方法論記事

ジカウイルス感染細胞培養系と

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DOI：

10.3791/54767

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2016年8月23日

 , 
1Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

この記事について

サマリー

ジカウイルス(ZIKV)は、新たな病原体であり、胎児の発育異常と小頭症に関連しています。効果的な感染性細胞培養システムの確立は、ZIKVの複製研究だけでなく、ワクチンや医薬品の開発にも重要です。この研究では、ZIKVに関連するさまざまなウイルス学的アッセイが示され、議論されています。

要約

ジカウイルス（ZIKV）は、小頭症、眼の欠陥、および成長障害などの胎児の発育異常にリンクされている新興病原体です。 ZIKVは、 フラビウイルス科のRNAウイルスです。 ZIKVは主に蚊によって送信されるだけでなく、胎児の垂直感染への母体だけでなく、性的接触によって広げることができます。現在までに、ウイルスに感染したものを保護するために利用可能な信頼性の高い治療法やワクチンのオプションがありません。再現性のある、効果的なジカウイルス感染細胞培養系の開発はZIKV複製だけでなく、薬物およびワクチン開発の分子メカニズムを研究するために重要です。この点で、ウイルス産生および増殖の分析のために哺乳動物細胞に基づくインビトロジカウイルス培養系内を記述するプロトコルはここで報告されます。ウイルス力価を測定するための細胞単層およびプラークアッセイにジカウイルスによってプラークの形成の詳細が提示されています。ウイルスゲノムの複製動態二本鎖RNAゲノムreplicatory中間体が決定されます。この培養プラットフォームはZikaウイルス増殖の強力な阻害剤として、インターフェロン-α（IFN-α）、IFN-βおよびIFN-γの識別結果としてのサイトカインの小さなセットのライブラリーに対してスクリーニングするために利用されました。要約すると、in vitroでの感染Zikaウイルス培養系と様々なウイルス学的ア ​​ッセイが大きく、さらにウイルスの病原性とウイルスの病原性の進化のメカニズムの解明に研究コミュニティに利益をもたらす可能性を秘めているこの研究で実証されています。抗ウイルスIFN-αは、さらに感染した妊婦を含む高リスク集団におけるジカウイルス感染症の予防、露光後、予防、および治療の選択肢として評価することができます。

概要

ジカウイルス（ZIKV）は、小頭症、貧しい妊娠1,4を成果に関連した重要なヒト病原体です。 ZIKVは、デング熱、西ナイル、セントルイス脳炎ウイルスなどの神経学的欠陥を引き起こす可能性が医学的に関連するフラビウイルスのセットに属します。ウイルス伝播の主なモードに加えて、性行為も5,6報告されている、蚊ベクターネッタイシマカによるものである、と。 ZIKVが原因蚊ベクトルの拡大地理的分布と先天性欠損症との強い相関関係に世界の主要な健康問題となっています。 ZIKVが最初Zika林におけるセンチネルアカゲザルから1947年に単離された、ウガンダ、最初の人間の場合は1952 7,8で報告されました。発熱、発疹、頭痛、結膜炎、および筋肉/関節痛などの軽度の症状を示すZIKVに感染する個人。感染した妊婦は胎児1にZIKVを送信することができます。 ZIKV感染はまた、ギラ ​​ン・バレー症候群、末梢神経自己免疫脱髄障害9に関連しています。

Zikaウイルスゲノムは、長さが約10.8キロベースであるプラスセンス一本鎖RNA分子から成ります。ゲノムの構造は、タンパク質コード領域に隣接する非コード領域（NCR）と、5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCRとして編成されています6。単一のポリタンパク質（3419 AA）はコポリマーおよび翻訳後10より小さなペプチドに切断されている翻訳されています。 5'NCRと3'NCR RNAステム - ループ構造の両方は、ウイルスゲノムの翻訳および複製の開始に重要な役割を果たしています。ゲノムの構造部品はキャプシド、膜およびエンベロープタンパク質で構成されています。非構造タンパク質は、ゲノム複製のために重要です。

