方法論記事

組織学でMRIをマージするために、3D印刷技術を活用：脳セクショニングのためのプロトコルを

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DOI：

10.3791/54780

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2016年12月6日

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1Translational Neuroradiology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 2Cerebral Microcirculation Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, 3Viral Immunology Section, National Institute of Neurological Disorders and Stroke

この記事について

サマリー

このプロトコルの全体的な目標は、正確にカスタマイズされた3Dプリント脳ホルダーとスライサーボックスの作成によって組織学切片で磁気共鳴画像（MRI）画像ボリュームを揃えることです。

要約

磁気共鳴画像法(MRI)は、巨視的なスケールで正常組織と異常組織を区別することを可能にし、組織全体の体積を3次元的にサンプリングします。MRIは組織の異常を検出するための非常に感度の高いツールですが、信号の変化と根本的な病理学的プロセスとの関連は通常簡単ではありません。例えば、中枢神経系では、炎症、脱髄、軸索損傷、神経膠症、神経細胞死など、すべてMRIで同様の所見が引き起こされる可能性があります。そのため、MRIスキャンの解釈は状況に依存し、したがって放射線組織病理学的相関関係が最も重要です。残念ながら、脳組織の従来の病理学的切片化は不正確で一貫性がないことが多く、組織学切片とMRIとの比較を複雑にしています。この記事では、霊長類の脳組織を正確に切片化し、組織学とMRIの正確なマッチングを可能にするための新しい方法論を紹介します。この記事で説明する詳細なプロトコルは、3Dプリントされた脳スライサーの作成に依存するこの方法を適用する際に研究者を支援します。わずかに変更され、人間を含む他の種の脳に簡単に実装できます。

概要

生体内MRIは、巨視的なレベルでの組織の完全性の非侵襲的で感度の高い測定を提供します。in vivoで見られるMRI信号強度の変化は、多くの進行中の臨床試験の結果指標です。1 MRIで観察される強度の変化は、脳全体の状況で異常領域を特定することができますが、病理学的プロセスを区別するのに十分な特異性がないことがよくあります。これは、複数の病状が関与する動的プロセスに特に当てはまります。例えば、多発性硬化症(MS)またはその動物モデルでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)、炎症、浮腫、ミエリン分解、軸索破壊、神経膠症、神経細胞死が重複しています。 2、3基礎となる病理に関する必要な特異性を得るためには、MRIで同定された異常組織の組織学に関する知識とともに、状況を考慮に入れる必要があります。

しかし、適切に制御された動物実験であっても、組織学とin vivo MRIの照合は様々な理由から基本的に困難です。まず、組織切片とMRIの間の寸法スケールの違いは数桁です。4次に、適切な比較のために、MRIスライス面の向きは、切断時の脳組織の切片面と一致する必要があります。脳の形状により、脳が平らな面に座っているとき、一貫してまっすぐで正確なカットを行うことは非常に困難です。第三に、潜在的に小さな関心領域(病変、腫瘍など)に比べて脳のサイズが大きいため、組織を処理する病理医にとって「干し草の山に針が刺さる」シナリオが生まれます。第四に、標的組織が見つかった場合でも、元のMRIデータとの関連付けを事実上不可能にするような方法で処理されるのが一般的です。最後に、脳組織の従来の病理学的切片化は、しばしば不正確で一貫性がなく、組織切片とMRI画像との比較をさらに複雑にします。

これらの課題を克服するための以前の試みは、データおよび/または組織内または組織の周囲に基準マーカーを基準として共登録するための変形アルゴリズムの使用に依存していました。5、6、7、8前者のアプローチでは、データのフォーマット、イメージングアーティファクト、および組織処理によって引き起こされる変更による合併症に特に影響を受けやすい複雑な計算モデルが必要です。4 一方、後者のアプローチは、組織自体を汚染または害する可能性をもたらします。9

ここで説明するアプローチは、in vivo MRIと組織学の間のギャップを埋めるために、死後MRIの使用を通じてモダリティ間の移行を改善します。死後MRIは、in vivoで達成できるよりも高い解像度で脳の3次元(3D)画像を提供し、さらに、脳表面の形態学的に正確なモデルを作成するために必要なデータを提供します。このデジタルモデルを使用して、脳用の3Dプリントカスタムホルダーを作成できます。ブレインホルダーは、慎重な位置決めにより、MRI指向の正確な脳切片化を可能にし、複雑な数学的アルゴリズムの必要性を減らし、ターゲットを絞ったサンプリングのために特定の領域に焦点を当てることを可能にします。

