タンパク質の品質管理システムを学びます D。 discoideumの温度制御された生細胞イメージングを用い

サマリー

最近、タンパク質のミスフォールディングとタンパク質の静止を研究するシステムとして、社会性アメーバDictyostelium discoideumが確立されました。ここでは、D. discoideumの温度誘導タンパク質凝集と細胞ストレス応答を研究するための新しいイメージングベースの方法論について説明します。

要約

社会性アメーバDictyostelium discoideumの複雑な生活様式は、さまざまな生物学的プロセスの研究のための貴重なモデルとなっています。最近、D. discoideumはタンパク質凝集に対して非常に回復力があり、細胞のタンパク質品質管理システムに関する洞察を得るために使用できることを示しました。しかし、D. discoideumをモデルシステムとして使用することは、細胞の高い運動性や光毒性に対する感受性など、顕微鏡ベースの実験的アプローチにいくつかの課題をもたらします。後者は、光毒性効果が細胞のストレス応答を誘発し、タンパク質品質管理システムの挙動を変化させる可能性があるため、タンパク質の恒常性を研究する際に特に困難であることが証明されています。

温度上昇は、細胞ストレスを誘発するために一般的に使用される方法です。ここでは、D. discoideumの温度誘発摂動を観察できる温度制御可能なイメージングプロトコルについて説明します。さらに、通常の成長温度で適用すると、このイメージングプロトコルは光毒性を著しく低減することもできるため、より高強度のイメージングが可能になります。これは、発現レベルが非常に低いタンパク質をイメージングする場合に特に有用です。 さらに、細胞の高い移動性は、個々の細胞を追うために複数の視野を獲得する必要があることが多く、視野の数は所望の時間間隔と露光時間に対してバランスをとる必要があります。

概要

細胞性粘菌食作用によって取り込まれる細菌や他の微生物を餌孤独な土壌生活アメーバ、です。それは、その発見以来^、1研究の主要な分野となっているユニークで顕著なライフサイクルを有します。多細胞の開発²および走化性³の分子基盤の初期の関心はすぐに細胞運動、細胞極性、先天性免疫に焦点を当てた研究によって補完されました。また、D. discoideumのは、生物医学研究の^4,5のためのモデルシステムとして導入されました。

最近、我々はDを設立しましたdiscoideumのタンパク質品質管理（PQC）システム^6,7を研究するための新たなシステムとして。そのプロテオームは、タンパク質品質管理⁸への課題となって凝集しやすいプリオン様タンパク質、に富んでいます。 D.かどうかを調べるために、 discoideumのは、その高度AGを制御するために、特別な分子機構を開発しましたgregationが発生しやすいプロテオーム、我々は通常の成長条件の下で、ストレス時の両方で凝集しやすいマーカータンパク質の挙動を研究しました。このような熱応力等の応力条件は、タンパク質ミスフォールディング⁹の速度を増加させるために使用することができます。したがって、我々は、温度変化を誘導し、同時にマーカータンパク質の挙動をたどることができ、システムを探していました。この目的のために、我々は、熱ステージインサート（冷却室）を用いてペルチェ制御加熱生細胞イメージングを組み合わせました。この方法では、我々は、一定で均一な温度を維持するだけでなく、迅速な、まだ正確な温度変化を誘発させました。

生細胞イメージングはDの生物学的プロセスの多様な研究するために使用されますdiscoideumの 。しかしながら、このアプローチは、2つの主要な制約に直面しています。最初に、細胞は、このように個々の細胞の追跡は、多くの場合、大面積の画像化を必要とする、高い運動性を表示し、視野の外に移動する傾向があります。セルの移動することができます寒天オーバーレイ¹⁰によって減少させることが、しかしながら、これらの条件は、生存率の減少に起因する長期的イメージングのために適していません。第二に、D. discoideumの細胞は、細胞の丸めと有糸分裂停止¹¹その結果フォト毒性、特に高い感度を示します。前のプロトコルは、ラジカルスカベンジャーと露光時間¹²の減少としてアスコルビン酸を添加することによって、この問題を取り上げました。関心対象のタンパク質を低レベルで発現され、弱い蛍光信号を示している場合、後者は重要であることができます。著者らはまた、エアコン付きの部屋で撮影したり、客観的かつ顕微鏡ステージ^12をカバー^する温度制御インキュベーションボックスを使用してのいずれか21℃の一定温度を提供することを示唆しています。

