網膜下腔にアクセスするための代替と検証済みの注入方法経由で経強後方アプローチ

Summary

網膜下注射は、タンパク質やウイルスベクターなどの大きな治療薬を光受容体や網膜色素上皮に送達するための最も一般的な技術です。ここでは、付随的な損傷を最小限に抑え、迅速な回復時間で網膜下腔をうまく標的とするマウスの代替方法について説明します。

Abstract

網膜下注射は成功し、感光体への直接曝露し、網膜色素上皮（RPE）を持つinterphotoreceptor /網膜下の区画へのタンパク質の治療的介入、ウイルス剤、および細胞を送達するために、ヒトおよびげっ歯類の両方で使用されてきました。プラスミノーゲンの網膜下注射、ならびに最近の前臨床および臨床試験は、進行網膜疾患を有する個体にウイルスベクターおよび幹細胞の送達の安全性および/または有効性を実証しています。網膜疾患、特に遺伝性網膜ジストロフィーのマウスモデルは、これらの治療を試験するために不可欠です。げっ歯類で最も一般的な注入手順は、網膜の前方アプローチで小経角膜または経強切開を使用することです。このアプローチでは、注射針は、感覚神経網膜は、基礎となるRPEを中断し、挿入時に簡単にニックレンズは、非侵襲imagiのレンズ混濁や障害を引き起こすことができます浸透しますngの。経強を経由して網膜下腔へのアクセス、後方アプローチは、これらの問題を回避：針は、網膜浸透せず、視神経から約0.5mm強膜を横断し、硝子体を破壊し回避することができます。巻き添え被害は、焦点強膜切開と過渡、漿液性網膜剥離の影響に関連したものに限定されています。この方法の簡単さは、眼の損傷を最小限に抑え、迅速な網膜再付着し、回復を確保し、低故障率を持っています。最小限の網膜の損傷およびRPEは、有効性の明確な評価と治療薬自体の直接的な効果を可能にします。この原稿は、ウイルスベクター、薬剤、高い有効性、最小限の損傷、および高速回復を有するマウスにおける網膜下腔への細胞または人工多能性幹（iPS）細胞を幹細胞を標的化するために使用することができる新規な網膜下注入技術が記載されています。

Introduction

網膜下注射は、光受容体と基礎となるRPE ^1,2に及ぼす影響を研究するためにマウスの網膜に細胞およびウイルス薬剤を送達するための主要な手段です。マウスのほとんどの網膜下注入プロトコルは、経角膜や赤道に経強注射部位の前方（ 図1）を使用します。このアプローチは、レンズのニッキングし、得られた白濁、感覚神経網膜および虹彩、網膜出血、実質的な網膜剥離と永続的な網膜下浮腫^3-9の硝子体、浸透の完全性の破壊を含み、固有の巻き添え被害をもたらすことができます。実験操作は、治療的介入^3,7,10,11の効果を評価するために、これらの影響を克服しなければなりません。この研究では、これらの合併症を回避する後方経強注入法の詳細な説明および検証を提供し、外傷を最小限にし、サブ標的の高い成功率を有しています網膜スペース。

マウスにおいて、網膜下腔をターゲット注射は、多くの場合、実行するのが非常に困難であり、ほとんどの研究者は、ベクターが誤った場所に配信されているか、重要な網膜の損傷があり、完全な網膜剥離⁶で例えばこれに失敗した試行の高周波を発生します。なぜなら注入合併症の分析から除外した目の数は、典型的には、マウスの研究で報告されていませんが、私たち自身の経験にし、他の研究者との議論では、失敗した注射の数は50％もの高さと経験に依存して変化させることができ、注射を行っている研究者の能力。注射の成功は、典型的には、直接眼底イメージングおよび/または光コヒーレンストモグラフィー^（OCT）7,9によって評価されます。マウスでの網膜下注射のための高い成功率で簡単に習得方法の実験を早めるとTREの前臨床試験のコストを削減することができます米国における失明の主要な原因である網膜疾患のためatments。