私たちの研究室は最近、人間の10とマーモセットの脳のための死後MRIと3Dプリンティング技術を使用して、カスタムの脳ホルダーとスライサーを作成する新しい方法を導入しました。4 この 2 つの方法により、研究環境における MRI と組織学との相関関係がより正確になり、最終的には MRI 異常の根底にある特定の病理をより深く理解できるようになります。脳をin vivoで時間をかけて繰り返しサンプリングする、慎重に設計された実験は、病理の解釈のための文脈を提供することができ、その結果、MRIの解釈に特異性を加えることができます。ここでは、ヒト以外の霊長類、げっ歯類、またはヒトに由来するあらゆる脳組織に適用できる統一されたフレームワークで修正されたプロトコルを紹介します。マーモセットの切片化に関する詳細な手順と、対応するビデオを提供しています。全体的なプロトコルはあらゆるタイプの脳に適用されますが、MRIの取得と組織サイズの違い、および特定の脳タイプに対処する際に遭遇する課題により、処理される脳のタイプによってアプローチにいくつかの違いがあります。このプレゼンテーションでは、「ヒト」のセクションは、ヒトの脳に特有のプロトコルの違いを示します。

プロトコル

全ての動物取り扱いおよび本明細書に記載の手順は、神経疾患の国立研究所と脳卒中動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って実施しました。脳は、EAEを発症するように誘導され、共通のマーモセット（ マーモセット属コモンマーモセット ）から収集しました。 11脳を3週間、4％パラホルムアルデヒドtranscardial灌流による安楽死の後一年の間に10％ホルマリン中で保存しました。

1.死後MRIの準備と取得

  1. マーモセットの脳
    1. フッ素系オイル、パラフィン、およびマーモセットの脳の綿ガーゼ、50ミリリットルの遠心分離管、小さなへら、〜30mlでワークステーションを準備します。
    2. 20ミリリットルマークにフッ素系オイルやガーゼでチューブを埋めます。道に沿って気泡を除去するためにガーゼを圧縮します。
    3. ペーパータオルで脳の表面から乾いホルマリン。の底部に向かって前頭極で脳を挿入テレビ。慎重にその位置を固定する側面の周りより多くのガーゼを使用してチューブに脳を固定します。追加のMRIスキャンの設定のためのMRI脳クレードルを作成する方法のための補助的なセクション11を参照してください。
    4. ガーゼやフッ素系オイルとチューブの残りの部分を埋めます。慎重に道に沿って気泡を除去。キャップを固定し、パラフィンでチューブを密封します。
    5. 大脳縦裂に沿ってキャップをマークします。ペーパータオルでチューブをラップし、マーク上部中央とコイルに挿入します。
    6. 2DスピンエコーT2を取得します。パラメータを表1に示します。
    7. Mipavで10解剖学的150ミクロンT2-weigted買収を開き、6 回目の買収に登録します。
      注：登録はパウエルの呼び出しブレントの検索アルゴリズムで、自由、窓付きのsinc補間、正規化相互相関コスト関数の9度と最適化された自動登録の3.5Dアルゴリズムです。回転は10からサンプリングしました6; 1°をインクリメント5度をインクリメント粗い回転と細かい回転に-10°です。次に、登録画像を平均化：ユーティリティ、イメージの電卓バルク画像、平均。
  2. 人間の脳
    1. 中脳のレベルでのカットを使用して、脳幹から前脳を分離します。 10半球はまた、正中線ダウンカットで分離することができます。
    2. 一方の端部に半球ドーム、他端に注ぎ口を有する円筒形の管で前脳を置きます。
    3. 注ぎ口を介してフッ素系オイルでチューブを埋めます。注ぎ口を通して〜30分の穏やかな吸引を使用して気泡を除去。
    4. 3D T1-MPRAGEを取得します。パラメータを表1に示します。

2.解凍脳表面：Mipav 7.2

  1. 冠状向きでMRIを開きます。
  2. アルゴリズム、変換ツール、変換、再サンプルを選択します。ユーザー定義サイズを選択して、ISOTにリサンプリングropicボクセル：0.1×0.1×0.1ミリメートル。 Brain_MRI_ResampledとしてリサンプリングMRIを保存します。人間：等方性ボクセル0.3×0.3×0.3ミリメートルにリサンプリング。
  3. アルゴリズム、フィルタ（空間）、非線形ノイズリダクション]を選択します。デフォルトの設定を使用して、[OK]をクリックします。
  4. 表示ルックアップテーブルを選択し、二重しきい値]ボタンをクリックします。脳全体をカバーするために、グラフ上のスライダーをドラッグします。
  5. 最小/最大を使用してアルゴリズム、セグメンテーション、しきい値、しきい値を選択します。 「下限」ボックスに（ちょうどスケールの下）強度グラフの左下隅にある値を入力します。出力画像タイプのために「バイナリ」を選択し、チェックを外し、「反転しきい値を。」
  6. アルゴリズム、形態素を選択して、穴を埋めます。 「2.5Dでのプロセス」をチェック
  7. これは完全な脳のMRIであるため、満たされる必要がある後脳および皮質の間にいくつかの空のスペースがあります。人間の脳：このステップをスキップします。
    1. ラインVOIを使用して、接続に描きます最も外側にある点で、脳の両側の後脳および皮質の間。脳を介してこれを続けます。
    2. VOI、VOI変換、バイナリマスクにすべてを選択します。ユーティリティを選択し、画像の電卓。選択OR演算子]ドロップダウンメニューから、脳のマスクを選択します。 「デスティネーションイメージの種類を推進する」を選択
    3. アルゴリズム、形態素を選択して、穴を埋めます。チェック "2.5Dでのプロセス」
  8. Brain_Model.niiなどのバイナリマスクを保存します。
  9. アルゴリズム、抽出表面（マーチングキューブ）を選択します。マスク画像を選択し、Brain_Model.plyとして保存します。