ここでは、23℃に設定した冷却チャンバを使用することにより改善された温度制御を備えた方法を記載しています。大幅に私たちのセットアップを撮像中に光毒性に対する耐性を向上させます。それより高い露光時間およびより高い励起光強度の使用を可能にします。時間間隔は、撮像された位置の数および使用される露光時間に対して慎重にバランスをとる必要があり、これは、タイムラプス撮影中に特に重要です。画像形成された位置の数を増加させる可能性も広い撮像領域のカバレッジを可能にし、より長い期間にわたって個々の細胞の追跡を容易にします。

プロトコル

1.細胞の調製

1. 成長する細胞
   1. D.を育てます組織培養プレート中の光下に23℃でAX培地中discoideumの細胞。 75％の密集度以上の高い密度で細胞を維持することは避けてください。
      注：最適な応答はストレスを加熱するために、細胞が指数増殖期にあることが必要と定常期に達していてはいけません。
   2. 撮影前日、1×10 ⁴細胞/ mlに低い蛍光媒体（LFM）に分割細胞。
      注：このステップは、AX媒体に起因するバックグラウンド蛍光を低減する必要があります。インキュベーション時間は、2時間を最小限に抑えることができます。しかし、AX媒体に取り小胞は、依然として2時間後にいくつかのバックグラウンドシグナルを生成することができます。
2. 顕微鏡用細胞を準備
   1. 撮影前に、LFMにおける組織プレートから収穫細胞とは、ガラス底皿に細胞の十分な数を転送します。
      注：通常、1×10 ⁵細胞/ mlで十分です。実験は、（8時間以上）、長い撮像期間を必要とする場合は、細胞数を慎重D.として、調整する必要がありますdiscoideumの細胞が発達サイクルに移行し、栄養素が低い一方で細胞数が高い場合にストリーミングと集計を開始します。
   2. 細胞は、20分間沈降することを可能にします。慎重に新鮮な培地で使用した培地を交換することにより、非定住細胞を除去します。

2.イメージング

注意：このプロトコルは広視野システムに同様に共焦点顕微鏡のセットアップに使用することができます。目的をカバーする温度制御インキュベーションボックスと顕微鏡ステージの使用は人、まだ温度制御のために必須ではありません。熱応力が行われた場合、インキュベーションボックスの温度を40℃に、 例えば 、実験に使用される最高温度に設定されます。そうでなければ、温度は25に設定されています6; C。温度変化は、撮像時の温度の変化が焦点に影響を与えることができるように、システムが適応できるようにするために事前になされるべきです。
注記：画像化の間、温度は冷却室を使用して制御されます。非ストレス細胞を画像化するための初期温度は23℃です。熱ストレス条件下では、温度を所望のレベルに応じて増加します。冷却室でピエゾ素子は、温度変化に非常に迅速に対応することができます。しかし、画像の焦点は、（それが温度変化に応じて、最大で20μmであることが逸脱する可能性が）わずかに変化します。使用顕微鏡は、ハードウェアのオートフォーカスが装備されていない限り、このようにマニュアルリフォーカスは、画像取得の最初の数分以内に必要とされます。

1. 非ストレス条件下での画像取得
   1. 23℃での非ストレス条件下での画像セルは、ビューの6分野（のFOV）の最小値を取得します。
      注：非ストレス条件はvisualizすることができます短い時間経過（5月30日分）又は代表静止画の取得を記録することにより、いずれかのエド。各条件または細胞株の場合はビューの6分野（のFOV）の最小値を取得します。
      注：個々の細胞が関心がある場合には、FOVの中央に各セルを配置し、中央に目的の細胞を含むFOVと3×3のタイルのシリーズを記録D.。 discoideumの細胞は運動性であり、FOVの外に移動することがあります。しかし、3×3のタイルシリーズは、潜在的に、目的の細胞によって探求面積を増加させ、それは〜6時間の時間経過期間の追跡可能のまま。
   2. セルの全体積をキャプチャするために1から0.25ミクロンのステップで最大7ミクロンのzスタックを取得します。
   3. 細胞の総数を評価するための基準明視野像を取得します。
2. 熱ストレスのための画像取得
   1. 製造者の指示に従って30℃まで冷却室の温度を調整します。
   2. 温度表示が所望の値に達した後、明視野チャンネルに手動で再集束し、時間経過を開始する前に、すべての記録のFOVをご確認ください。
   3. 時点間の5〜10分の時間間隔で熱ストレスの4時間の時間経過を開始します。最初の2つの時点の取得中に焦点を当て、正しいかどうかを確認します。
3. 回復中の画像取得
   1. 熱ストレスの後、戻って23℃まで温度を下げ、調整して、手動で再び焦点を合わせるために温度表示を待ちます。
   2. 10-20分の時間間隔で8-10時間の回復期に記録しタイムラプスムービー。最初の時点の取得中に焦点を当て、正しいかどうかを確認します。