後部、ここで説明する経強網膜下注入技術は、臨床および前臨床プロトコル^9,12から適応したものです。注射したマウスで行われ、非侵襲的診断評価は軽度と高度に局在化損傷を示し、追加担保レンズ、網膜およびRPE損傷を欠いています。それにより、このような研究に関連するコストを低減すること、 - （90％以上80）さらに、比較的少ない練習で、実験者は、高い成功率と、これらの結果を達成することができます。この手順は、細胞、ウイルス、または前臨床試験における光受容体および/またはRPEへの薬理学的治療介入を提供するために、容易に実験的介入を評価するために使用することができます。

Protocol

動物：カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）で飼育野生型C57BL / 6Jマウス。 17週齢、雄と雌のマウスが含まれて - 全ての動物は、11の間でした。全てのマウスは、グループに収容され、食物および水を自由に摂取して12：12明/暗サイクルで維持しました。全ての実験は、眼科及び視覚研究における動物の使用のためのUCLAとビジョンでの研究のための協会と眼科文の機関のガイドラインに従って行われました。

注：すべての薬や注射用薬剤は、米国薬局方（USP）グレードです。

1.外科の準備

1. 100mg / kgのケタミンおよび生理食塩水の混合物中に8mg / kgのキシラジンの腹腔内注射でマウスを麻酔。マウスは全くつま先のピンチや角膜タッチ反射を持っていないような深さに麻酔を管理します。
2. 循環水パッドと37.0℃の体温を維持。
3. 2.5％フェニレフリンアイdの生徒を拡張ROPSと可視化を容易にするために、ウィスカーをトリミング。ひげは、マウスに重大な感覚入力を提供し、したがって、ウィスカートリミングは、眼へのブロック明確なアクセスものではなく、ウィスカのベースに一部のみを削除する必要があります。我々の経験では、マウスは、この手順の後に通常の回復を示しています。メチルセルロースの目が乾燥を防ぎ、麻酔誘発される一過性白内障^13を最小限に抑えるために低下し適用します。
4. 手術前に器具を滅菌する（ すなわち、ベタジンおよびエタノールまたはホットビーズ）。
5. 可視化が実行される場合（下記のセクション3を参照）を無菌環境（ すなわち 、安全キャビネット）に（0.9％生理食塩水を使用して0.01％）で希釈フルオレセインを準備します。

2.インジェクションサイトの準備

1. 適切な注入量（ 例えば 、0.3から1.0マイクロリットル）を有するシリンジ（ 例えば 、5μlのシリンジ）を準備します。
2. 目が上向きおよびジではっきりと見えるようにマウスを置き顕微鏡をssecting。
3. 優しく細かい傾いてピンセットで時間的結膜を挟ま。湾曲したVannasはさみを用いて、約90度の周方向の切開を行います。
4. 根底にあるテノン嚢と繰り返し手順2.3。
5. 経鼻的に地球を回転させながら、微細な先端鉗子で周囲の結合組織を切除。視神経への一時的な注射部位約0.5ミリメートルに取り組みます。眼窩の中断を避けるために細心の注意を使用してください。

3.強膜切開および網膜下注射

注：この手順を学習しながら、0.9％の生理食塩水で0.01％のフルオレセインの注入は、可視化を支援するために使用することをお勧めします。フルオレセインの地形分布が効果的に眼底イメージング（以下のセクション4を参照）で文書化することができます。