3.スライス選択場所：Mipav 7.2

  1. 興味や開始位置の組織を識別します。意図されたスラブの厚さを計算します。マーモセットの脳では、セクションごとに30 MRIスライス、およびブレードギャップあたり5 MRIスライスを、カウントが〜3.5ミリメートルのスラブで、その結果、0.5ミリメートルブレードギャップが3mmのセクションを作成します。人間の脳：セクションあたり20 MRIのスライス、および4のMRI SLブレードギャップあたりの氷は、〜7.2ミリメートルのスラブで、その結果、1.2ミリメートルブレードギャップを有する6ミリメートルのセクションを作成します。
  2. 第1ブレードギャップの位置では、「ボックスVOI」をクリックし、脳の上にボックスを描画します。それを選択するために、ボックスの内側をクリックします。コピーとブレードギャップに対応する各MRIスライスの輪郭を貼り付けます。
  3. 切片厚に対応するMRIスライスの数によって前方にスキップして次のブレードギャップに対応する輪郭をコピーして貼り付けます。脳を介してこのプロセスを繰り返します。
  4. VOI、VOIの変換、バイナリマスクにすべてを選択します。 Blade_Gaps.niiとして保存します。
  5. アルゴリズム、抽出表面（マーチングキューブ）、マスク画像、Blade_Gaps.plyを選択します 。

4. MRIブレードマップの作成：Mipav 7.2

  1. Brain_MRI_ResampledとBlade_Gaps.nii画像を開きます。
  2. Blade_Gaps.niiイメージが選択すると、ユーティリティを選択し、画像の数学。画像タイプと乗算を推進選択します。値として万を入力します。
  3. ユーティリティを選択し、画像の電卓。 [追加]を選択して、[画像]ドロップダウンボックスからBrain_MRI_Resampledイメージを選択します。先の画像の種類を推進選択します。
  4. Brain_BladeMap.niiとしてこのイメージを保存します。
  5. Triplanarビューをクリックすることで、脳がスライスされた場所は、三つの直交ビューで見ることができます。

5.脳とブレードギャップサーフェスをインポート：Netfabbプロフェッショナル

  1. パートを選択し、部品を追加します。ファイルBrain_Model.plyとBlade_Gaps.plyを選択します。
  2. 脳を選択し、修復モードをクリックしてください。修復モードでは：
    1. シェルの選択]ボタンをクリックし、脳をクリックしてください。
    2. 他のメッシュを選択するためのトグル選択ボタンをクリックします。他のメッシュを削除するには、Removeをクリックします。
    3. 適用修復をクリックし、古い部分を削除します。
  3. 右脳をクリックしてください。移動を選択します。クリックします。原点ボタンに。表示されるXYZパラメータを記録します。これらの翻訳パラメータはMipavで設定ブレードの位置を維持するために必要とされます。翻訳をクリックします。その後、ウィンドウを閉じます。 （複数回を変換]をクリックしないでください。それは、再び同じパラメータを使用して変換します。）
  4. Blade_Gapsモデルを選択します。右の部分をクリックし、移動を選択します。 XYZパラメータボックスに、以前に記録されたXYZ値を入力します。今すぐ翻訳をクリックしてウィンドウを閉じます。
  5. Brain_Modelモデルを選択し、修復モードをクリックしてください。修復モードでは：
    1. シェルの選択]ボタンをクリックし、脳をクリックしてください。
    2. 右クリックして、スムーズな三角形を選択します。 4-5回の反復を入力します。防止のボリューム縮小を確認してください。人間の脳：1-2の繰り返し。
    3. 右クリックして、三角形を減らして選択します。ターゲット三角形カウントで200000を入力して、[実行]をクリックします。
    4. 自動修復、デフォルトの修理をクリックします。そして、適用の修復をクリックします
  6. 右クリックし、名前を変更します。 Smoothed_Brain_Modelとして平滑化された脳の名前を変更します。
  7. Smoothed_Brain_Modelを選択します 。右クリックし、エクスポート、STL。