3.画像解析

注：細胞質の病巣を保有する細胞の数を定量化するためには、各時間における細胞の総数および細胞質病巣を有する細胞の数を評価しますフレーム。明視野画像から細胞を分割することの難しさを、定量化を手動で実行する必要があります。以下では、データ分析は、フリーの画像処理パッケージ（（http://fiji.sc/Fiji）について記載されている。それは、「セルカウンター」（http://fiji.sc/Cell_Counter）プラグインが必要です。

1. 細胞の総数を評価
   1. 「ファイル」と「開く」をクリックすることにより、明視野画像スタック（XYT）をロードします。
   2. 「セルカウンター」プラグイン（ - "セルカウンター」「プラグイン」）を開きます。 「初期化」をクリックすることで、画像スタックをロードします。
   3. 適切なボックスを刻むことにより、カウンタの適切なタイプを選択します。
      注：全細胞の数および細胞質病巣を有する細胞のためのカウンタとしてタイプ2用のカウンタとして使用するタイプ1。すべてのセルを数えます。
   4. 「保存マーカー」をクリックしてマーカーを保存します。
2. 細胞質の病巣を有する細胞の数を評価します
   1. 蛍光画像hyperstack（XZYT）（「ファイル」 - 「開く」）をロードし、「Z-プロジェクター」（画像/スタック）を使用して、最大値投影を行います。
   2. 「セルカウンター」プラグインを開きます。 「初期化」をクリックすることにより、得られた画像スタック（XYT）をロードします。
   3. 「ロード・マーカー」をクリックしてマーカーをロードします。
      注意：参照画像と蛍光スタックのファイル名が同一である必要があります。必要に応じて、画像スタックを初期化する前にそれに応じて変更します。
   4. 適切なマーカーの種類を選択します（3.1.3を参照）および細胞質病巣で細胞を数えます。既存のマーカーは個々の細胞の位置のためのガイダンスとして使用することができます。
   5. 「結果」をクリックすることで、スライスあたりのカウント数を取得し、さらに計算のために他の場所でカウントを保存します。

結果

記載の撮像プロトコルは、アメーバD.で凝集しやすいプリオン様タンパク質の挙動を分析するために使用することができます熱ストレス中discoideumの 。 図1は、30℃（ 図1B）での熱ストレスの2時間後ストレス回復の6時間後に、通常の増殖条件（ 図1A）の下での細胞中のGFPタグ付きポリグルタミンタンパクQ103の分布を示して通常の成長条件（ 図1C）での成長。 30℃〜23℃の温度上昇時には、Q103-GFPマーカーは、点状構造に拡散分布から合体します。常温で応力解放と成長すると、これらの構造が溶解します。 Q103-GFPの再分配および熱ストレスによって誘導される細胞質ゾル病巣の形成は、画像解析を用いて定量することができる。 図2Aは、フィジー、プラグイン「Cを使用して、個々のFOVの分析を示しますエルカウンター」。 図2Bは、熱ストレス応答の定量化を示す。これは継続的な熱ストレスとの数の細胞質ゾルQ103-GFP病巣の増加が。熱ストレス時には、タンパク質の品質管理（PQC）システムは、このようにaggregation-、圧倒されていることを示していますこのようなプリオン様タンパク質Q103としてやすいタンパク質がサイトゾル病巣ますます集合溶解状態に維持することができない。細胞はまた、特徴的な丸めを示し、 図1Bに示すように、応力除去後のサイトゾル病巣の減少は、凝集していることを示唆していますタンパク質が溶解されています。

結像品質は、最初の細胞密度に敏感である。 図3は、適切な初期細胞密度（ 図3A）と高い初期細胞密度（ 図3B）を比較して、ストレス回復後の細胞の一例を示しています。初期細胞密度が高すぎる場合、細胞の星テッド図3bに示すようにストリームを形成します。細胞などのその後の定量化に困難を課しているこれは、焦点面の外に移動しました。

記載された方法は、上述したように温度による変化を監視するために使用することができます。生理的な成長温度で撮影。 図4は、空調室内の温度制御なしで撮像された冷却室（ 図4A）で、23℃で撮像された細胞の比較および細胞を示しているときにセット、光毒性を低減するためにも使用することができます25°C（ 図4B）へ。励起光に対する一定の曝露の際に、細胞は、温度制御された条件下で撮像されていないときに切り上げます。細胞の形状の変化は、ストレスを示しています。

