）。例えば、小さなメッシュバッグ付袋詰め実験は、アリやアザミウマ^24,25の受粉能力を明らかにするために行きました。また、ワイヤーケージやネットを使って鳥排除実験は、 アロエの分類群の効果的な花粉媒介を示しています^26-28。

本研究の目的は以下の通りであった：1）前の論文で使用された方法を導入し、2）花の訪問者、自分の訪問頻度に他の研究における一般的な使用のため、これらの方法を改善するために、植物の適応度に及ぼす影響ヒガンバナ属のsanguineaの VARを。 sanguineaは日本全国と狭く韓国²⁹に広く分布し、漏斗状赤橙色の花（ 図1a）を有する属ヒガンバナ属に含まれる種の一つです。以前の研究では、ことを明らかにしたL. sanguinea VAR。sanguineaは、正体不明の小さな蜂の種とより大きな種Amegillaのflorea ²⁹を含む複数種の昆虫、が訪れました。しかし、これらの訪問者の訪問頻度と受粉有効性は確認されませんでした。花の訪問者を識別するための授粉の観察は、最初に行きました。小さな蜂による訪問をOBSEましたまだ完全には開かれていなかった花にrved（芽を壊す; 図1B、C）。小さな蜂が破壊芽でundehisced葯の周りに急いで移動し、その下顎を使用して花粉を集めました。仮説は葯と花で聖痕の間に隙間がハチの体長よりも小さかったので、小さなミツバチが破壊芽段階で花粉媒介することができたということでした。したがって、袋詰めの実験が破壊芽段階で小さなミツバチの受粉能力をテストするために、さらにL.の繁殖戦略を検討するために行きましたsanguineaの VAR。sanguinea。これらの芽は、ミツバチの受粉能力の推定を可能に訪れた小さな蜂、後に袋詰めされました。個人は未開封の芽でケージに入れました。小メッシュケージは全体floweを通じて小さなミツバチの受粉効率の推定を可能にする、唯一の小さなミツバチが渡すことができ、それを通して、使用されましたリングステージ。

プロトコル

注：この記事は、私たちの前の仕事³⁰に基づいています。一部の部品は日本とスプリンガー日本の植物学会の許可を得て転載しています。

1。花の訪問者の観察

1. 観測フィールドの選択
   1. 植物材料が分散されている領域を検索し、信頼性の高いリソースを使用して候補研究サイトを選択し、 等絵本、学術雑誌、などの研究目的に合わせて学習サイトの数を調整し（ 例えば、の場所の広い範囲全国の花の訪問者との比較）。
   2. 長期的な研究が必要とされている場合は、このような研究機関や宿泊施設などの関連する出発点から選択された候補集団の位置との距離を確認してください。
   3. おおよそ単位領域に植物個体数をカウントすることにより各集団の大きさを推定します。操作さ実験のための大規模な集団を選択多くの植物個体を用いて、S。
   4. 花の来場者の事前観測
      1. 人口密度に応じて、同じ時間間隔中に観察される各領域内のどの標的個体決めます。 5月10日新たに開いた花を選択するか、ターゲットの花のように芽を破壊し、既に開かれている劣化したものを拒否する。
      2. 花は^31,32の範囲の異なる時間に様々な花粉媒介者が訪問される可能性があるため、一日の期間のための目視観察を開始します。
      3. 記録シート上に、花の訪問者の種名と花あたり時間あたりの各面会の時間を記録。
      4. 花の訪問者が葯および/または徴候を触れるかどうかを綿密に観察します。彼らが行う場合は、花粉媒介として来場者を記録。花の訪問者が唯一の花を訪問し、生殖器官にタッチしないと、訪問者としてそれらを記録。
      5. 昆虫ネットや手作りの吸引器を使用して、識別するために、花の訪問者を捕獲し、標本（ 図1F）としてそれらを保存します。胸部への酢酸エチルまたは指の圧力に迅速に捕捉された訪問者を殺し、そしてソフトバッグにまたは100％エタノールでプラスチックチューブやケースでそれらを保存します。
      6. 観察した後、形態学的特徴を用いて、試料の特定の名前を識別したり、識別の難しさの場合には、各分類群のための専門家の助けを要求します。
2. フィールドでの観測
   1. 彼らのアクセシビリティ、人口規模、および花の訪問者の数に基づいて研究サイトを選択します。開花シーズンの花の訪問者の代表的なサンプルを含む期間を選択し、研究目的に基づいて、観察期間を決定する（ 例えば、花の訪問者訪問、周波数変動の研究のために、長い期間を設定する必要があります）。
   2. （例えば、デジタルビデオカメラのように、適当な記録装置を準備例えば、夜の記録のために、赤外線機能付きビデオカメラ）が使用されるべきです。
   3. 1.1.4の場合と同じ方法でターゲットの花を選択します。
   4. アルミ三脚にビデオカメラを固定してください。 50cm程度離して、対象個体の前で三脚でカメラを設定します。
   5. チェックして、撮影前にカメラの画面が表示されます上の光の量や材料のフォーカスを変更します。
   6. 目視やビデオ撮影は、（この場合には、観察期間は、約5：00時から13時午後に、平均して6時間以上であった事前の観測によって推定適切な時間帯で同時に開始します）。
   7. 観光客や花粉媒介の種名を特定し、その名前と記録シート上での訪問の時間を記録。
   8. 1.1.4.5と同様に観光客や花粉媒介をキャプチャし、識別します。
   9. 各observatioのために1.2.7へのステップ1.2.1を繰り返し、n期間。研究目的と予備観測データに基づいて、観察期間を設定します。
3. 観測後のデータ解析
   1. 1.1.4.6と同様に花粉媒介観察した後に捕獲さ標本の種名を特定します。
   2. ビデオクリップをチェックして、目視の場合と同じ方法で、種名とその訪問時間に注意してください。
   3. 目視やビデオ録画データから、各花の訪問者の時間当たり1花当たりの訪問頻度を計算します。このようなR、SPSS、および/またはSAS ^33-35（ 例えば、二元配置分散分析（ANOVAなどの基本的な統計情報と適切なソフトウェアを使用して、に基づいて、適切な統計的手法を用いて、各訪問者のサイトと年の間に統計的にこれらの周波数を比較）RソフトウェアのTukeyの正直な有意差（HSD）テストで）。

