成体マウスの脊髄組織からの初代混合グリア培養の調製

サマリー

神経因性疼痛の発症は、脊髄グリア細胞の病理学的変化を伴います。成人脊髄組織に由来し、 インビトロでこれらの細胞を研究するために設計された信頼性のあるグリア培養システムが欠如しています。したがって、我々は、成体マウスの脊髄組織からの初代混合グリア培養を確立する方法をここに示します。

要約

脊髄グリア応答が神経因性疼痛の発展に大きく寄与することが広く受け入れられてきました。細胞および分子レベルでのグリア活性に関する膨大な情報は、インビトロ細胞培養系を介して得られています。利用インビトロ系は、主に新生児の脳皮質組織に由来する初代グリアを含む、細胞株を不死化。しかしながら、これらのシステムは、 インビボで脊髄グリア細胞の特性を反映しないかもしれません。さらに優れたin vivoでの条件を反映した培養系を用いて、末梢神経損傷誘発性神経障害性疼痛の発達における脊髄グリア細胞の役割を調べるために、我々の研究室から、一次脊髄混合膠細胞培養を確立するための方法を開発しました成体マウス。簡単に言えば、脊髄を成体マウスから収集し、洞穴とミエリン除去しパパイン消化を介して処理されています性勾配の媒体。単一細胞懸濁液は、35.9℃で^O 2-メルカプトエタノール（2-ME）を補充した完全ダルベッコ改変イーグル培地（CDMEM）で培養しますこれらの培養条件は、混合グリア細胞の増殖のために特別に最適化しました。これらの条件下では、細胞は12間の実験のために使用される準備ができている - 14日間の培養の確立（D 0）の後に（細胞は、この時間中対数期に通常ある）、およびD 21までの培養条件で維持することができます。この培養系は、様々な物質および薬剤による刺激の際に脊髄グリア細胞の応答を研究するために使用することができます。神経因性疼痛に加えて、このシステムは、脊髄グリア細胞の病理学的変化を伴う他の疾患におけるグリア細胞の応答を研究するために使用することができます。

概要

慢性疼痛は、最高$ 635 ¹⁰億の推定年間コストで、米国では、約100万人の成人に影響を与える深刻な健康問題です。証拠は、神経因性疼痛、慢性疼痛²の最も破壊的な種類の一つの開発における脊髄グリア細胞の有意な寄与を示しています。適切なインビトロ培養系は、さらに、細胞および分子レベルでのグリア細胞の役割を調査中で有意に役立つだろう。

現在、研究者によって利用されるインビトログリア培養系は、新生仔マウスまたはラットの脳の皮質組織に由来する主としてグリア細胞を含み、新生仔マウスまたはラット初代グリア細胞由来のグリア細胞株を不死化。新生児の細胞は、このように提供し、さらに（主にアストロサイトとミクログリア）グリア細胞に分化させることができる未分化細胞のかなりの数が含まれています実験的な使用方法³ bundant細胞。しかし、我々の以前の研究では、新生児の脳グリア細胞は、リポポリサッカライド（LPS）刺激により、成人の脊髄グリア細胞から大幅に異なって応答することが示されています。例えば、インターロイキン（IL）は-4新生児の脳のグリア⁴に比べて成体ラットの脊髄グリアにおけるLPS誘導性一酸化窒素（NO）産生に対する強化された阻害効果を示しました。さらに、遺伝子関連ペプチド（CGRP）カルシトニン神経ペプチドによる刺激時のケモカイン産生のプロファイルは、（5。参考文献に記載される方法）新生児マウスの脳グリア間でunarguably異なって、成体マウス脊髄グリア（ 図1）。確立された細胞株を使用して、保守が容易であり、短時間で多数の細胞を提供することができます。一般的に、細胞株を生成いずれかの^6,7または下記目（例えば、広く使用されているミクログリア細胞株BV2ように）ウイルス媒介性不死化システムを使用して不死化自発的な転換の電子識別（例えば、アストロサイト細胞株C8-D1Aとミクログリア細胞株C8-B4など^）8、9細胞株を個別にアストロサイトとミクログリアの分子特性を研究する上で優れています。しかし、細胞株から得られた結果は、常にプライマリ細胞またはin vivoの条件にさらなる検証が必要です。また、齧歯類脊髄グリア由来するグリア細胞株の報告がなされていないことに留意すべきです。