現在、Zikaウイルス株は、3つの主要な遺伝子型に分類されます。西アフリカ、東アフリカ、そしてアジア6,10-13。それは、後にさらに12を進化させ西アフリカとアジア、に東アフリカ系統普及ことが提案されています。アジアの遺伝子型は、アメリカの現在の集団発生の原因です。ジカウイルスは、蚊及び哺乳動物細胞の両方において培養することができます。一次皮膚線維芽細胞、未熟樹状細胞、皮質神経前駆細胞、およびベロ細胞がZikaウイルス感染10,14,15を受けやすいです。両方のI型およびII型インターフェロンは、皮膚線維芽細胞15でZIKV成長を抑制することが示されています。この研究の目的は、哺乳動物細胞培養系におけるアジア遺伝子型ZIKAウイルス株PRVABC59の産生およびアッセイのための段階的な詳細なプロトコルを提供し、薬剤開発プラットフォームとしてこの感染培養系の有用性を実証することです。このリソースは大幅にさらに私を解明するZikaウイルスおよび神経学的研究コミュニティに利益をもたらす可能性を秘めていますウイルスの病原性のウイルスの病原性と進化のtsのメカニズム。

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プロトコル

注：作業の流れの模式的な概要を図1に示されています。

1.細胞

  1. ジカウイルスの産生およびウイルス複製サイクルの分析のためのVero細胞を使用してください。
  2. 完全な10％ウシ胎児血清（FBS）を含む増殖培地、2mMのL-グルタミン、ペニシリン（100単位/ ml）、ストレプトマイシン（100単位/ ml）、および10mM HEPESを準備します。
  3. 5％CO 2で37℃で指定の完全増殖培地で培養Vero細胞。

2.ジカウイルスの生産

  1. T-75フラスコ中の0.25％トリプシンを用いて80％の細胞密度でVero細胞を採取し、細胞を数えます。
    1. T-75培養フラスコから培地を吸引し、2mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄します。
    2. 0.25％トリプシンの2ミリリットルを加え、37℃で5分間フラスコをインキュベートします。
    3. トリプシンを不活性化するために、増殖培地を含む血清の8ミリリットルを追加します。上下SUSにピペット保留細胞を15mlチューブに細胞を移すと。
    4. 細胞の10μLを削除し、0.4％トリパンブルーの同量と混合。細胞計数チャンバースライドにプレミックスをロードし、生存細胞は自動細胞カウンターを用いてカウントし得ます。
  2. T-160フラスコに30ミリリットルボリューム7万個の細胞の合計をシード。
  3. 翌日、フラスコ当たり10ミリリットルの無血清培地中でジカウイルス接種物（0.1 MOI 0.01）感染症の適切な多重度を準備します。
  4. T-160フラスコから使用済み培地を外し、新たに調製したウイルス接種（10ミリリットル）を追加します。
  5. 4-6時間、5％CO 2で37℃で接種したフラスコをインキュベートします。静かにすべての時間で横向きにフラスコを傾けることによって、接種物を広げます。
  6. インキュベーションの終了時に、各フラスコのために暖かい血清添加増殖培地（30ml）で接種材料を交換してください。その後、次の96時間のためにウイルス培養を続けます。
  7. での進行を確認します位相差顕微鏡を使用し、40Xおよび200X倍率での必要に応じた画像（ 図2）を取る細胞単層にウイルスプラークの出現を観察することによりフェクション。

figure-protocol-1
図2：様々な倍率のVero細胞の単層上ジカウイルスによって形成されたプラーク明視野画像は48 HPIでZikaウイルスプラークを示します。単分子膜上の丸い細胞病巣の存在に注意してください。 （スケールバー= 50μm）は、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. 収穫細胞培養上清を96時間の時点で、細胞破片を除去し、4℃で10分間、300×gで上清を遠心。
  2. 慎重にペレット化破片や転送トンを乱すことなく上清を除去し15ミリリットルチューブO。 24,000×gで超遠心分離（オプション）は、ウイルス粒子を濃縮するために行うことができます。
  3. -80℃で複数のアリコート中のウイルス培養上清を保管してください。

3.プラークアッセイによってジカウイルスの力価を測定

  1. 12ウェルプレートを使用して、2ミリリットルの体積でウェル当たり1×10 5細胞でシードナイーブVero細胞。
  2. 翌日、無血清培地を使用して、T-160フラスコから採取したウイルス培養上清の10倍連続希釈液を準備します。各ウェルから使用済み培地を取り出して、三重にVero細胞上に準備された接種物の400μlを添加します。
  3. 37で接種したフラスコをインキュベート 4-6時間、5％CO 2とC°。優しくごとに1時間で横向きプレートを傾けることによって接種材料を広げます。
  4. インキュベーションの終わりに、血清添加培地（ウェル当たり2ml）で接種材料を交換してください。
  5. 48時間後の接種では、位相CONTRを用いてウイルス増殖巣を数えますAST顕微鏡。 1ml当たりのプラーク形成単位（P​​FU）のようなウイルス力価を計算します。プラークアッセイのために、図3を参照してください。
  6. 修正プラークの明確な可視化のために20％エタノール中で調製した4％ホルムアルデヒドで細胞を0.1％クリスタルバイオレット溶液を染色します。

