方法論記事

ろ過水のサンプルおよび環境DNAの抽出のためのフィルターカートリッジの使用

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DOI：

10.3791/54741

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2016年11月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ecology and Environmental Sciences, Natural History Museum and Institute, Chiba, 2Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 3Faculty of Science and Technology, Ryukoku University, 4Okinawa Churashima Research Center, 5Graduate School of Simulation Studies, University of Hyogo

この記事について

サマリー

私たちは、フィルターカートリッジによる水サンプルのろ過と、フィルターを取り外すためにハウジングを切り開くことなく環境DNA(eDNA)を抽出するためのプロトコルを記述します。このプロトコルは、魚由来のeDNAをメタバーコード化するために開発されましたが、他の生物由来のeDNAにも適用できます。

要約

最近の研究では、魚からの環境DNA（eDNA）の使用が非侵襲的な監視ツールとして適切であることが示されました。これらの研究のほとんどは、水サンプルから環境DNAを収集するためにディスクファイバーフィルターを使用していましたが、水生環境での多くの微生物研究では、カートリッジが大量の水を収容し、全体的に使いやすいという利点があるため、フィルターカートリッジが採用されています。ここでは、フィルターカートリッジを使用して水サンプルをろ過し、ハウジングを切り開くことなくフィルターからeDNAを抽出するためのプロトコルを提供します。このプロトコルの主な部分は、1)水サンプルのろ過(水量≤4 Lまたは>4 L)のろ過で構成されています。(2)予熱したインキュベーターに入れたローラーシェーカーを使用して、フィルター上のDNAを抽出します。(3)市販のキットを使用したDNAの精製。このプロトコルと以前に使用されたプロトコルを使用して、既知の種組成を持つ巨大な水槽(7,500 m3)から採取したeDNAのメタバーコーディング分析を行い、代表的な結果として2つのプロトコルからライブラリごとに検出された種数を示します。このプロトコルは、魚由来のeDNAをメタバーコーディングするために開発されましたが、他の生物由来のeDNAにも適用できます。

概要

水生環境における環境DNA（エドナ）は水柱で見つかった遺伝物質を指します。最近の研究では、池1-3、河川4-8を含む様々な水生環境から魚を検出するためのエドナの有用性を実証した9ストリーム 、および海水10-14。いくつかの最近の研究では、地元の魚のコミュニティ7,9で複数種の同時検出を試みながら、これらの研究のほとんどは、単一または侵襲1,4-6,8,14と希少または絶滅危惧種3,9数の検出に焦点を当て12,13,15とメソコスム11,12。

後者のアプローチは、「metabarcoding」と呼ばれ、エドナのmetabarcodingは分類学的に多様なサンプル全体で遺伝子領域をcoamplifyするためのPCRプライマーの一つまたは複数のセットを使用しています。これは、インデックス作成とアダプタを添加したライブラリの準備が続いている、してインデックスを作成ライブラリーは、ハイスループット並列配列決定により分析されていますプラットフォーム。最近宮ら 12は、（「MiFish」と呼ばれる）魚類からエドナをmetabarcodingためのユニバーサルPCRプライマーを開発しました。 MiFishプライマーは、いくつかの密接に関連した同族体を除き分類学上の科、属および種に魚を識別するのに十分な情報が含まれているミトコンドリア12S rRNA遺伝子（163から185塩基対）の超可変領域を標的とします。エドナのmetabarcodingにおけるそれらのプライマーを用いることで、宮ら 12は、水槽の近くに既知の種組成やサンゴ礁と水槽タンクから230以上の亜熱帯海洋生物種を検出しました。

魚類からエドナ濃度のさまざまなレベルでの天然海水を収容するためにmetabarcodingプロトコルを最適化しながら、我々はMiFishプライマーは、時折、その後のライブラリーの調製のための標的領域を増幅するために失敗したことに気づきました。この失敗したPCR増幅のための可能性が高い理由の一つは、TEの十分な量の欠如でありますろ過された水の小容積に含まれるmplate DNA（ すなわち、1-2 L）。特定の分類群からエドナ濃度が増幅前に不可知であるが、大規模な水の体積（> 1-2 L）のろ過のような、希少魚の豊富さとバイオマスと水環境からより多くのエドナを収集するためのシンプルで効果的な手段であろうオープン海や深海の生態系。

