方法論記事

干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）によってF-アクチンフィラメントの三次元超解像顕微鏡

DOI：

10.3791/54774

⸱

2016年12月1日

 , 
1Department of Biology, South University of Science and Technology of China, Shenzhen, 2Mechanobiology Institute, Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore

この記事について

サマリー

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私たちは、接着性、哺乳動物細胞におけるアクチン細胞骨格のイメージングに、干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）、3次元の単一分子の局在超解像顕微鏡法の適用のためのプロトコルを提示します。このアプローチは、そうでなければ、従来の回折限界光学顕微鏡で未解決のままであるナノスケールの構造的特徴の光ベースの可視化を可能にします。

要約

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蛍光顕微鏡は、細胞内の特定の生体分子の直接可視化を可能にします。しかし、従来の蛍光顕微鏡法のために、空間分解能は、光軸に沿って像面、> 500nmの範囲内〜200nmの回折により制限されています。結果として、蛍光顕微鏡法は、長い細胞内の超微細構造の特徴の観察に厳しく制限されています。超解像顕微鏡法の最近の開発は、この制限を克服しました。特に、photoswitchable蛍光体の出現は、分子長さスケールに近づいて解像力を提供ローカリゼーションベースの超解像顕微鏡を、可能にします。ここでは、干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）と呼ばれる単一分子の局在顕微鏡法および多相干渉に基づいて3次元超解像顕微鏡法の適用を説明します。この方法は、上のほぼ等方性の解像度を提供しますすべての3つの次元で20nmのオーダー。 iPALM機器の試料調製及び動作を含む、繊維状アクチン細胞骨格を可視化するためのプロトコルは、ここに記載されています。これらのプロトコルはまた、細胞内の他の超微細構造の特徴の研究に容易に適合し、有益です。

概要

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複雑な細胞構造の可視化は、長い生物学的洞察と発見に不可欠となっています。蛍光顕微鏡は、高分子特異性を有する画像セルは、その分解能は〜像面（X、Y、または横寸法）で200 nmの光軸（Z、または軸方向の寸法）に沿って、> 500nmの回折によって制限されることができるが1,2。したがって、超微細な特徴の観察は、歴史的に、電子顕微鏡（EM）に限られていました。 100 nmの範囲1-6 -幸いなことに、超解像顕微鏡の最近の開発は、10の空間分解能を可能にする、この制限を回避しています。具体的には、超解像は、このようなPALM（光活性化ローカライゼーション顕微鏡）4、FPALM（蛍光光活性化ローカライゼーション顕微鏡）5（d）にSTORM（直接確率的光学再構築顕微鏡）などの頭字語によって知られている単一分子の局在化に基づくアプローチ6,7、PAINT（ポー川int型イメージングナノスケールの地形のための蓄積）8、GSDIM（基底状態枯渇顕微鏡は、個々の分子のリターンが続く）9、またはSMACM（単一分子アクティブ制御顕微鏡）10、ならびに、それらの3次元（3D）の実装、干渉PALM（iPALM）11または3D-STORM 12、神経細胞の軸索とシナプス13を含む多数の生物学的構造のナノスケールの組織に新たな洞察を明らかに貴重なされている、接着斑14,15、細胞間結合16、核膜孔17 、および中心体18-20は 、いくつかの名前を付けます。