6.編集脳等高線：Meshmixer

  1. MeshmixerにSmoothed_Brain_Modelをインポートします。
  2. メッシュへの調整を行うために彫刻し、選択ツールを使用してください。編集が含まれます：
    1. 堅牢な滑らかなスカルプトツールを使用してください。ラインのVOIに対応する領域を滑らか。人間の脳：このステップをスキップします。
    2. ボックスに伏せされる皮質の表面を滑らかに。
    3. メッシングや編集プロセスで作成されている可能性があり、小さなくぼみを離れて滑らか。
  3. 分析、インスペクタ、Autorepairすべてを選択します。
  4. Smoothed_Edited_Brain_ModelとしてSmoothed_Brain_Modelをエクスポートします 。

7.脳スライサーボックスの作成：Netfabbプロフェッショナル

  1. パートを選択し、パートを追加します。フィルを選択してください電子Smoothed_Edited_Brain_Model。
  2. パートを選択し、パートを追加します。そして、STLファイルブレインスライサーParts_Marmosetを選択し、[開く]をクリックします。人間の脳： 脳スライサーParts_Human（補足コードファイル）。
  3. 右の部分をクリックすると、部品に拡張、シェルを選択します。各部分を個別に選択し、右に名前を変更する]をクリックします。 （オブジェクトの隣に目をクリックすると、それを隠したり、それが表示されるようになります。） ビッグボックスメイン 、小さなボックスのサブ 、および切断ボックスBox_Cutout、六角形状Blade_Holder_Main、小型フラットボックスミクロトームブレード 、およびハーフの名前を変更しますチューブオブジェクトクレードル 。人間の脳：なしBlade_Holder_Main、 ミクロトームブレード 、またはクレードル 。
  4. メイン 、 サブ 、 ブレイド、Blade_Holder_Main、 ミクロトームブレード 、およびクレードルを非表示にし、すべての6とBox_Cutoutを選択するために、シフトセレクトを使用しています。 Box_CutoutとSmoothed_Edのみited_Brain_Modelが見えるはずですが、Smoothed_Edited_Brain_Modelを選択すべきではありません。
  5. 脳への相対的なボックスの位置を調整するためにクリックして、選択された部分をドラッグします。
    1. ボックスの中央に脳を置きます。ボックス内に十分な深部脳がしっかりと把持するPostionが、あまりにも深くない適切な配置を防ぐオーバーハングを作成します。
  6. 配置されると、脳ボックスの輪郭がオーバーハングについて試験することができます。 Box_CutoutとSmoothed_Edited_Brain_Modelを選択します 。ブール演算を選択します。
    1. 赤いそれを回すためにSmoothed_Edited_Brain_Modelをクリックします。
    2. ブール減算を選択して、計算を適用。
  7. 安全ボックス内に配置されることから脳組織を妨げるオーバーハングのための脳のチェックボックスをオンにします。これらのオーバーハングが存在する場合、それはボックス内の以下の深さであるので、脳を調整します。脳は、所望の深さとオーバーハングにある場合存在している、オーバーハングを除去するためのソリューションのための補助的なセクション10を参照してください。
  8. Blade_Gapsモデルを選択します。右クリックし、[移動]を選択します。位置Z値を記録し、その後、ウィンドウを閉じます。これは、ほとんどの後方ブレードギャップの位置になります。
  9. 脳スライサーパーツから来たブレード STLを選択します。右クリックし、[移動]を選択します。
    1. 絶対翻訳を選択します。 7.8からZ値を入力します。 XとYの値については、現在の位置パラメーターボックスから対応する値を入力してください
  10. ブレード STLを選択します。右クリックし、[複製]をクリックします。
    1. 部品を配置し確認してください。合計数のブレードの合計数を入力します。 Zカウントボックスに同じ番号を入力します。 Zのギャップにスラブ厚を入力します。重複をクリックします。スラブ厚を変化させた場合には、ブレードが個別に配置される必要があります。 （前方に後方からの移動）は、前からそれぞれの新しいブレードを複製そのセクションのセクションの厚さに等しいzのギャップを有します。
  11. ミクロトーム刃のためのステップ7.9と7.10を繰り返して、スライサー内のブレードとまったく同じ間隔でミクロトームブレード部品を配置します。人間の脳：このステップをスキップします。
    1. Blade_Holder_Main部分と一緒にミクロトームブレードを選択し、ブール演算を選択します。
    2. 赤、それらを強調するためにミクロトームブレード内のすべてのブレードを選択します。ブール減算をクリックして、計算を適用。
    3. 修復モードを選択します。拡張修復を実行します。修理を適用選択し、古い部分を削除します。
    4. 一部のブレードホルダーの名前を変更します。 STLなどの一部をエクスポートします。
  12. Shiftキーを押しながら選択Smoothed_Edited_Brain_Model、前のステップで作成したブレードモデル 、およびサブとメインのすべてを。ブーリアン演算をクリックします。
    1. それ自体によってメイン赤以外の部品のすべてを作りますそれらをlectingと赤に移動するには、緑色のボックスの下矢印をクリック。
    2. ブール減算を選択し、計算を適用]を選択します。
  13. 修復モードをクリックします。修復モードでは：
    1. オーバーハングや鋭いポイントのチェックボックスをオンにします。これらはNetfabbまたはMeshmixerで平滑化することができます。
    2. 自動修復、拡張、修復をクリックします。その後、修復を適用し、古い部分を削除
  14. 右側の修理脳ボックスをクリックして、 脳スライサーボックスに名前を変更します。 STLとしてエクスポート。