4. Zikaウイルスゲノム複製アッセイ

  1. 12ウェルプレートを使用して、2ミリリットルの容量でウェル当たり1×10 5細胞でシードナイーブVero細胞。三重で無血清培地を用いて、低および高力価の、次の日、ウイルス接種物（400μL/ウェル0.01および0.1のMOI）を準備します。モック感染のために、無血清培地（400μL/ウェル）のみを使用します。
  2. 、手順3.4から3.2を繰り返します。
  3. 48および96時間の時点で、RNAおよび免疫細胞化学（ICC）のためのサンプルを収集。
    1. 収穫RNAサンプルについては、各ウェルに直接溶解溶液の400μlを添加し、溶解物を収集し、メディアを削除します。
    2. ICCのために、メディアおよびトンを削除鶏は、各ウェルに1mlのメタノールを添加することにより細胞を固定し、4℃で30分間プレートをインキュベートします。
    3. 細胞溶解物から、製造者の指示に従ってRNA単離キットを用いて全RNAを単離します。分光光度計を用いてRNAを定量化します。
  4. 回収RNAからZIKVゲノムコンテンツを決定するために、二段階逆転写定量的PCR（RT-qPCRの）を実行します。
    1. RNAを逆転写するために、最初の0.2ミリリットルチューブ内で単離されたRNAの5μgの、dNTPの1μL（10 mM）の、および1μlのランダムヘキサマー（250 ngの）から成る13μlの反応ミックスを設定します。 65℃で5分間チューブをインキュベートした後、1分間氷の上に置きます。続いて、逆転写酵素を1μl、5×鎖合成バッファー4μlの、0.1 Mジチオスレイトールの1μlを、反応ミックスにRNase阻害剤の1μlを添加します。 50℃、inactivで60分間、続いて25℃でさらに5分間チューブをインキュベート15分間70℃に加熱することにより反応を食べました。
    2. 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 '：DNAポリメラーゼおよびジカウイルスのための特定の10mM1μlの個々のプライマーについて[ジカウイルスパン-遺伝子型プライマーを（含む2倍の緑色の色素スーパーミックス12.5μlの得られたcDNAの1μLを使用して定量PCRを実行します; REV：5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '）、ジカウイルスアジア遺伝子型PRVABC59株プライマー（5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; REV：5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 '）]、またはC型肝炎ウイルス（JFH RTQ F：5 「CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R：5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3 '）、またはのための細胞のハウスキーピング遺伝子GAPDH（5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3'; REV：5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3 '）、25μlの反応体積です。
    3. リアルタイムPCRシステムでは30秒15秒、60°C（40サイクル）の実行条件95°Cを用いてPCRを行います。
    4. Zを正規化するために、サイクル閾値（Ct）値に基づいて、GAPDH発現レベルを使用ウイルスゲノムの測定IKA。 GAPDHのそれと比較しZikaゲノムのデルタCT（のΔCt）値を計算し、2 のΔCt値を得ます。そして、指示された時点で、感染及び非感染細胞との間の正規化されたZikaゲノムコンテンツの比率を取ることによって、倍率変化を計算します。 ZIKVゲノムの複製の結果については、 図4を参照してください。
  5. メタノール固定した細胞を使用してICCを実行します。
    1. （PBS中0.1％のTriton-X 100、3％ヤギ血清、3％BSA）1×PBSで固定した細胞を3回洗浄し、ICCブロッキング緩衝液でブロックします。
    2. ブロッキング緩衝液中で100と4℃で一晩インキュベート：1の希釈でマウスモノクローナル抗のdsRNA抗体J2（1μg/ ml）を使用してください。
    3. 1×PBSで細胞を洗浄し、1で二次抗体ヤギ抗マウスIgG-594（1μg/ ml）を追加しますブロッキングバッファー1,000希釈し、室温で1時間インキュベートします。
    4. ヘキスト染料を使用して、核のために1×PBSおよび染色で細胞を洗浄し、100Xの倍率で蛍光顕微鏡（ 図4）を用いて細胞を観察します。