神経因性疼痛の発達における脊髄グリア細胞の役割を調査するために、成体マウスの脊髄に由来する培養系は成体ラット混合膠細胞培養物^4を生成するために使用される以前に報告された方法を適合させることにより開発された^、5マウス脊髄グリア細胞の培養物は、さらに、最近^10を精製し、この記事に詳細に記載されています。大人脊髄混合膠細胞培養C特定の研究の必要性に合うよう選択された株からのマウスで確立され、そして細胞は、培養の最大21 Dの開始後、培養物中に維持することができます。この方法は、ならびに - 関連筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の感覚神経障害、および複数のような脊髄内の病理学的変化を伴う様々な神経学的疾患の研究において、神経因性疼痛の研究に使用することができます硬化症（MS）。

プロトコル

以下のプロトコルは、ニューイングランド大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。以下のプロトコルは、4成体マウスの脊髄から膠細胞培養を調製するためのものです。

無菌条件下で培養フードでソリューションの調製

1. 培地を準備しイーグル培地（CDMEM）DMEMを含有する完全ダルベッコ改変、10％ウシ胎児血清（FBS）、2mM L-グルタミン、100 IU / mLペニシリン（4.5グラム/ Lのグルコース）を100mg / mLのストレプトマイシン、250 ngの/ mLのアンホテリシンB、および50μMの2-メルカプトエタノール（2-ME; 1.1.1を参照してください）。混合し、他のすべてのコンポーネントを滅菌フィルタした後、FBSを追加します。 4 ^O℃で培養培地を保存します
   1. 50 mMの2-ME /リン酸緩衝生理食塩水（PBS）原液を準備します（ソリューションは^、4°Cので保存することができる滅菌28.6 1×PBSのミリリットル、およびフィルタに濃縮された2-ME（14.3 M）の100μLを追加数ヶ月）。 U培地の1,000 mLのためのSE 1 mLの2-MEの原液。
2. 密度勾配媒体の調製
   1. 1部の10倍、通常の滅菌PBSおよび9部の滅菌在庫密度勾配媒体（ 例えば、パーコール）から株式等張密度勾配培地溶液（ 例えば、100％パーコール）を準備します。
   2. 20％の密度勾配媒体（ 例えば、1×PBSの40mLの100％の密度勾配培地の10 mL）を作るために定期的な1×滅菌PBSで（1.2.1製）100％の密度勾配媒体を希釈し、4℃で保管し^℃。細胞培養物を調製する前に室温（RT）で20％の密度勾配媒体をもたらします。
3. パパイン解離システムからの溶液の調製
   注： パパイン解離システムは、材料表に特定することができます。 （社内で組み立てられたものを含む）、他の類似の解離キットを使用することもできます。すべてのcompone国税庁は無菌でなければなりません。
   1. オボムコイド阻害剤混合物（粉末）にアールの平衡塩溶液（EBSS）の32ミリリットルを追加します。
   2. 1パパインバイアル（粉末）にEBSSの5ミリリットルを追加します。 10分間またはパパインが溶解するまで37 ^{O Cの}水浴中でパパインバイアルを置きます。
   3. 1のDNaseバイアル（粉末）にEBSSの500μLを追加します。穏やかに混合します。
   4. パパインバイアルにDNase溶液（上記）の250μLを追加します。
   5. （マウス脊髄あたりパパイン/ DNアーゼ混合物の約800μL）に必要以上のパパイン/ DNアーゼ混合物の総量を計算し、組織消化（ステップ3.2）を50 mLのチューブに必要な混合物を移します。少なくとも2週間、4℃で、元のバイアル内の残り物を格納します。
   6. 必要になるまで氷上でキットからすべてのコンポーネントを置かないでください。
4. 脊髄コレクションチューブを準備します。1滅菌15 mLチューブを5 mLのハンクス平衡塩溶液（HBSSのと、パパイン解離システムから、脊髄を収集するための）および1×PBSで1無菌の15 mLチューブ（5 mLシリンジを埋めるために、ステップ2.4を参照のこと）; 0。また、HBSS 5mLで1滅菌ペトリ皿（35ミリメートルまたは60ミリメートル）を作製し、培養フードに保管してください。