8. Ultimaker 2に脳スライサーボックスを印刷

  1. マーモセットの脳：クーラ
    1. クーラに脳スライサーボックスをインポートします。
    2. [回転]を選択し、それがベッドの上に平らになるようにボックスを回転させるために円をドラッグします。
    3. 0.1ミリメートル層の解像度、50％充填密度、ラフト：印刷設定を調整します。
    4. SDカードに保存するツールパスを選択します。 （〜12時間の時間を表示します。）
    5. インポートブレードホルダーでクーラへとスロットが側にあると六角面がXZまたはYZ平面内にあるので、それを回転させます。
    6. オブジェクトを複製します。
    7. 0.2ミリメートル層の解像度、20％充填密度、つば：印刷設定を調整します。
    8. SDカードに保存するツールパスを選択します。 （印刷時間〜3時間）
  2. 人間の脳：クーラ
    1. クーラに脳スライサーボックスをインポートして、8.1.2のように回転させます。
    2. 印刷設定を調整します：0.2ミリメートル層の解像度30〜35％の充填密度、いかだを。
    3. SDカードに保存するツールパスを選択します。 （単一半球ボックスの〜70時間の時間を表示します。）
  3. Ultimaker 2オン
    1. プレートを構築するためにスティックのり接着剤の薄層を適用します。
    2. SDカードを挿入します。印刷を選択して、パーツを選択します。

9.脳を切断

  1. マーモセットの脳
    1. 固定脳、脳スライサー、2ブレードホルダー、ミクロトーム刃、フッ素系オイルの1ミリリットル、fにワークステーションを準備緯度ピンセット、保護手袋、および包埋カセット。
    2. ブレードホルダー上のスロットに新しいミクロトームの刃を配置します。各ブレードの斜めの縁が同じ方向に向いていることを確認します。 ミクロトームブレードを取り扱う際は保護手袋を着用します。
    3. ホルマリンから脳を外し、静かに乾燥させます。
    4. スライサーに脳を置きます。フッ素オイル数滴の容易な位置決めを可能にするために、脳およびスライサーにも適用することができます。脳が所定の位置にしっかりとあることを確認します。
    5. 対応するブレードスロット内のブレードとブレードホルダーを置きます。
    6. ブレードホルダーにしっかりと下に押して、脳を切断するために、低速バランス圧力を加えます。
    7. 脳の前面から始めて、各スラブを1つずつ削除します。これは、スラブ自体を削除する前に、スラブの前にミクロトームの刃を除去するのに役立ちます。各スラブの前方/後方向きに細心の注意を払ってください。
    8. 前方ANの写真を撮ります各スラブのd後面。後部スラブは、最も可能性の高い別々の部品が含まれているので、埋め込むためのピースの向きに注意を払うだろう。包埋カセットに各スラブを配置し、10％ホルマリン溶液にそれらすべてを置きます。
  2. 人間の脳
    1. 慎重に箱に脳の適合をテストします。
    2. ゆっくりと、しかししっかりとスライスし、角度の付いたカットを使用して、一方の端部から始まる脳をスライス。各ブレードの隙間を通って脳をカットします。
    3. 各スラブの数と、前方/後方の方向に細心の注意を払って、一度に各スラブ1を削除してください。
    4. 各スラブの前面と後面の写真を撮ります。密封された10％ホルマリン袋にスラブを配置します。組織ブロックは、スラブから切り出し、埋め込みカセット内に配置されます。