図1： D.で表現されていますdiscoideumの細胞（反転グレースケールルックアップテーブルに示されたGFPシグナル）。 （A）は 23℃で通常の増殖条件下で、Q103-GFPは、拡散細胞質に分布しています。 （B）30℃での熱ストレスの2時間後、Q103-GFPは細胞質ゾル病巣（赤い矢印）に合体します。細胞は特徴的な形状変化を示し、切り上げます。 23℃での応力解放及び成長時（C）は 、サイトゾル病巣が溶解します。 6時間後、何のサイトゾル病巣は観察されないことができます。スケールバー=10μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2： 熱誘導サイトゾル病巣形成の定量無料の画像処理パッケージフィジーとプラグインの「セルカウンター」を使用して、細胞の（A）の分析。細胞（1型、ブルーカウンターマーカー）の合計量は、明視野画像において決定されます。マーカーは、GFPチャネルにロードされ、細胞質のフォーカス（タイプ2、赤カウンタマーカー）を有する細胞の数が決定されます。 （B）30℃での熱ストレスの3時間および23℃での応力回復の3時間（N =ビュー、エラーバー= SDの4分野）後病巣の定量。 このの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。

グラム>図3： 長期的タイムラプスイメージング上の細胞密度の影響初期細胞密度<10 ⁵細胞/ mlで撮像された（A）細胞。 30℃での熱ストレスの3時間および23℃でのストレス回復の6時間後、細胞はまだ栄養サイクルと分裂に残ります。ごく少数の細胞が焦点面を終了します。 （B）細胞は、初期細胞密度> 10 ⁶細胞/ mlで画像化しました。イメージング（Aのように設定）の9時間後、細胞は、発達サイクルに入り、ストリーミングと集約開始しました。凝集体中の細胞を明確に区別することはできません。細胞の大部分は、焦点面から出て、分析することができません。スケールバー=10μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図4： 光毒性効果に対する温度制御の効果 23℃の温度制御で10分間撮像された（A）細胞：6視野、zスタック（0.5μM間隔、試料の厚さ8μM）、時間経過（総時間10分経過し1分）、GFPチャンネル（0.07ミリ秒の露光時間、10％のレーザ強度）、RFPチャネル（0.1ミリ秒の露光時間、10％のレーザ強度）。細胞は光毒性ストレスに関連する特徴的な形態学的変化の兆候を示しません。温度制御せずに10分間画像形成された（B）細胞（Aと同じ条件）。細胞はストレスを示す、光毒性誘発される丸めの兆候を示します。 =10μmのスケールバー。細胞は、100×/ 1.4の開口数（NA）を目的とした顕微鏡に基づいて、システム上で画像化しました。画像は、1×1ビニングを用いて1,024×1024ピクセルファイルとしてCCDカメラを用いて収集しました。4large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、熱誘発ストレスに応答して、目的の特定のタンパク質の挙動を研究するために使用することができます。 30°DのCは、熱ストレス応答を誘発することが報告されており、これらの条件下で生存能力の温度上昇discoideumのが著しく低減されます。

修正
プロトコルは、同じストレス条件下で異なるタンパク質の挙動を比較するために修飾することができます。このため、同一の蛍光タグを有する異なるタンパク質を発現する細胞は、四室皿（セクション1.3.1）のように、マルチウェルディッシュに移します。プロトコルはまた、GFPまたはRFPなどの異なるマーカーを有するタンパク質を同時発現する細胞に適用することができます。これは、タンパク質の品質管理（PQC）システムのさまざまなコンポーネントの動作を監視するために使用される例であることができます。 GFPタグ付き凝集マーカーおよび異なるRFPタグPCQ成分を発現する細胞は、マルチウエルを用いて観察することができイメージングのために皿。これは、同じストレス条件（温度上昇/低下の速度、温度上昇/低下の持続時間）を保証し、比較研究が可能になります。

また、プロトコルは、熱ストレス応答のPQCシステムの影響を研究するために使用することができます。成分の活性は、ノックアウトまたは過剰発現などの遺伝子ツールを使用して、発現レベルを変化させることによって、または市販の特異的阻害剤^6を使用することによって調節することができます。プロテアソームは、増殖培地にMG132（100μM）またはラクタシスチン（10μM）を添加することにより抑制することができます。シャペロンHsp90は、ゲルダナマイシン（6μM）またはラディシコール（10μM）を用いて阻害することができます。我々はこれまでの我々の実験設定で、阻害の有効性を確認することができませんでしたが、シャペロンHsp70が、VER-155088に抑制することができます。阻害剤は、イメージングの前に一日を追加する必要があり、細胞を14時間インキュベートします。