2.脊髄コレクション

注：すべての機器は、無菌でなければなりません。 IACUCによって承認された指定された領域でコレクションを実行します。

1. 収穫マウスの脊髄のための以下のツールを入手：ストレートシャープ/ブラント18-cmの手術用はさみを、12-cmの標準メス（＃3固体）、炭素鋼滅菌メスの刃＃10、小動物decapitator、12-cmの標準曲線状鉗子、および滅菌20Gの針は5-mLシリンジに取り付けました。
2. CO ₂で動物を安楽死させると、70％エタノール（EtOH）中でマウスの頭部と背部を消毒。
3. decapitatorで動物を刎ねます。筋層を露出するために背中の下部の中央の縦切開を行います。作ります無菌ストレート手術用はさみ（19センチ）とヒップレベルで脊椎動物のカラムを通してクリーン離断（また、脊椎動物の列をカバーする筋肉層を切断します）。
4. ワイプ新鮮な使い捨てのシートの上に動物を置きます。慎重に吻側側に脊柱に（滅菌1×PBS（ステップ1.4）を充填した5 mLシリンジに取り付けられた）20 G針を挿入します。しっかりとダウン動物を持って、すぐに注射器を押してください。全体の脊髄は、子宮頸部の端から出てくる必要があります。 HBSSを含む15 mLのチューブに脊髄を収集します。
5. マウスの残りの手順を繰り返し2.4。各動物の間で、70％EtOHですべて使用される器具を消毒します。
   注：一般的に、単一の12ウェルプレートは、すべての4マウス脊髄（4.3を参照）のために確立することができます。

単一細胞懸濁液の調製

注：無菌のすべてを維持するために培養フードに手順3と4を実行します。

1. HBSS含有ペトリ皿（ステップ1.4）に、すべての脊髄を転送します。滅菌はさみやピンセットで多くの素晴らしい、小片に脊髄のそれぞれをカット。これはさらに、調製希釈れるように、滅菌鉗子または10mLのピペットを使用して調製パパイン/ DNアーゼ酵素混合物（ステップ1.3.5）を含む50mLのコニカルチューブに脊髄組織を転送する（酵素混合物にHBSSを追加しません酵素液と酵素のパフォーマンスが低下する場合があります）。
2. 混合するために穏やかにチューブをボルテックス。軌道は、150 rpmで振盪しながらインキュベーター/シェーカーで1時間^、37°Cのでチューブをインキュベートします。
3. ボルテックスチューブを再び激しくさらに解離を促進するために5mLのピペットを用いて組織を有する酵素液を粉砕します。
4. 室温で5分間、300×gで15 mLチューブと遠心分離機に細胞懸濁液を転送します。
5. 遠心分離中に、再構成されたアルブミン - オボムコイドINHの300μLで2.7 mLのEBSSを混ぜます滅菌チューブでibitor溶液（1.3.1）。 DNase溶液（ステップ1.3.3）の150μLを追加します。
6. 遠心分離後、上清を除去し、上記で調製した溶液（ステップ3.5）で細胞ペレットを再懸濁します。ウェル細胞ペレットを破る渦。
7. 細胞懸濁液に再構成されたアルブミン - オボムコイド阻害剤溶液（ステップ1.4.1）の3ミリリットルを追加します。室温で6分間、70×gで遠心分離した細胞。 （膜断片を含んでいる）、上清を取り除きます。