従来魚エドナ研究16の数で使用されるディスクファイバーフィルターに対して、フィルタカートリッジ17を詰まらせる前に、より大きな水容積を収容するという利点を有します。実際、最近の研究は、大容量（> 20 L）は、フィルタカートリッジ18を使用して、沿岸海水サンプルのろ過を示しました。さらに、それらは、個別に包装され、滅菌、および実験ワークフローのいくつかのステップは、このように研究室19からの汚染の可能性を低減する、フィルターハウジング内で行うことが可能とされています。後者特徴は、最大の実験は20,21に挑戦間で汚染の危険性が残っているエドナのmetabarcoding、のために重要です。フィルタカートリッジのこれらの技術的な利点にもかかわらず、それは2つの例外8,15と魚類のエドナ研究で使用されていません。

ここでは、筐体を開くカットすることなく、そのフィルタからエドナのフィルターカートリッジと抽出と水試料の濾過のためのプロトコルを提供します。また、水の体積（≤4Lまたは> 4 L）に応じて、2つの代替水のろ過システムを提供します。私たちの研究グループ12,14,22,23に新たに開発されたプロトコルの性能とガラス繊維フィルターを使用して、以前に使用されるプロトコルを比較するために、我々は7500メートル3（巨大な水槽から海水のエドナmetabarcoding分析を行います）既知の種組成とし、代表的な結果として、2つのプロトコル由来検出種の数を示しています。このプロトコルの時間魚類からエドナをmetabarcodingために開発されたが、他の生物からもエドナにも適用可能です。

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プロトコル

注:このプロトコルは、水のサンプリングとメタバーコーディングの方法を扱っていません。水は、研究目的に応じて異なる方法でサンプリングすることができ16、Miya et al.図12は、MiFishプライマーを用いたメタバーコーディング法の詳細について。サンプリングされた水は、eDNAの劣化を避けるために、非常に冷たく保ち、数時間以内にろ過する必要があることに注意してください。また、このプロトコルにはロータリーシェーカーとインキュベーターの使用が含まれ、後者は前者を収容するのに十分な大きさでなければならないことに注意してください。また、ろ過後フィルターに残った液体の除去やカートリッジ内で抽出したDNAの回収には、それぞれ15mlと50mlのコニカルチューブを収納できる遠心分離機が不可欠です。

1. スクリューキャップと1Lポリ袋の処理

注:ろ過量が>4 Lの場合は、この手順をスキップしてください。

  1. オスのルアーロックコネクタから突き出たチューブと同じ直径(4.8 mm)のスクリューキャップ(使い捨ての1 Lビニール袋に取り付けられています)の中央に穴を開けます。斜めのペンチを使用して、オスのルアーロックコネクタのチューブを適切な長さ(約3 mm)に短くし、ろ過後にキャップ内の少量の水が詰まらないようにします。
  2. ポリエチレン(PE)とポリプロピレン(PP)に特化した接着接着剤を、オスのルアーロックコネクタとスクリューキャップの底面と表面の両方にそれぞれ塗布します。接着剤の接着が良好になるまで数分待ちます(製造元の指示を参照してください)。
  3. オスのルアーロックコネクタをネジキャップの穴に挿入します。2つのパーツが完全に接着されるまで待ちます(通常は>24時間)。使用前に、オスのルアーロックコネクタでスクリューキャップを10%の市販漂白剤(約0.6%次亜塩素酸ナトリウム)で滅菌してください。
  4. 1 Lビニール袋の底部の2つの角に2つの穴を開けて、メッシュパネルから吊るします(ステップ3)。穴の直径がメッシュパネルのプロングの直径よりも大きいことを確認してください。