ブレインボックス（補足節）10.取り外しオーバーハング

  1. Meshmixer：スライスを引き出します
    1. Smoothed_Editをインポートed_Brain_Model。
    2. [編集]を選択し、スライスを作成します。メイクスライスで：
      1. 積み上げ3D、Zを選択して1〜2ミリの厚さを入力します。計算をクリックします。スライスをロードすると、[Accept]をクリックします。
    3. 皮質の下の方に大きな周囲長との1または2のスライスを選択します。これらのスライスは、 サブボックスのレベルより下でなければなりません。
    4. Brain_Slice_＃などこれらのスライスのそれぞれをエクスポートします。
  2. オーバーハングを除去するために、スライスを拡張：Netfabbプロフェッショナル
    1. Brain_Slice_の＃スライスをインポートします。
    2. 各Brain_Slice_＃を （チェックすると部品の手配をオフに）重複しています。
    3. 右各Brain_Slice_＃と選択スケールの一つのコピーをクリックします。
      1. チェックを外して固定スケーリング比。それがサブボックスの下部のレベルに到達するようそしてY方向に脳スライスをスケールアップ。
    4. Brain_Slice_Big_＃これらのスライスの名前を変更します。
    5. Y位置Oをチェック部分を右クリックして、元のBrain_Slice_の＃fおよび移動を選択します。元Brain_Slice_の＃スライスのそれぞれについて、Y位置を記録します。
    6. 計算を実行します。Brain_Slice_＃[y位置] - （Brain_Slice_Big_＃[Yサイズ] - Brain_Slice _＃[Yサイズ]）
    7. 個別Brain_Slice_Big_＃2のそれぞれを選択し、右クリックして[移動]を選択します。
      1. Y並進パラメータボックスで10.2.6から算出した値を入力します。 XとZ変換パラメータについては、現在の位置パラメーターボックスに位置の値を入力します。絶対翻訳を選択します。翻訳し、ウィンドウを閉じますをクリックします。
        注：ボックスを作るときBrain_Slice_Big_の＃スライスは、脳とブレードと一緒に差し引かれます。

追加のスキャンのための11マーモセットの脳MRIクレードル

  1. 脳MRIクレードルを作成します
    1. クロムの上面ことを確認してくださいadleはBox_Cutoutと同じ高さにあります。クレードルに脳の深さと位置は、それがスライサーのためであると同じように設定する必要があります。
    2. Shiftキーを押しながら選択Smoothed_Edited_Brain_Modelとクレードルを選択します。
    3. ブール演算を選択します。ブール減算を選択し、赤いそれを強調するために、脳を選択します。その後、計算を適用。 （該当する場合もBrain_Slice_Big_の＃スライスを選択します。）
    4. スライサーのために以前に行ったようにクレードル輪郭に鋭いポイントを削除するには、修復モードを入力します。拡張修復を選択します。修理を適用し、古い部分を削除します。
    5. 右部分MRI脳クレードルの名前を変更する]をクリックします。 、STLをエクスポート]を選択します。
  2. クーラ：クレードルを印刷
    1. クーラにMRI脳クレードルをインポートし、脳の切り欠きを有する平坦な部分が表向きになるように回転させます。
    2. 0.1ミリメートル層の解像度、100％充填密度、ラフト：印刷設定を調整します。
    3. SDカードに保存するツールパスを選択します。 （印刷時間〜10時間）
    4. 8.3で説明したようにUltimaker 2に印刷します。
  3. クレードルを使用して取得した高解像度T2 * MRI
    1. ペーパータオルで脳の表面から乾いホルマリン。
    2. スライサーで説明したようにクレードルに脳を置きます。
    3. 50ミリリットルの遠心分離管に脳とクレードルをスライドさせます。フッ素系オイルでいっぱいにそれを記入します。
    4. ゆっくりと気泡が脳から逃れることができるようにチューブを絞ります。そこに気泡が生じないようにするために、チューブキャップのはめ込みにキャップを挿入を挿入します 。キャップを固定し、パラフィンでチューブを密封します。
    5. 前述のようにコイル状にチューブを置きます。 3D T2 *パラメータを表1に示します。
    6. Mipavで18解剖学的100ミクロンT2 * -重み付け買収を開き、10 回目の買収に登録します。登録パラメータは、1.1.7と同じです。ユタ：登録画像を平均化ilities、画像電卓バルク画像、平均。

結果

この方法のワークフローは、脳がスライスされると、スラブの表面の表面のMR画像と画像の間の視覚的な比較は、複数のスラブを横切る良好な配向が一致する（図2）を示し、図1に要約されています。スラブをパラフィンに包埋した後、それらは、ミクロトームで切片と染色します。高解像度の死後MRIと染色組織学セクション間のより完全な比較は、マーモセットの脳（図3）の全ての構造を横切って、正確で一貫性の一致を示しています。

MSのこの動物モデルにおいて、動物は、大脳白質全体に広がる白質病変を開発します。これらの病変はMRIを行うことにより、非侵襲的に検出することができます。図4は、MRI所見の病理学的な基板を解明するこの技術の能力を示します。 in vivoでの MRIで検出された小さな病変缶死後MRIおよび組織学の両方で追跡します。挿入図に示すように、病変内の脱髄は、（周囲の組織と比較しhyperintensity）MR信号の変化を駆動する主な要素の一つです。組織学および死後MRIはまた、in vivoでの MRI（図4）に逃した病変を表示することができます。