超解像顕微鏡は、潜在的に有用であるために、細胞内の別の超微細構造の特徴は、アクチン細胞骨格です。細胞表層における糸状（F）アクチンの複雑な網目構造は、細胞の形状及び機械的特性21の制御において重要な役割を果たしています。組織OF F-アクチンは、積極的かつ動的に強く重合、架橋、売上高、安定性、およびネットワークトポロジー22に影響を与える多数の調節タンパク質も規制されています。 F-アクチン網目構造のキャラクタリゼーションは、細胞プロセスの多様な範囲に機械的な洞察のために重要であるものの、F-アクチンフィラメントの小さいサイズ（〜8 nm）は、従来の回折限界光学顕微鏡によって自分の観察を妨げます。従って、アクチン微細構造の可視化は、これまでもっぱらEMによって実行されています。ここでは、3D 11,23における非常に高精度の能力を活用するiPALM超分解能顕微鏡技術を用いて、接着性哺乳動物細胞におけるF-アクチン細胞骨格を可視化するためのプロトコルを説明します。 iPALM機器は専門性の高いですがiPALM顕微鏡へのアクセスはホーによってホストされている一方で、このような機器の設定に関する指示は、23最近記載されています病棟・ヒューズ医学研究所はまた、最小限のコストとの研究コミュニティに利用可能とされています。さらに、本明細書に記載の試料調製方法は、より広範に利用可能であるような点広がり関数（PSF）の非点収差のデフォーカスに基づくものなどの代替的な3D超解像手法、12又はバイプレーン検出24、に直接適用可能です。

私たちは、一般的には単一分子の局在化ベースの超解像顕微鏡のために必要な成分が満たされなければ、単一分子の局在化ベースの超解像顕微鏡のための3つの重要な要件を可能にするphotoswitchableフォア25、であることに注意した：i）高単一分子背景信号の明るさとコントラストの相対。 ⅱ）所与の画像フレーム内の単一分子のまばらな分布。また、ナイキスト・沙として知られている根本的な構造（のプロファイルをキャプチャするのに十分な標識及びiii）高い空間密度nnonサンプリング基準）26。このように、満足のいく結果を得るために、重点はフルオロフォアphotoswitchingを最適化するために、基礎となる超微細構造を維持するための試験片の適切な準備の両方で、同様の実験の計測および買収側面に均等に配置する必要があります。