単一細胞懸濁液からのミエリンの4さらなる除去

1. ブレーキなしで RTで30分間、800×gで細胞をペレットを破壊するために優しく、細胞ペレットを含むチューブに渦を（ステップ1.2.2で調製した）20％の密度勾配媒体の8 mLを加え、遠心操作します。慎重に破片のトップ層（主にミエリン）、上清を除去したが、ペレットを保持します。
2. 密度勾配の残骸を削除するには、resuspendiによって細胞を洗浄希釈CDMEM（1部CDMEMと2部HBSS）の8 mLで細胞ペレットをngの。 4 ^O℃で10分間、400×gで細胞を遠心分離上清を除去し、同じように希釈したCDMEM（上記）で再度細胞を洗浄します。それらを播種するまで氷上で細胞を保管してください。
3. 上清を除去し、培養培地中の細胞ペレットを再懸濁（CDMEMは、付属の2-ME（ステップ1.1で調製しました））。 1 12ウェルプレートの場合は、3 mLの×4（使用したマウスの数）+ 2ミリリットル= 14 mLのメディアを使用しています。これは、全体のプレートに十分な細胞懸濁液（12ウェル）があることを確認し、ウェルあたりの平均細胞数と培養のミクログリアの内容を決定することができる余分のウェルのために提供されます。培養容器の他のタイプが使用される場合、比例的に必要とされる培地の総体積を計算します。
4. 12ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液1mlを加えます。
5. 5％CO ₂で^35.9°Cので細胞をインキュベートします。
はD 1上のメディアを（吸引経由古いメディアを削除）を変更し、その後、3。
注：1日目に、培養物を伴う脊髄組織から残留ミエリンへの破片のかなりの量を含んでいてもよいです。このように、1日目にメディアを変更するには、（より多くの情報のための議論を参照してください）をお勧めします。培養物を12 Dとの間で治療のための準備ができている - 14細胞は、通常、D 12で80％コンフルエントであり、典型的には、D 14で100％コンフルエントに近いことができ、D 12で、12ウェルプレート中のウェルあたり約100,000細胞が存在します。

図2：混合グリア文化の確立後の異なる時点での混合グリア細胞の代表的な画像初代脊髄混合グリアは、大人のC57BL / 6マウスから調製しました。代表的な画像めっき後グリア文化の進行状況が表示されます。 1日目に、いくつかの細胞を培養プレートに取り付けられ、彼らはまだほとんどがラウンドされています。多くの浮遊細胞および重要な破片もあります。 4日目に、細胞の大部分は培養プレートに取り付けられています。細胞は、可視プロセスと枝分かれ表示されます。細胞は、散発的に分布しているとの文化は、この時点で約20〜30％コンフルエントです。 8日目に、培養物を50〜60％コンフルエントの間です。文化の一部の地域では、細胞の大規模なパッチを持っています。文化の他の領域は、細胞の疎な成長を持っています。パッチ内のいくつかの細胞は、「正方形状」の外観を取ります。 12日目に、培養物を、80％コンフルエント（ここに示されている画像では約90％コンフルエント）で、または上回っています。セルは、この時点で対数増殖期にあり、12から14日の間は、実験のためにグリア細胞を使用するための最適な時間です。 ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。

7. 抗マウスCD45及び抗マウスのCD11bモノクローナル抗体の組み合わせを使用して、標準的な蛍光活性化セルソーティング（FACS）染色プロトコル^11を介して余分なウェルから細胞を（4.3ステップ）を使用して、ミクログリアの内容を調べます。 CD45 ⁺のCD11b ⁺細胞はミクログリアとして同定されます。

結果

この方法は、マウスおよびラットの両方からの混合グリア細胞を調製するために使用することができます。細胞は、マウス脊髄由来しているときに文化のD 12ポスト開始するときに、12ウェルプレート中のウェルあたりの平均総細胞数はウェルあたり約10万セルで、比較的安定であるべきです。この方法から得られたグリア細胞は、目的の物質および薬剤の投与の際に、成人脊髄グリア細胞応答を調べるために設計されている実験に使用することができる。 図3は、成人の脊髄ミクログリア典型的な一実験からのサイトカインおよびケモカイン応答の例を提供します成体BALB / cマウスから得て、培養物のD 13後開始のLPS（ サルモネラ・ミネソタ Re595）で処理しました。上清を、商業的にご利用できを用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を介してサイトカインおよびケモカインのレベルの決意24時間後にLPS処置を収集しましたルキット。

この...