2。バギングとケージ実験

1. バギングとケージの実験のための準備
   1. 袋詰めの実験のために、小さなメッシュサイズを有する袋（〜0.5〜1ミリメートル）を作製し、完全に花の訪問を防ぐためにそれらを使用する（ 例えば、不織布バッグは、2011年と2012年に袋詰めの実験に使用しました）。
   2. ケージ実験のために、ターゲット小さい訪問者が通過することができますが、大きいものを除外し、直径とワイヤ又はプラスチックメッシュ板を準備し、ケージを形成するために、これらのメッシュボードを接続します。メッシュ径よりも大きなギャップがないことを確認してください。標的植物種および個々の数字に基づいて、ケージのサイズと形状を調整します。
2. 袋詰め実験
   1. 草食動物から、または過酷な環境からのダメージを与えない処理当たり30人を選択します。処置のために、各個々の植物から一輪の花を選択するか、または単一の植物上の個々の花を使用します。
   2. バッグトン彼はテープ（; 図1グラムシリアル番号とアルファベット）でそれらを標識した後、フィールドに花をターゲットにしています。自家受粉の可能性を回避するために袋の中に葯や聖痕を触れないように注意してください。
   3. 慎重に柔らかい文字列またはワイヤ（ 図1D）を使用して、花に袋を固定します。
   4. 慎重に、必要に応じて、袋の重量や風の下で傾きや崩壊に対する個人をサポートするために、ソフト文字列またはワイヤを使用して担体と直立個々の花を設定します。ダメージを作成しないように、対象の個々の茎の周りにそっと文字列またはワイヤをねじったり、巻きます。
   5. 袋詰め実験で治療
      1. 「コントロール」治療のために、ターゲットの花にラベルを添付して、何の処理を行っていません。花の訪問者が自由に訪問できるようにします。
      2. 「殖」治療のために、彼らの花まで、芽をカバーし、その後、袋詰めの花の葯を取り除きます。いくつかのポレを入れて聖痕上の複数の個人からのn個の粒。
      3. 「自家受粉」治療のために、花が開いまで芽をカバーし、彼らの聖痕の上に同じ花から花粉を置きます。再びこれらの処理された花をカバーしています。
      4. 「自動自己」処理のために、開花シーズン終了までの袋で芽をカバーしています。
      5. 「ブレイキング・バッド」治療のために、訪問された破壊芽を識別し、小さな蜂の入り口または出口を観察する（ 図1B、C）。さらに参観を防ぐために迅速にこれらの芽小さな蜂によって面会後に同じ花に繰り返さ花粉堆積を防ぐために壊す芽の葯を取り出し、袋。
      6. 「開花」治療のために、袋の開放ステージまでの芽が破壊芽の段階での訪問を避けるために。その後、バッグを削除して、訪問者が蜜や花粉を収集することを可能にします。
      7. "バッド"治療のために、未開封芽から葯を除去し、人工的にそれらを異種交配。花の訪問を防止するための迅速バッグは、これらの芽。
3. ケージ実験
   1. 準備されたケージでターゲット植物個体をカバーしています。別の聖痕（ 図1eの ）との間の接触と花粉の堆積を防ぐために、手でケージの花の位置を調整します。
   2. 「ケージ」治療のためには、未開封の芽を持つ個人を選択し、選択された花の同定のためにそれらにラベルを置きます。ケージケージの設立前からの影響を除去するラベルされた芽を持つ個体（ すなわち、花の昆虫は未開封の芽を訪れることができず、ケージの配置後に訪れる昆虫の効果のみを推定することができます）。
   3. ケージのベースと接地との間に訪問者侵入を防ぐための鉄の棒を使用して、地面にしっかりとケージを取り付けます。
4. データ分析のAfバギングとケージ実験ター
   1. 切断し、母体の個人からそれらを分離することにより開花シーズン（ 図1グラム ）の末端で標識花のすべてを収集します。彼らの汚染を防止するために、別々に各標識試料を保持します。
   2. 各ラベル付きに設定果実の有無を確認果物を設定する場合には、各果実の種子数をflower.Record。
   3. （フルーツセット率、花の数で割った果実の数として定義される）と数で割った種子の数として定義されて成熟した果実（種子セット率、あたりの種子数の花あたりの果実数の比を計算します胚珠の）記録された数のすべてを使用して。
   4. 統計的に、このような1.3.3に示したものと適切な方法とソフトウェアを使用して、治療間fruit-と種子セットの比率を比較（ 例えば、TukeyのHSDまたはRソフトウェア³³でフィッシャーの正確確率検定で一方向ANOVA）。
   5. 袋詰めした実験の結果を用いて、材料の研究
      1. 動物花粉媒介の必要性をテストするには、統計的に「コントロール」と「自動自己」の治療法間の結果を比較します。
      2. 花粉制限の程度を推定するために、「コントロール」と「交配」の治療法を比較します。
      3. 自己互換性をテストするには、「異系交配」と「自家受粉」の治療法を比較します。
   6. 破壊-蕾受粉の影響の評価
      1. 破壊芽の聖痕が生殖成熟しているかどうか、および「コントロール」治療の値は破壊芽段階の制御のために使用することができるかどうかを判断するには、「コントロール」と「バド」の治療法を比較してください。
      2. 決定するために、「自動自己」と「ブレイキング芽」の治療法を比較するかどうか破壊で小さなミツバチで受粉花の繁殖成功-budステージは自家受粉（ すなわち、破壊-蕾受粉の存在をテストする）を行う植物のものよりも統計的に高くなっています。その後、破壊-蕾受粉の受粉効率を推定するために「コントロール」で、これらの2つの治療を比較します。
      3. 破壊-蕾受粉の生殖影響を推定するために、「ブレイキング・バッド」、「ケージ」と「開花」の治療法を比較してください。