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プロトコル

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1.イメージング試料の準備

  1. ので、バックグラウンド蛍光信号が最初に脱イオン水（のddH 2 O）でそれらをすすぎ、次いで圧縮空気を使用して空気乾燥させてカバーガラスを清掃し、フルオロフォア標識からの蛍光を妨害します。その後、15秒間プラズマクリーナープラズマエッチングを行う、または必要に応じてより長いです。
  2. ドリフト補正とiPALMキャリブレーションを有効にするには、信頼性の高いキャリブレーションおよびドリフト補正用として非常に光安定の基準点を提供する基準マーク、などの蛍光ナノ粒子を埋め込んだ＃1.5ラウンド（22-mmの直径）予備洗浄カバーガラスを使用しています。十分な蛍光体密度蓄積するために必要な長い取得時間に（> 15から30分）、サンプルドリフトは避けられません。
  3. 6ウェル組織培養プレートに、各fiducialedカバーガラスを配置します。 15分間の層流フード内で、紫外線（UV）照射によって、それらを殺菌します。
  4. 無菌層流フードでは、線維を準備10μg/ mlの - 最終濃度2に無菌のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）中で1mg / mlのフィブロネクチンのストック溶液を希釈することにより、カバーガラスのコーティングのためのネクチン液。それぞれのDPBSで三回カバーガラスリンスし、4℃で一晩フィブロネクチン溶液2mlでインキュベートします。その後、フィブロネクチン液を吸引し、DPBSで一度すすいでください。
  5. DPBSで簡単に細胞を洗い流します。細胞を切り離し、新鮮な血清含有細胞培養培地〜10mlでクエンチされるまで、37℃で数分間トリプシン2mlの - 1でインキュベートします。例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）は、大血管内皮因子及びペニシリン又はストレプトマイシンを補充した大血管内皮細胞培養培地を使用します。
    1. フィブロネクチンでコーティングしたカバーガラス（疎密度のため、プレート<カバーガラス当たり50,000細胞）上に細胞をReplateし、湿度95％、5％CO 2、および37＆＃に設定したインキュベーターに文化を維持176; C。
  6. F-アクチン細胞骨格の微細構造の適切な保存のため、グッド緩衝剤27に基づいて、緩衝液を使用しています。
    1. 例えば、EGTAを3.8g HEPESを6.5gを溶解させて2×ストック溶液（120mMのパイプ、50mMのHEPES、20mMのEGTA、4mMのMgCl 2を、KOHでpH 7.0）としてPHEM緩衝液を調製し、そして190mgの濃KOH水溶液を滴下することによって7.0に調整したpHを有するのddH 2 O、の〜300ml中のMgCl 2。その後、500ミリリットルにボリュームをもたらすためのddH 2 Oを追加します。 、0.22μmのフィルターを使用してバッファを滅菌4°Cでそれを格納し、それを1希釈する：使用前のddH 2 Oで1。
  7. F-アクチンの高密度標識と最良の結果を得るために、セル再播種後に所望の時点では、このようなアレクサフルオロ647のような有機蛍光色素分子とコンジュゲートファロイジンを使用し、次のように細胞を固定します：
    1. よくCEを含む各培養物から培地を吸引llの標本。穏やかにしかし迅速に0.25％トリトンX-100でPHEM緩衝液中の0.25％グルタルアルデヒドを含有する温かい（37℃）抽出固定剤を2mlを分注します。 2分 - 1、室温で静置します。その後の手順については、固定液の2ミリリットルを使用するか、他に示されない限り、カバーガラスごとにバッファを急冷します。
    2. PHEM緩衝液中の2.5％グルタルアルデヒド固定液で抽出固定液を交換し、サンプルは10インキュベートしましょう - 12分。この、次のステップは全て室温で実施されます。
    3. 吸引し固定液出て、ゆっくりとPHEM緩衝液に置き換えます。チルト旋回優しく、そしてその後PHEMで再び洗います。二回繰り返します。
    4. 希望のフルオロフォアからの信号を圧倒することができ、グルタルアルデヒド、から自家蛍光を消光するには、PHEM中の0.1％の質量濃度でのNaBH 4を含む新たに調製したクエンチング緩衝液を用いて試験片をインキュベートします。多量の気泡が観察されます。時折DISLに優しく試料皿をタップ気泡をodge。 10分 - それは5インキュベートしてみましょう。