2. ろ過システムの組み立て

  1. 高真空チューブをアスピレーターポンプの入力コネクタに取り付け、チューブのもう一方の端をマニホールドに取り付けます。マニホールドの3つの赤いTバルブが「オフ位置」(つまり、水平)にあることを確認してください。
  2. 清潔な手袋を着用し、メスのルアーフィッティングと真空コネクタを真空ゴムチューブの上端と下端にそれぞれ挿入してろ過します。
  3. メスルアーフィッティングをフィルターカートリッジの出口ポートに慎重に取り付け、バキュームコネクタをシリコンストッパーに取り付けます。

3. フィルターカートリッジによる水サンプル(≤4L)のろ過

注:ろ過量が>4 Lの場合は、この手順をスキップしてください。このろ過システムには、1Lの水で満たされたビニール袋を吊るすための自立パネルが必要です。メッシュパネル、複数のプロング、パネル用のスタンドは、すべてオンラインストアから入手でき、このユニットの組み立てに役立ちます。使用前に、フィルターカートリッジの入口と出口のルアーキャップをオートクレーブしてください。

  1. 1Lの水を注ぎますampleビニール袋に水を入れ、オスのルアーロックコネクタでネジキャップを閉じます。
  2. 組み立てたフィルターカートリッジのインレットポートをビニール袋のオスルアーロックコネクタに慎重に接続します。ルアーロックコネクタを締めすぎないでください。そうしないと、ポンピングが開始されるとユニットが漏れます。ビニール袋をメッシュパネルから吊るす前に、すべての接続がしっかりと固定されていることを確認してください。
  3. メッシュパネルの2つのプロングからフィルターカートリッジの入ったビニール袋を慎重に吊るし、マニホールドの入口ポートにシリコンストッパーを挿入します。
  4. アスピレーターの電源を入れます。ろ過のために赤いTバルブを開きます。フィルターカートリッジが乾くまでマニホールドを運転し、次に赤いTバルブをオフの位置に回します。
  5. 必要な量の水がろ過されるまで、3.1〜3.4の手順を繰り返します.
    注:亜熱帯のサンゴ礁から採取した1Lの水の場合、ろ過には約3分かかります。
  6. ビニール袋とバキュームコネクタからフィルターカートリッジを慎重に取り外します。
  7. カートリッジの両端をインレットとアウトレットのルアーキャップでキャップします。
  8. カートリッジとインレットルアーキャップには、速乾性と汚れのないラベリングのために、耐溶剤ペンを使用して適切にラベルを付けます。
  9. DNA抽出前にフィルターカートリッジを-20°Cで保管してください。

4. フィルターカートリッジによる水(>4L)試料のろ過

注:水のろ過量が≤4 Lの場合は、この手順をスキップしてください。このろ過システムには、バルブと使い捨ての10mlピペットチップを備えた10Lのブックボトルが必要です。10 mlピペットチップの内径(15.0 mm)とチップエンドのテーパーは、それぞれバルブの外径(15.0 mm)とフィルターカートリッジの入口ポートに収まる必要があります。両方の接続部は、摩擦ばめでろ過中にしっかりと保持されます。ピペットチップを10%の市販の漂白剤(ca. 0.6%次亜塩素酸ナトリウム)の使用前に。

  1. ブックボトルに適量のサンプリング水を準備します。10mlのピペットチップを10Lのブックボトルのバルブにしっかりと挿入します。
  2. フィルターカートリッジの出口ポートをピペットの先端にしっかりと挿入し、シリコンストッパーをマニホールドの入口ポートに挿入します。アスピレーターの電源を入れます。ろ過のために赤いTバルブを開きます。フィルターカートリッジが乾くまでマニホールドを動かし、次に赤いTバルブをオフの位置に回します
    注:亜熱帯のサンゴ礁から採取した10Lの海水の場合、ろ過には約30〜40分かかります。
  3. ビニール袋とバキュームコネクタからフィルターカートリッジを慎重に取り外します。カートリッジの両端をインレットとアウトレットのルアーキャップでキャップします。カートリッジとインレットルアーキャップには、速乾性と汚れのないラベリングのために、耐溶剤ペンを使用して適切にラベルを付けます。DNA抽出前にフィルターカートリッジを-20°Cで保管してください。