結果

ファイブ集団は授粉の観察のために選択しました。前の観察段階では、芽を破壊する花と小さな蜂を開くに様々な昆虫種の訪問が確認されました。花訪問者の観察は、すべての5つの研究サイトへの訪問者のほとんどは、小さな蜂の種Lasioglossumジャポニカの個人であることを明らかにしました。総訪問記録は、この種の訪問率が3つの部位（ 図2）で90％以上であったことを示しました。これとは対照的に、2番目に頻繁な訪問者、Amegilla floreaの比率は、これらのフィールドに10％未満でした。これらのハチの種も訪れた花の徴候に触れ、彼らは花粉媒介として記録しました。このようなEpisyrphusのbalteatusなどの他の頻繁な花の訪問者は、聖痕と接触せずに花粉を集め、彼らは訪問者として同定されました。 1サイトでは、データ分析が訪問することを示しましたDF = 1、F = 12.12：;一方向ANOVA：：：サイト2サイト3 DF =

ディスカッション

花の観察や袋詰めの実験は、それぞれ、訪問頻度や植物の雌の繁殖成功を明らかにするために、本研究で用いました。それは分析のための訪問者のタイミングと期間を記録し、観察者バイアスを防ぐことができるので^{、Dafni（1992）38}には、ビデオテープの方法が有効でした。しかし、一度、この方法は、高価な装置を必要とし、観察時間が電池寿命により制限されていました。近年、動画記録を生成するための装置のコストは減少しているが、この技術の方法は、他の授粉研究に用いることができます。本研究では、訪問頻度は、サイト3（ 表2）で視覚とビデオ観測間の有意差が認められました。これは、花の訪問者の過観察により引き起こされている可能性があり、このような人為的なミスは拒否することができます。 Dafni（1992）も繁殖システム^38を研究するための袋詰めやネットの実験に言及しました。非wovファブリックバッグ専用pollen-または防水ではありませんでしたこれは、使用された。L. sanguinea VAR。sanguineaは、風受粉種ではなく、雨水は、袋...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
記録シート	、任意の	NA
昆虫ネット	、任意の	NA
プーター	、任意の	NA
酢酸エチル	、任意の	NA
100%エタノール	、任意の	NA
プラスチックチューブ	、任意の	NA
プラスチックケース	、任意の	NA
ソフトバッグ		NA
デジタルビデオカメラ	NA
脚	NA
バッグ	NA
ワイヤーまたはプラスチックメッシュボード	NA
鉄線	NA
ラベリングテープ	NA
スティックサポーター	任意の	NA
ソフトストリングまたはワイヤー	任意の	NA
ピンセット(s)	任意の	NA

、、、三