Critiプロトコル内のCALのステップ
熱による摂動を評価するための重要なステップは、イメージング実験に先立って、細胞の状態です。酵母での研究は、細胞が定常期¹³の間に環境ストレスの様々な耐性を獲得することを示しました。 D.あれば我々はまた、かかる熱応力を最小限の応答性を観察しましたdiscoideumの細胞は、イメージング前に定常期に達しました。したがって、一定の細胞数<5×10 ⁵細胞/ mlを維持することが重要です。

また、高い細胞数はDの栄養サイクルからの移行を誘導することができますこのようにストレスを加熱するために異なる応答につながるかもしれない飢餓経路を、トリガ、発達サイクルにdiscoideumの 。高い細胞数は、熱ストレス、ストリーミング後の回復期に到達すると、細胞が焦点から外れるように凝集細胞は、データ分析を妨害し得る場合（ 図4参照）。

コンテンツ ">テクニックの制限
焦点の損失は、プロトコルのボトルネックです。温度変化の間、焦点面はすぐに温度を変更した後の時間の手動再収束を必要とする、大幅に移行することができます。焦点のジャンプは時々時点間の時間が長い場合は特に、ソフトウェアのオートフォーカスにより克服することにはあまりにも極端なことができます。使用される顕微鏡は、ハードウェアオートフォーカスが装備されている場合は、このボトルネックを回避することができます。

既存の方法に関して技術の意義
このような目標や顕微鏡ステージや温度制御ステージと客観襟をカバーするエアコン付きの客室、温度制御インキュベーションボックスの使用など、既存のセットアップと比較して、冷却室の使用は、周囲のより正確な制御を提供します温度。冷却室でのペルチェ素子は、一定かつ均一テムを維持することができます実験を通してたは温度。古典的なセットアップでは、局所的な温度差は、異なる観測成果につながる可能性があります。古典的なセットアップは、特に温度を下げ、誘導された温度変化に非常にゆっくりと適応しながら、また、それは、温度誘導性の変化に迅速かつ迅速に対応することができます。冷却室でペルチェ素子はまた、15℃または40℃のような温度に到達すると、古典的なセットアップよりも広い温度範囲（15〜40°C）を覆うことができることは非常に困難です。

細胞性粘菌は、光毒性に特に敏感です。以前の研究では、光毒性を低減するために捕捉剤としてアスコルビン酸を使用します。しかし、長い撮影期間は追加の補充を必要とします。また、アスコルビン酸の使用が関心のメカニズムは抗酸化サプリメントの影響を受けていない研究に限定されています。我々は、温度制御されたイメージング代替APPRとして使用できることを提案しますoachは、光毒性を最小限にし、さらに、毒性を減少させるために、アスコルビン酸の添加と組み合わせることができます。

光毒性効果は、冷却室を使用して23℃の一定かつ均一な温度を提供することによって最小限に抑えることができます。温度制御を使用して画像化する細胞は、より長い期間のための光毒性は、そのような細胞の丸みの少ない徴候を示します。これはまた、より高い強度、より小さな時間間隔またはビュー（FOVの）の複数のフィールドでイメージングを可能にします。

一般的適用
高温での熱応力は、異なる熱ストレス応答^14を誘発することが示されています。従って、34℃又は37℃に温度を上げると、異なる応答を誘導する可能性があります。適用温度ストレスに加えて、特定のストレス状態の持続時間は、応力を加熱するため、即時応答または長期適応を研究するために修飾することができます。

一般に、記載されたプロトコルをすることができますアプリケーションの広いセットに拡大しました。正確な温度制御がかなり光毒性効果を減少するため、プロトコルは、高い露光時間および/またはより高い励起光強度を必要とする設定などで、低い発現レベルでタンパク質を可視化するために、または短い時間間隔と組み合わせて使用することができますタイムラプスイメージングの間、 例えば 、イメージングの間。これらの設定は、光のzセクションの多数を必要とすることも、セル全体にわたるイメージング・オブジェクト、 例えば 、微小管のために有利であり得ます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AXミディア	フォーミディアム	AXM0102
LoFloミディア	フォーミディアム	LF1001
MG132	グマ	C2211
クタシスチン	シグマ	L6785
ダナマイシン	サンタクルス	sc-200617
ジコール	サンタクルス	sc-200620
マットテックディッシュ35ミリメートル	株式会社マットテック	P35G-1.5-14-C	ガラス底イメージングディッシュ
セルヴィール細胞培養ディッシュ	グライナー	627870	4段ガラス底イメージングディッシュ
サーマルステージヒーター/クーラーインサート	ワーナー研究所	TB-3/CCD
バイポーラ温度調節器	ワーナー研究所	CL-100
液体冷却システム	ワーナー計器	LCS-1