    5. クエンチングバッファーアウト吸引し、軽くはPHEM緩衝液と交換してください。気泡を一掃するために数回すすいでください。 PHEM緩衝液2ml中ピペット、それは5分間、暗所でインキュベートしましょう。二回繰り返して行ったときにPHEM緩衝液中の試料の残りをしましょう。
    6. ddH 2 Oの10ミリリットル-惜しみなく5で湿らせたペーパータオルの一片で埋め大型プラスチックシャーレを用いてインキュベーションをファロイジンための湿度室を準備します湿ったペーパータオルの上にきれいなパラフィルムの大きなシートを置きます。
    7. 標識されたファロイジンの比較的高いコストのために、各標識のための小さなボリュームを使用しています。高密度の標識のために、0.3μMの濃度で始まります。 PHEMバッファにファロイジンアレクサフルオロ647を使用してカバーガラス当たり〜60μlのを準備します。
    8. ピペット55 - 湿度チャンバ内のパラフィルムシート上にファロイジン溶液を60μlの。細かい鉗子を使用して、静かに試料covergを削除小娘。正しい細胞含有顔を注意するように注意してください。
    9. 迅速かつ優しく繊細な吸収紙の折り返し片とカバーガラスの縁に触れることによって、過剰なバッファを離れてタップし、[パラフィルム上ファロイジン溶液の液滴の上に下向きにしてカバーガラスセル側に配置します。カバーガラスに捕捉された気泡がないことを確認します。
    10. 湿度室のカバーを置きます。周囲光から保護するためにアルミホイルでチャンバをラップし、試料を4℃で一晩インキュベートしましょう。試料は、数日間、この状態に保つことができます。長期保存が予定されている場合は、湿度室は湿ったままであることを確認してください。
  8. 撮影の前に、静かにウェル当たりPHEM緩衝液の2ミリリットルを含む新たな6ウェルプレート上にアップカバーガラスセル側に配置します。
  9. 1 Mグルコース、1 Mのシステアミン、および100Xグルコースオキシダーゼ/カタラーゼ酵素MIXT次ストック溶液を用いて、酸素捕捉チオールベースのイメージング・バッファを準備URE（カタラーゼの4 mgを、ボルテックスでよく混合PHEM緩衝液100μl、グルコースオキシダーゼの10 mg）を28。右撮像前に、1 Mグルコース溶液75μlを、1 Mシステアミン溶液30μL、および100倍株式酵素混合物の3μLを混合します。 PHEM緩衝液で300μlに音量を調整し、すぐにサンプルをマウントするために混合した後に使用します。
  10. iPALMについては、予め洗浄＃1.5カバーガラス（22 mmの直径）を用いた撮像サンプルを準備します。
    1. 代替的に、非点収差ベースの3D-STORM 12が代わりに使用される場合、アセンブリを補助するために、両面接着スペーサでスライドガラス（3 "×1"）を使用します。
    2. イメージングサンプルを組み立てるには、静かによくバッファから標本カバーガラスを除去するために、微細な鉗子を使用しています。そして、迅速かつ静かに折り畳まれた吸収紙でカバーガラスの縁に触れることによって、過剰なバッファを離れてタップします。
    3. きれいなレンズ紙の上に上向きにカバーガラスセル側に配置します。サンプルをすすぎます30置くことによって - と、サンプル上に結像する緩衝液50μlを傾けると、折り畳まれた吸収紙でタップすることで、過剰なバッファを削除します。
    4. すすぎ工程を数回繰り返し、その後、30置く - サンプル上に結像する緩衝液50μlを。ブロットは、カバーガラスのエッジを乾燥し、乾燥した領域に速硬化エポキシの複数の非常に小さなドットを配置します。
    5. ゆっくりと細胞含有22 mmのカバーガラスの中央に別の予備洗浄＃1.5カバーガラス（プレーン、丸いカバーガラス、18 mmの直径）を下げます。撮像バッファは毛管作用によって両方のカバーガラスを湿らせてください。速硬化エポキシの小さなドットは、両方のカバーガラスに付着する必要があります。
    6. 静かに均等に圧力を分散するために折り畳まれた吸収紙を使用して組み立てたサンプル時に押してください。でも、試料セル薄いと作るために十分な圧力（<15μm）を使用しますが、細胞を破砕するほどではありません。ニュートンリングのパターンを観察することによって、適切な厚さを測ります。また、このSTを実行するようにしてください気泡を最小限に抑えるために穏やかにEP。必要に応じて、事前に空のカバーガラスで数回の練習。
  11. 29（VALAP、100グラムワセリン、ラノリン、パラフィンのそれぞれから調製された株式は、一緒に溶融）溶融ワセリン、ラノリン、パラフィンでサンプルを密封する、のddH 2 Oで密封されたサンプルを洗浄し、圧縮空気でブロー乾燥。サンプルは現在、イメージングのための顕微鏡に取り付けるための準備ができています。