figure-results-1
マーモセットの脳スライサーボックスを作成する1.ワークフロー図 。脳をホルマリン（A1）で固定されており、T2強調MRIは、エッジあたり150マイクロメートル（A2）の等方性ボクセルで取得されています。画像を処理し、バイナリマスク（A3）を作成するために閾値処理されています。表面は、その後、3Dモデリングソフトウェア（A4）でレンダリングされます。スライサーテンプレートと脳モデルとのブーリアン減算は脳スライサー（B1）のデジタルモデルを作成します。脳スライサーボックスは、3Dプリンタ（B2）に印刷されています。脳は、その後、スライサーボックスの中にしっかりと配置されています切断（B3）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-2
左から右へ図2： 生体内 MRI、死後MRI、および組織スラブ写真で 。スライス平面は、対応するin vivoでの MRIのスライス（A）に比べて視覚的に死後MRI（B）に基づいて設立されました。脳は、その後切断し、そして得られたスラブは、一貫した（C）であることが見出されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図3.高解像度の死後MRIおよび組織学セクションマッチング。スラブは、4μmの切片にミクロトームで切断し、パラフィンに包埋し、ファストブルーおよびクレシルバイオレット（B）で染色しました。次いで、切片を視覚的に脳構造（A）に基づいて、100ミクロンのT2 * - 重み付けMRIと一致しました。この画像を取得するための詳細は、プロトコルと表1の脳構造の補足セクションにあります：（1）赤い矢印=内部カプセル、青色の矢印=前交連。 （2）赤い矢印=被殻、青色の矢印=視索。 （3）赤色の矢印=尾状核、青色の矢印=海馬; （4）赤い矢印=脳梁、青色の矢印=中脳水道; （5）赤い矢印=下丘、青い矢印=錐体路。 B1の破線のボックスは、どちらかの脳の切断またはパラフィン包埋中に、エラーが左側の前交連の不一致につながる、Y軸周りのわずかな回転を引き起こしたスライスを示しています。 ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。

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図4.組織学セクションにin vivoでの MRIの病変を追跡。 in vivoでの MRIは視神経管（A1）のいずれかに病変を示唆する異常hyperintensity信号のない説得力のある証拠を示しませんでした。しかし、高解像度の死後MRIは、両方の視神経管（A2）の明確なハイパー強烈な行を示しています。 4μmの組織学セクションのファーストブルー/クレシルバイオレット染色は、ex vivo MRIで見られる高強度領域は（A3）の脱髄していることを示しています。大脳白質では、in vivoでの MRIは微妙な左右対称hyperintensity（B1、インセットの拡大）を示しています。高信号領域は、高解像度の死後MRI（B2）の詳細は明らかです。 4μmの組織学セクションのLFB染色は、これらの領域は、（B3）の脱髄していることを示しています。ベースラインIと比較した後、nは生体内MRIとヘマトキシリン・アンド・エオシン染色は、右サイドは、解剖学的異常はなく、脱髄病変であると決定しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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補足コードファイル。 Brain_Slicer_Parts_Marmoset.stl： このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。 Brain_Slicer_Parts_Human.stl： このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。 Cap_Insert.stl： このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、MRIおよび組織学のセクション間の正確な比較を可能にします。プロトコルは、例えば、マーモセットやげっ歯類などのヒトまたは小動物の脳に適用することができる統一フォーマットで提示されています。大（ヒト）に特異的な、脳が強調されている（非ヒト霊長類および齧歯類）小、および添付のビデオや数字の違いは、私たちは、マーモセットでアプリケーションを実証します。アプローチは簡単ですが、この方法は多くの工程だけでなく、ソフトウェアのいくつかのタイプを使用する必要があります。また、潜在的にこの方法の精度に影響を与えるいくつかの問題が言及することが重要です。

インビボ MRIの画質が重要な因子です。 MRIおよび組織学的デジタル画像間の画像解像度の不均衡を最小限に抑えるために、可能な限り最小のMRIボクセルサイズは、使用されるべきです。この概念はまた、死後MRIの画質に適用されます。増加したものの死後MRIにおける取得時間がはるかに高い画像解像度を可能にする、製剤は、気泡に関連する焦点信号抜け等の画像アーチファクトを導入することができます。これらのアーチファクトは、組織の領域を不明瞭だけでなく、その輪郭に影響を与えることができます。また、死後のMRI上の組織の寸法は、定着工程及び持続時間によって影響される可能性があります。 ex vivoでのMRI一致密接取得中スライス幾何設定で、解剖学的ランドマークを利用することによって近似することができるにインビボながらは、非線形登録がまだそれら二つのMRI画像を合わせてより高い精度に到達するのに必要であろう。