5. フィルターからの環境DNAの抽出

注:ステップ4と5では、主にキットによって提供される「核血」のプロトコルに従って、市販のキットを使用します。簡単にするために、個々のカートリッジを処理する手順について説明します。実際には、一度に8つ(または遠心分離機の最大数)以下のフィルターを処理することをお勧めします。

  1. インキュベーターを56°Cに予熱します。
  2. チューブからヒンジ付きキャップを切り取って2.0mlのチューブを準備します。キャップを捨てます.
    注:このチューブは、フィルターに残っている液体の収集チューブとして使用されます。
  3. インレット(アウトレットではない)ルアーキャップをフィルターカートリッジから取り外し、インレットポートをコレクションチューブに挿入します。カートリッジと収集チューブの間の接続部をセルフシールフィルムを使用してしっかりとシールします。
  4. 組み合わせたユニットを15mlのコニカルチューブ用の遠心分離アダプターに挿入します。カートリッジを5,000 x gで1分間遠心分離し、フィルターに残っている液体を取り除きます。
  5. 収集チューブをフィルターカートリッジから取り外し、チューブを廃棄します。カートリッジのインレットポートを再度キャップします。
  6. 20 μl の Proteinase-K 溶液、220 μl の PBS (リン酸緩衝生理食塩水、キットには付属していません)、および 200 μl の緩衝液 AL.
    の混合物を準備します 注:フィルターカートリッジは、混合物の最大4倍の容量(約1.8ml)に対応します。
  7. インレットキャップを取り外し、ピペットチップを使用して混合物(440μl)をフィルターカートリッジに加えます。ピペットをインレットポートに完全に挿入して、ピペットチップがメンブレンのすぐ上のカートリッジ内に見えるようにします。
  8. インレットポートを再度キャップし、フィルターカートリッジをロータリーシェーカーに置きます。
  9. ロータリーシェーカーを予熱したインキュベーターに56°Cで置き、シェーカーを20rpmの速度で20分間オンにします。
  10. インキュベーション中に、新しい2.0 mlチューブを準備し、耐溶剤ペンを使用してチューブに適切にラベルを付け、50 mlの円錐形チューブに入れます><。 注:前者(2.0 ml)と後者(50 ml)のチューブは、それぞれ抽出されたDNAの収集と2.0 mlチューブの保持に使用されます。
  11. インキュベーション後、インレットキャップを取り外し、カートリッジのインレット(アウトレットではない)ポートを50 mlコニカルチューブ内の2.0 mlチューブに挿入します。50mlの円錐形チューブをスクリューキャップで閉じます。
  12. 50 mLのコニカルチューブを5,000 x gで1分間遠心分離し、カートリッジから抽出したDNAを回収します。滅菌した鉗子を使用してフィルターカートリッジと2.0mlチューブを取り外し、チューブにキャップをします。フィルターカートリッジを廃棄します。

6. 抽出したDNAの精製

注:市販キットのマニュアルで指定されている200μlではなく、100μlのバッファーAEでeDNAを溶出します。

  1. 上記ステップ(約440μl)で抽出したDNAに200μlのエタノール(96-100%)を2.0mlチューブで加え、ボルテックスして十分に混合します。
  2. 混合物を2 mLのコレクションチューブに入れたスピンカラムにピペットで移します。5,000 x gで1分間遠心分離します。フロースルーと収集チューブを廃棄します。
  3. スピンカラムを新しい2 mLのコレクションチューブに入れ、500 μLのバッファーAW1を加え、5,000 x gで1分間遠心分離します。
  4. スピンカラムを新しい2 mLのコレクションチューブに入れ、500 μlのバッファーAW2を加え、20,000 x gで3分間遠心分離します。
  5. 新しい1.5 mlチューブ(キットには付属していません)を準備し、防水ペンを使用してチューブに適切にラベルを付け、速乾性と汚れのないラベル付けを行います。スピンカラムを1.5 mLチューブに移します。
  6. スピンカラムメンブレンの中心に100 μlのバッファーAEを添加してDNAを溶出します。室温で1分間インキュベートした後、6,000 x gで1分間遠心分離します。
  7. スピンカラムを捨て、チューブにキャップをします。精製したDNAを-20°Cで保存します。