2.サンプルの配置とiPALMアライメント

  1. サンプルホルダーの除去を可能にするために上向きにバネ仕掛けのトップ対物レンズを移動します。試料ホルダー上にステップ1.10で製造した密封された試料を置き、いくつかの小さな希土類磁石で固定します。撮像サンプルの両側に液浸油を適用します。光路に戻って試料ホルダーを置き、そっとトップ対物レンズを下げます。
  2. 励起レーザをオンにします。電子増倍電荷結合素子（EMCをオンにしますフレーム転送モードでCD）カメラ。
    1. 適切な発光フィルターに回転させます。トップビーム経路（ 図1A）をブロックし、ボトムビーム経路を開くために、メカニカルシャッターをアクティブにします。ピエゾアクチュエータを使用して、少しずつ翻訳で焦点に底対物レンズを持参してください。
    2. 基準が焦点になると、ボトムビーム経路を遮断しながら、トップビーム経路を開き、同様の方法で焦点にトップの対物レンズをもたらします。最適なフォーカスのためのコンピュータディスプレイ上の基準の幅を監視します。
  3. 適切なセンタリングのために、上部と下部のビーム経路の両方を開きます。基準画像は、理想的には1画素内、可能な限り厳密に重なっているまで、ボトム目的は、マイクロファインセットネジのペアを使用して一定に保持されている間に手動でトップ対物レンズを調整します。
    1. 続いて、微調整を行うEMCCDピクセルの10分の1以内のステップで基準画像は2.3オーバーラップするように。トップを調整します制御ソフトウェアを介した2軸ピエゾ取り付けられたミラーの両方の対物レンズと底反射を保持しながら、一定のミラー。プロセスを導くために、コンピュータのディスプレイを介してトップの基点と下部目的のビューの中心を比較。

iPALMセットアップの3キャリブレーション

注：蛍光発光がインコヒーレントであるので、iPALMで観察される干渉のために、パスは上部と下部の目標を介して長さ数ミクロンの範囲内で、互いに近接していなければなりません。これは以下のように達成することができます：

  1. 上のレーザ、カメラは連続的にストリーミングし、上下両方のビーム経路が開いた状態で、400nmの大きさを超える連続z軸発振用の制御ソフトウェアによって生成された正弦波電圧波形を用いて試料ホルダーのzピエゾを振動。
  2. 最適なアラインメントのうち、基準強度はTで少し変化するという事実を利用して彼は振動、手動による所望の単一光子干渉効果に基準が振動の強さまで上または下電動式ビームスプリッターアセンブリを翻訳します。これは、光路長の近い一致を意味します。 > 10のピーク-谷比が最適な場合（ 図1D）で達成することができます。
  3. ギャップ及びチルト角度を微調整するために小さなステップでビームスプリッタアセンブリの底面ミラーを調整し、それぞれの面での振幅と位相の両方がフィールド全体で可能な限り均一であることを確認してください。 800 nmの上に8 nmのz軸ステップでサンプルを翻訳することによって、ビームスプリッタファインアライメントを実行します。
    1. 理想的には、カメラ＃2のカメラ＃1相対の発振位相が最大になるように、高さ、位置、及び小さなステップでのビームスプリッタアセンブリ内の下部ミラーの傾きを調整します。3. - カメラ＃1のうち、基準強度を監視します120°（ 図1B-D）で。
    2. 最初の一回アライメントが完了し、近くの画像および複数の基点に、両方の細胞を含むビューの適切なフィールドをスキャンするためにサンプルを翻訳します。迷光と周囲の摂動を阻止するために、システムの周りに囲いを配置します。撮像領域が発見されると、再びステップ3.4の手順を実行し、メインインタフェースで「サンプルピエゾ位置対キャリブレーションスキャンを取得」コマンドを使用して、後続のz座標の抽出に使用するための検量線を記録します。

4.データ集録

  1. 所望の領域が検出された検量線が得られると、ソフトウェアに該当するファイル名を入力します。上部と下部のビーム経路の両方を開きます。最大642 nmのレーザーの励起パワーを増加させます。アレクサフルオロ647は、オフにフルオロフォアの初期期間は、（ 図2A）を必要とすることができます。
    1. SIまで、5分、または必要に応じて長くするための定642 nmの励起で公開します点滅ngle分子は、（ 図2B）が観察されます。ソフトウェアは、取得の過程で405 nmの光活性化の自動増加を可能にします。糸状の特徴がはっきりと見えるようにするための取得枠の多数が通常必要とされている（> 50,000フレーム）。準備ができたら、メインインターフェイスで "スタートiPALM取得」コマンドを使用して、生の画像セットの取得を開始します。
  2. （ 図2Bの例を参照）、必要に応じて取得中に、曲は405 nmのレーザーの強度を調整することによって光活性化のレベルは、適切な点滅密度を維持します。
    注：買収が完了すると、ソフトウェアが自動的に画像ファイルが適切なバイナリ形式に変換されます。計算サーバ内のデータリポジトリは、データが直接、さらなる処理のためにそこにコピーされることを可能にする、ネットワークドライブとしてマウントされています。