5.ジカウイルス感染に対するサイトカインライブラリをスクリーニング

  1. 12ウェルプレートを使用してあたり1×10 5個の細胞をナイーブVero細胞を播種します。細胞は（6時間後に播種）添付されると、生物学的重複で指示された濃度（2ミリリットル容量/ウェル）で各サイトカインを追加します。車両（PBS）単独の対照を含めます。
  2. 12時間後処理では、Zikaウイルス感染（ウェル当たり400μlの0.1のMOI）を行います。感染症（モック）なしの陰性対照ウェルを含めます。
  3. 4時間後の感染では、サイトカイン処理されたメディア（2ミリリットル）とのウイルス接種を交換してください。追加の44時間、37℃で細胞をインキュベートします。
  4. 48時間の感染後に、位相差顕微鏡を用いてウイルスプラークをカウントし、40倍の倍率（ 図5）で感染させた細胞の代表的な画像を取得します。

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結果

Zikaウイルス株（PRVABC59; GenBank登録番号KU501215）アジア遺伝子型のは、この研究12で使用しました。 80％コンフルエントでVero細胞をデノボ Zikaウイルス感染を調べるために使用しました。ウイルス産生およびその後のウイルス学的特徴付けのために、初期継代（P3）ジカウイルスを用いました。ウイルスプラークは、感染の二日目に観察されました。最初に感染した細胞から放出さZikaウイルス子孫は、単層培養（ 図2）上に表示斑の形成をもたらし、隣接するセルに分散させることができます。 Zikaウイルス感染の細胞変性効果（CPE）は、このような細胞ならびに溶解性の細胞死の丸めや剥離などの形態学的変化によって特徴付けられます。

ウイルス力価を測定するために、T-160フラスコから回収したウイルスを含有する無細胞上清を、10-FOLに供しましたD段階希釈し、12ウ...

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ディスカッション

ここでは、in vitroでジカウイルスを培養するための合理化されたプロトコルが提示されます。含む、ウイルス培養を拡大するための最適なエンドポイントを識別し、力価を測定し、ゲノムの複製を定量化する重要なステップを提供しました。ジカウイルスは、感染性物質の処理中に、生物学的安全手順が厳密に従うべきであり、人間の病原体である、そう。サル腎臓細胞株、ベロは、様々なウイルス学的アッセイを実証するために使用しました。 Zikaウイルス複製の動態は、様々な組織や種の細胞で異なる場合があります。先に説明したように15の追加の細胞株を使用することができます。ジカウイルスは、感染した胎児3の脳組織から単離された皮質神経前駆細胞14に感染することが示されています。このように、神経細胞にZIKV感染の病態生理を評価するには、追加の細胞特異的な洞察を提供することができます。アフリカやアジアの遺伝子型の神経毒性表現型の違いを調べることができますこの感染培養系を使用して。ここに記載のウイルス製造手順は、非ヒト霊長類またはげっ歯類モデル系におけるin vivo病原性...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

ジカウイルス株のPRVABC59を提供してくださった米国疾病管理予防センター（CDC）のアーロン・ブロー博士とブランディ・ラッセル博士に感謝いたします。この原稿の校正をしてくださったイェール大学のNicholas Ten氏に感謝します。この研究は、V.A.のCedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Awardによって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ダルベッコ修正されたイーグル」シグマライフサイエンスD5796
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red  コーニング25-054-C1
トリパン ブルーステイン 0.4%ライフテクノロジーズ T10282
伯爵夫人 –自動セルカウンターThermoFisher ScientificC10227
Countess-cell counting  chamber slidesThermoFisher ScientificC10283
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000Thermo ScientificNanodrop 2000
マウスモノクローナル抗dsRNA抗体 J2 日本語 &サイエンティフィックコンサルティングKft.
ヤギ 抗ウサギ IgG アレクサ フロー 594ライフ テクノロジーズ A11020
SUPERSCRIPT III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROXLife Technologies11744500
QuantStudio12K Flex リアルタイム PCR システムThermo Fischer4471088
RNase-Free DNasePromegaM6101
Vero Cell Line ATCCCCL-81
ジカウイルス株 PRVABC59CDC(CDC)
IL-6Peprotech200-06             
IL-1アルファ       ペプロテック200-01A          
TNF-αペプロテック300-01A          
インターフェロンαA  R&D Systems11100-1
インターフェロンベータPeprotech300-02BC
インターフェロンガンマPeprotech300-02
遠心分離機 5415Rエッペンドルフ5415R
遠心分離機 5810Rエッペンドルフ5810R
ニコン エクリプス Ti 免疫蛍光顕微鏡 ニコン インテンスライト C-HGFIニコン訪問ニコン リクエスト
10010200

参考文献

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