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結果

抽出したバルクeDNAから魚類のeDNAのみを単離し定量することは技術的に困難です。なぜなら、MiFishプライマーは、鳥類や哺乳類などの一部の非魚類脊椎動物からも、同サイズ（ca. 170 bp）のPCR産物として標的領域を共増幅するためです12。そこで、魚類eDNAの定量を行う代わりに、種組成が既知の水槽から得られたeDNAを用い、2種類の異なるろ過およびDNA抽出法によるMiFishメタバーコーディング解析を行い、各ライブラリで検出された種数を比較します。この簡便な実験は、「代表的な結果」として本プロトコルの実現可能性を示すために設計されたものであり、他の手法に対する優位性を厳密に証明することを目的としたものではありません。

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ディスカッション

水や土壌などの環境サンプルを使用した多くのメタバーコーディング研究では、フィルターカートリッジの濾過後処理は一般に次のとおりです24,25: 1) 手工具 (チューブ カッターまたはペンチ) でハウジングを切断または割る。2)カートリッジからのフィルターの取り外し。3)DNA抽出のためにカミソリの刃でフィルターを細かく切断します。実験室で汚染されやすいこのような面倒で時間のかかる手順を回避するために、広く使用されている安価な市販キットを使用して、フィルターカートリッジのハウジング内でいくつかのDNA抽出方法を試み、eDNAメタバーコード分析から良好な結果が得られて本プロトコルの開発に成功しました(図1)。

本プロトコルにおけるより重要なステップの1つは、予熱されたインキュベーターでロータリーシェーカーを使用することであり、これは、eDNAメタバーコーディング分析におけるその後のライブラリ調製に良好なDNA収量を提供できます。ハウジング内のプロテイナーゼ-K溶液を最適な温度で絶えず撹拌すると、フィルターに捕捉された粒子からのDN...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、科学技術振興機構(JST)のCRESTによる基礎研究の支援を受け、また、日本学術振興会/文部科学省の科学研究費（第26291083号）およびキヤノン財団からの助成金によってM.M.に支援されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備には関与していませんでした。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
メッシュパネルアイリスオーヤマMPP-3060-BE
メタルプロングアイリスオーヤマMR12F
メッシュパネル用スタンドブランド4184-9507ジャパンから販売中
キャップ付き1Lポリ袋柳DP16-TN1000
オス ルアーロックコネクターISIS11620
10ml ピペットチップEppendorf0030 000.765
10 Lの本のびん バルブが付いている1つとして 1-2169-01
Sterivex-HVフィルターミリポアSVHVL10RC全体で「フィルターカートリッジ」として示され、プロトコルで使用されます
オスのルアーフィッティング1つのように1-7379-04
メスのルアーフィッティング1つとして5-1043-14  
インレットルアーキャップISISVRMP6
アウトレットルアーキャップISISVRFP6
高真空チューブAs One6-590-01
真空コネクタAsOne 6-663-02
シリコンストッパーAsOne 1-7650-07
マニホールドAs One2-258-01
吸引器-GAS-11つとして1-7483-21
DNeasy 血液 &ティッシュキット (250)Qiagen69506
PowerWater Sterivex DNA分離キットMO BIO14600-50-NFmsで「オプションキット」と表記
上遠心分離機クボタモデル4000最高速度 6,000 rpm
固定角ロータークボタAT-508C
15mlコニカルチューブ用アダプタークボタ055-1280
RNAlater 安定化溶液サーモフィッシャーサイエンティフィックAM7020
パラフィルムPM992セルフシールフィルム」
アマゾンジャパンから無 アマゾン スクリュー ms卓 「

参考文献

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