5.データ処理そして、分析

  1. すべての単一の分子だけでなく、基準点11,15,23のために最もフィットするパラメータを抽出するためにカスタム開発されたソフトウェアを使用して、ローカライズ分析を実行します。これは、x、y座標だけでなく、較正曲線分析に使用され、強度だけでなく、得られます。
    1. コマンドを使用して、ステップ3.5で取得した生のキャリブレーションデータをインポートし、単一分子の局在を実行するには、「ファイル」メニューの下に「ピークス複数のラベルを抽出します」。初期局在分析を次のカメラ＃1から得られた座標 - 3、それぞれ、赤、緑、および青のチャネルに存在しており、コマンドを使用して、さらなる分析のために保存することができ、「IDLとして加工SAVE（.SAV） ""下ファイル "メニュー。
  2. カメラ＃1からデータをもたらすために-カバースリップ上に埋め込まれた蛍光の基準点を使用して、登録に3、中央の画像（ 例えばのカバレッジを提供するために、いくつかの明るい基準点を選択し、「イメージ変換」メニューの下に「アンカー基準点のポイント」コマンドを使用して、 図1B）。カメラ＃2でレジスタにカメラ＃1と＃3をもたらす回転とスケーリング行列を計算するためにステップ5.1で明るい基準点から得られた3 - 局在化はカメラ＃1から座標のトリプルセットを使用してください。基準点の十分な数で、より高次の多項式の反りがより良いフィットのために行うことができます。
  3. 加算された生データを取得するために一緒に3 - 変換行列が計算されると、カメラ＃1の生データを変換します。 y座標と加算され、生データに各カメラチャンネルの相対的な寄与を決定するために、より正確なXを得るためにローカライズ分析の別のラウンドを行います。 「イメージ変換」メニューの下に "生、保存して保存和（.datファイル）を変換」コマンドを使用します。この強度比は、z座標情報が含まれています。
  4. 明るい基準を選択し、Z-行います「特殊機能」メニューの「Z座標操作」をクリックして、ポップアップダイアログで機能「テスト・ウィンドポイント3D」を使用してフィッティングキャリブレーション。これは、較正曲線を決定するために、3のカメラチャンネルの強度に3正弦波関数をフィットします。キャリブレーションファイルは、メインのデータセットでのさらなる使用のために保存されます。
  5. 検量線の品質をテストするために、先に説明したように23、抽出z座標行います。よく較正されたシステムで行儀の基準点については、z座標は、キャリブレーションデータセットは、z位置でリニアスイープで撮影されているので、直線的に拡張する必要があります。さらに、すべての基準点のz位置は、同様の傾きに合わせて拡張する必要があります。
  6. 満足なキャリブレーションが得られると、ステップ5.1から5.3に概説したものと同じ手順に従って、ステップ4で取得された生の画像データセットの局在化および変換分析を行います。完了したら、ステップ5からのキャリブレーションファイルをロードします。4および関数を使用して、z座標抽出を行う「WNDファイルを選択してください」と「特殊機能」メニューの「Z座標操作」をクリックして、ポップアップダイアログで「Z座標抽出」。
    注：取得時間が> 15分であるため、機械的なドリフトが予想されます。
  7. X、Yでドリフト補正を実行するには、ローカライズの座標から明るい基準を選択します。この基準は、すべてのフレームで存在すべきです。続いて、「イメージ変換」メニューの下に"ガイドスターを書く/テスト」機能を使用して（ 図3A-B）登録に戻って、同一フレーム内の他のすべての座標を整列させるために基準のドリフトをy座標、Xを使用します。 Z座標登録は「特殊機能」メニューの下の「操作のZ座標」リンクをクリックして「テストガイド星」、ポップアップダイアログの "ガイドスターを書く」機能にアクセスすることで同様に行うことができます。
  8. サンプルはわずかな傾斜を示すことができるように、「クリックしてポップアップダイアログで「XYZチルトを削除」機能を使用してレベルを設定する必要があり平面を定義する3基準点のX、Y、Z座標を提供することにより、傾き補正を行います特殊機能「メニュー」の「操作のZ座標。
  9. ドリフトや傾き補正に続いて、ローカライズの座標を保存します。メインインターフェイス上で「レンダリング」コマンドを使用して、さらなる分析（ 図4A-D）のための超解像度画像を再構成します。色はz座標を示すために使用することができます。あるいは、選択された領域の側面図でもレンダリングすることができます。ローカリゼーション座標は、さらに定量化のためにテキストファイルとしてエクスポートすることができ、または再構成された画像は、.tifファイルとして保存することができます。