脳ホルダーとスライサーのデザインも重要なステップです。脳のデジタルモデルを作成する際に、平滑化アルゴリズムは、わずかに固定された脳のモデルを相対的に大きくすることが適用されます。これは、そのホルダーとスライサーに脳の容易な挿入を可能にし、ホルダーにシャープなエッジを低減します＆＃39; sの輪郭。モデルが大きすぎる場合は、（例えば、5％以上）、脳は死後MRIおよび/または切片中に移動することがあります。別の重要な点は、小脳が適切に3D印刷オブジェクトの内部に配置されるように、脳モデルの設計を適応させることです。小脳は、剖検で脳の抽出中に損傷を受けたとき、これは特に困難な場合があります。

脳スライサーとホルダーを印刷する場合は、3Dプリンタの種類も慎重に選択する必要があります。いくつかのマルチインクジェットプリンタは、支持材料を除去するためにオーブンを用いて後処理を必要とします。これらのプリンタは、防水およびデスクトップ熱溶解積層法（FDM）のプリンタよりも比較的耐久性があるオブジェクトを生成することができますが、サポートを除去するための加熱処理は、わずかに脳の輪郭に対して完全に垂直ではないブレードギャップを作成し、ボックスをワープすることができます。

脳切片プロセスは、別の重要なステップです。目を切断する前に電子スラブへの全脳は、脳が脳スライサーの内側にしっかりと座っていることを確認することが重要です：わずかな圧力が脳に適用される動きがあってはなりません。これにより、ブレードが研究者によって設定された正確な位置で脳を切断できるようにするためであろう。切断時に連続し、バランスのとれた圧力は、両方のブレードホルダーに適用する必要があります。刃の切れ味と組織の剛性に応じて、わずかな横方向の切削運動は、平坦な切断面を維持するのに有利である可能性があります。

パラフィン包埋プロセスはまた、MRIおよび組織学との位置ずれの原因となることがあります。組織のスラブは、埋め込みプロセス中にカセットに対して平らに座っていない場合は、ミクロトームの切断面とスラブの表面の場所との間に傾きがあるでしょう。これは、すべての組織が露出した平面を検索するために使用できないセクションを切断する必要があります。傾きを補正するための一つの方法高等方性の解像度の死後MRIで観察面の角度を変化させることです。しかし、これは通常異方性解像度（典型的には厚の冠状切片）で取得されたin vivoでのMRI上で実行することはほぼ不可能です。

最後に、組織は、同様に（しわ、割れ、折りたたみ）スライドの準備中にホルマリン固定期間およびパラフィン包埋（収縮）の間にいくつかの変形を体験することができます。これらの変形のいくつかは、スライド上に転送する前に水浴中で4~5μmの切片を置くことによって補正することができます。他の変形は、部分的に、死後MRI画像に学的デジタル画像の変形可能な画像coregistrationを実行することによって解決することができます。それにもかかわらず、慎重かつ熟練の練習で変形を最小限に抑えることが組織学セクションにMRIボリュームに一致する最も効果的なアプローチです。

結論として、ここで紹介する方法は、INVを可能にします正確にMRI所見の根底にある病理を評価するestigators。より一般的には、同定および/またはそのような炎症または再ミエリン化のような特定の病理学的プロセスを標的とする調査研究のための新規MRIバイオマーカーを検証するための有望なアプローチです。

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

NINDSの学内研究プログラムがこの研究を支援しました。NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facilityに感謝します。ジェニファー・ルフェーヴル氏とセシル・チャーン・チー・イェン氏には、死後MRIの撮影にご協力いただき、ありがとうございました。3Dプリンティングの支援について、John Ostuni氏とSection on Instrumentation Core Facilityに感謝します。この作業の図1は、3D-CoFormプロジェクトの支援を受けて開発されたツールであるMeshLabのスナップショットを使用しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
7T/30cm USR AVIII Bruker MRIBruker Biospin
38 mm Bruker Biospin ボリュームコイルBruker Biospin
FomblinSolvay Solexis
50 ml Falcon Centrifuge Tubes, ポリプロピレン, 滅菌済み Corning21008-951
Fisherbrand ガーゼスポンジFisher Scientrific13-761-52
パラフィルムM 万能実験用フィルムビーミス
ライカ RM2235 ロータリーミクロトーム ライカ
ライカ ディスポーザブル ブレード、ロー プロファイル (819)ライカ
クレシル バイオレット アセテート、0.1% 水性電子顕微鏡 科学26089-01
ルクソール ファスト ブルー、0.1% 95% アルコール電子顕微鏡 科学26056-15
ETOH
Ultimaker 2 拡張 Ultimaker.75
kg Ultimaker公式ブランド PLA フィラメント、2.85 mm、シルバーメタリックUltimaker
Axio Observer.Z1Zeiss
Zen 2 (Blue Edition)Zeiss
Netfabb Professional 5.0.1Netfabbhttp://www.netfabb.com/professional.php
Meshmixer 10.9.332Autodeskhttp://www.meshmixer.com/download.html
Mipav 7.2NIH CIThttp://mipav.cit.nih.edu
CuraUltimakerhttps://ultimaker.com/en/products/cura-software

参考文献

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