ディスカッション

全ての工程、を含む、実験間の再現性のある結果を得るためにスケジュールで一貫した方法を変更するメディアを行うことが重要です。次の手順では、優れた品質の大人混合グリアを得る上で特に重要です。

酵素消化は、このプロトコルの重要な側面です。組織片は、単一細胞懸濁液を得るために十分に消化されることが重要です。しかし、過剰消化が有意に少ない細胞になります。各LABは、インキュベーションのために使用バイアルの種類に基づいて正確な消化時間を決定するためにパイロット試験を行う必要があり、平均組織量は毎回使用し、シェーカーのタイプ（オービタルシェーカーに対して回転します）。また、関係なく、選択されたパパイン解離システムの、部品の時折の置換が収量の大幅な変動につながる可能性として、一貫して同じソースから同じコンポーネントを使用することが不可欠です細胞の総数の。

このプロトコルでは、ミエリンは、密度勾配培地を用いて除去されます。これらのソリューションの密度は温度に敏感であるため、室温での密度勾配溶液を作製し、使用することが重要です。密度勾配溶液は、通...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダルベッコイーグルの修正 '4.5g/Lグルコースを含むs培地(DMEM)	ロンザ	12-709F	cDMEM培地は、広く利用されている標準的な培地です。個々の研究者は、DMEMおよびcDMEM培地の製造に使用される他のすべてのコンポーネントをどこで購入するかを決定できます。
L-グルタミン (100x)	Lonza	17-605E	L-グルタミンは、さまざまな培地に広く使用されている標準的な成分です。L-グルタミンをどこで購入するかは、個々の研究者が決めることができます。
抗生物質-抗真菌剤溶液 (100x)	Corning-Mediatech	30-004-CI	これは、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアムホテリシンの組み合わせで、10,000 単位/mL のペニシリン G、10 mg/mL のストレプトマイシン硫酸塩、および 25 μ;g/mL アムホテリシン B. 個々の研究者は、個々のコンポーネントをどこで購入するかを決定できます。
2-メルカプトエタノール (2-ME)	Sigma-Aldrich	M3148	A BioReagentは、細胞培養、分子生物学、電気泳動に適しています。
パパイン解離システム	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	このキットの個々のコンポーネントは別途購入できます。
Percoll	GE Health Care	17-0891-01	Percollは滅菌溶液として販売されています。原液のPercollは、必要に応じて再オートクレーブ滅菌できます。
ラボラインインキュベーター/シェーカー	バーステッド/ラボライン	MaxQ4000	これが現在私たちが持っているインキュベーター/シェーカーです。代わりに他のタイプのシェーカーを使用することができます。
リポ多糖類、サルモネラ ミネソタ Re595	Sigma-Aldrich	L-9764	LPSの他の株もグリア応答を誘発することができます。ただし、回答の大きさは異なる場合があります。
マウス IL-6 DuoSet ELISA	R&Dシステム	ズDY406	お好みのELISAキットをお選びいただけます。
マウス TNF-α DuoSet ELISA	R&Dシステム	ズDY410	研究者一人ひとりがお好みのELISAキットをお選びいただけます。
マウス IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA	R&Dシステム	ズDY466	ELISAキットをお選びいただけます。
マウス MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set	BD Biosciences	555260	個々の研究者は、自分好みのELISAキットを選択できます。
マウスケモカイン Q-Plex	Quansys Biosciences	120251MS	この製品は、当時、社内アッセイには利用できませんでした。代わりに、サンプルをメーカーに送って分析してもらいました。
APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)	eBioscience	17-0451	他のベンダーの同じクローンの抗体を使用できます。
FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)	eBioscience	11-0112	他のベンダーの同じクローンの抗体を使用できます。
Accuri C6 フローサイトメーター	BD Biosciences	BD Accuri C6	個々の研究者は、自分好みのフローサイトメーターを使用することができます。
FlowJoソフトウェア	Tree Star, Inc.	FlowJo7.6.5	個々の研究者は、自分好みの分析ソフトウェアを使用できます。

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