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結果

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iPALMのための重要な要件は、光学系のアライメント、登録、およびキャリブレーションされています。これらは、z座標の抽出に3ウェイビームスプリッタ必要内の適切な干渉を確実にするために必要です。継続的な監視を有効にするには、蛍光の一定の点光源が必要です。これは、蛍光のAu又はそのフォトルミネッセンス局在表面プラズモン共鳴（LSPR）から生じる二金属ナノ粒子23を用いて達成することができます。彼らは、照明の際に安定した単一双極子として作用し、一般的に5でローカライズすることができます - 10 nmの精度。これらの市販のナノ粒子は、フルオロフォアと基準点の両方が飽和状態（ 図1B）ことなく、EMCCDカメラに類似の励起強度とゲイン設定で撮像することができるように、大部分の単一分子の蛍光体の範囲内で明るさのレベルを放射します。さらに、これらの基準点も大幅FAC基準点の見かけの幅は、フォーカス調整中にモニターすることができる、集束ilitate。前述のように汚れた又は不十分な洗浄カバーガラスの偽バックグラウンド蛍光が容易...

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ディスカッション

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図1（a）に示すようiPALMの光学系は、4-πデュアル対向対物レンズの設計に基づいています。 表 1に先に23を説明し、記載されている設定は、カスタム機械加工や商業の両方の光学機械部品を用いて構成されています。私たちのセットアップに加えて、ハワード・ヒューズ医学研究所（HHMI）がJaneliaリサーチキャンパスでの高度なイメージングセンターでの科学界にアクセス可能なシステムをホストします。完全な機械図面、制御回路図、およびソフトウェアについては、読者は詳細についてHHMIでハラルドヘスにお問い合わせすることをお勧めします。 F-アクチンを可視化するためiPALMだけでなく、他の単一分子の局在顕微鏡法を使用する主な利点は、EM一般過酷なサンプル処理を必要とする技術は、面倒な準備、および高度に熟練した開業医3,23に比べて試料調製が比較的容易です。 Additionallyは、蛍光はEMのための困難なままでマルチチャンネルイメージング、に自然に適しています。さらに以下に記載されるように、それ...

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開示事項

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著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

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YWとPKは感謝PK（NRF-NRFF-2011-04とNRF2012NRF-CRP001-084）に授与シンガポール国立研究財団から資金援助を認めます。また、インフラストラクチャのサポートのためのMBIオープンラボと顕微鏡の中核施設に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
光学テーブルニューポート、CARS4000iPALM、4 ニューポートに設置 スタビライザー振動アイソレーター
光学テーブルニューポート、CAS-2000
レーザー-642ニューポート、CA1185055出力電力=100 mw
レーザー-561ニューポート、CA1168931出力電力=200 mw
レーザー-488ニューポート、CA1137970出力電力=200 mw
レーザー-405カリフォルニア州ニューポート1142279出力電力=100 mw
広帯域誘電体ミラーニュージャージー州 Thorlabs, ニュージャージーBB1-E02レーザーコンバイナー
ダイクロイック ビームスプリッターSemrock, NYLM01-427-25
音響光学チューナブルフィルターAA Opto-Electronic, フランスAOTFnC-VIS-TN
リニア偏光子ニューポート、CA05LP-VIS-B
ベースプレートローカルワークショップカスタマイズ
ターニングミラー(22.5°C)レイナードコーポレーション、カリフォルニア州は22.5°をカスタマイズし、ミラー
電動光学マウントニューフォーカス、CA8816
電動XYZ翻訳ステージThorlabs、ニュージャージー州MT3 / M-Z6サンプル
ホルダーT-Cube DCサーボモーターコントローラーThorlabs、ニュージャージー州TDC001
ピエゾフェーズシフターPhysik Instrumente、ドイツS-303.CD
対物レンズニコン、日本MRD01691対物レンズ。Apo TIRF 60X / 1.49オイル
翻訳ステージニューフォーカス、CA9062-COM-M
ピコモーターアクチュエーターニューフォーカス、CA8301
ロータリーソレノイド/シャッターDACO機器、CT5423-458
3ウェイビームスプリッターロッキーマウンテンインスツルメンツ、COカスタマイズビームスプリッター
ピエゾZ /チップ/チルトスキャナーPhysik Instrumente、ドイツS-316.10
電動5軸チルトアライナーニューフォーカス、CA8081
Picmotorイーサネットコントローラーニューフォーカス、CA8752
ピエゾコントローラー/アンプ/デジタル操作モジュールPhysik Instrumente、ドイツE-509 / E-503 / E-517
バンドパスフィルターSemrock、NYFF01-523 / 20フィルター
バンドパスフィルターSemrock, NYFF01-588/21
バンドパスフィルターSemrock, NYFF01-607/30
バンドパスフィルターSemrock, NYFF01-676/37
ノッチフィルターSemrock, NYNF01-405/488/561/635
電動フィルターホイール コントローラー付きThorlabs,NJ FW103H
EMCCDAndor, UKDU-897U-CSO-#BVカメラ
を制御し、同期するためのデスクトップコンピュータ3 セット DellPrecision T3500PC、
ヘッツィヒ付きカバースリップ600-100AuFサンプル調製。 さまざまな密度とスペクトルのフィデューシャルマークが利用可能
フィブロネクチンミリポア、MTFC010
パラホルムアルデヒドエレクトロン16%
グルタルアルデヒド電子顕微鏡科学、PA1622025%
トリトン X-100シグマ アルドリッチ、MOT8787
HUVEC cellsLife Technologies, CAC-015-10C
Medium 200Life Technologies, CAM-200-500
Large Vessel Endothelial Factors.Life Technologies, CAA14608-01
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline14190367
Pennicillin/Streptomycin15140122
Trypsin/EDTALife Technologies, CA25200056
PIPESSigma aldrich, MOP1851PHEM
HEPES1st base, MalaysiaBIO-1825
EGTASigma aldrich, MOE3889
sub>2Millipore, MT5985
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogen, CAA22287水素
化ホウ素ナトリウム (NaBH4)Sigma aldrich, MO480886quenching
glucose1st base, MalaysiaBIO-1101イメージングバッファー
グルコースオキシダーゼSigma aldrich、MOG2133
カタラーゼSigma aldrich、MOC9322
システアミンΣaldrich、MO30070
エポキシThorlabs、ニュージャージー州G14250
ワセリンSigma aldrich、MO16415サンプルシーリング
ラノリンSigma aldrich、MOL7387
パラフィンワックスシグマaldrich、ミズーリ州327204
液浸油電子顕微鏡科学、PA16915-04イメージング。カーギル タイプHF
州 フィデューシャル 4 セット、VA MgCl<

参考文献

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