1. 優しく22.5度眼科刃でアイカップを掻くことにより、注射部位での小強膜切開を行います。この切開ショウ唯一の針の先端は、強膜を通過することを可能にするのに十分な大きさで、LD。
2. 面取り33 G針を挿入します（5角度を付ける-ベベルの対面と網膜に傾斜した平行な強膜切開に10°を所望の容積（目的を学習するための0.01％フルオレセインの例えば、0.3〜1.0μl）を注入します。
   注：完全に各注射の前に、連続した適切な溶媒の洗浄およびDI水で洗浄することにより、注射器の無菌性を維持します。
3. 針を動かすことなく、さらには圧力でゆっくりと（〜3秒以上）プランジャーを押し下げます。
   注：針が網膜下腔にあるとき、プランジャを押しながら、わずかな抵抗が感じられるだろう。針が強膜またはRPEに浸透していない場合は、針が網膜、および高抵抗を穿刺する場合、最小の抵抗に全く存在しないであろう。
4. 逆流を最小限に抑えるために、針を引き抜く前に、数秒待ってください。
5. 滅菌緩衝生理食塩水で目を洗浄し、目の時間を確保します通常の位置に戻って回転させました。

10月と眼底イメージングによって網膜剥離の4評価

1. 注射の質を評価するために、注射直後OCT撮像を行うと網膜の構造を評価するために、必要に応じて適切なタイミングでポスト噴射を指します。
   注：同様の研究において、OCTの使用の例は先に^7,14に記載されています。
   1. 調整し、注射部位を標的とするためにOCT画像の位置を合わせます。注射部位は正中線と視神経乳頭への一時的な0.5ミリメートルでなければなりません。必要に応じて剥離がフレーム外であるか、最適に中央にない場合は繰り返します。
2. 網膜剥離を視覚化し、専用の顔眼底イメージング^7,14に注入領域を染めます。
   注：OCT撮像システムが利用できない場合は、練習用ベクターとフルオレセインの少量の注入は、フルオレセイン血管を行う任意の眼底カメラと可視化を可能にします同じ励起波長ブロッキングフィルタを使用グラフィー。ハイパー蛍光の局所領域は、血管系の下に表示され、網膜下腔が正確に標的された場合、血管系は、シャープと明確な境界を持っています。注射からブレブのエッジはハイポ蛍光へのハイパーからの移行で区画されます。いくつかの機器は、マウスのためのこの機能を提供します。ここで使用される機器は他の場所¹⁴に記載されています。

5.術後ケア

1. 注入された眼の角膜表面に三重の抗生物質眼科クリームの厚いコートを適用します。
2. 回復のためのクリーンな孤独なケージにマウスを置きます。彼らは完全に回復されるまで、手術を受けたマウスを結合しないでください。
3. 麻酔回復時の呼吸と温度を監視します。彼らは胸骨横臥位を維持することができるまで、動物を監視します。
4. 追加の適切な術後の監視を行いますそして術後疼痛管理のためのカルプロフェンの皮下注射（5ミリグラム/ kg）を含む治療。

電図による網膜機能の6.アセスメント（ERG）

1. ERG分析プレ噴射を実行し、適切な時間に網膜機能を評価するために、必要に応じてポスト噴射。注射は網膜下腔に行われた場合、網膜剥離は、72時間以内に解決する必要があります。
   1. 以前に^14,15を説明したように、注射の前と後の網膜機能を評価するための標準的なERG技術を使用してください。

7. 3D復興胞ボリューム定量化

注：ビューの枠内全体剥離を網羅する高コントラストの10月スキャンが使用するために最適です。 ImageJの/フィジー^17,18とIMARIS使用したが、他のソフトウェアを使用することができます。

1. 関心のBスキャンをエクスポートし、ImageJを/フィジーと作物（イメージ>クロップ）10月SCの部分へのインポート長方形の選択ツールを使用してモデル化します。
   1. コントラスト調整（イメージ>>明るさ/コントラストを調整）し、ラインを持つ2つのセクションを接続することにより、欠落している境界線を描きます。
   2. 感光層へのRPEにまたがるラインツール（保持シフト）の直線を描画します。メジャー（測定>分析）ラインの長さは、ステップ7.8の最大剥離のサイズを取得します。
2. インポートは、「RGBグレーに「プラグインとのMATLAB Compiler Runtimeを使用して（材料の表を参照してください）3D-再構築ソフトウェアにフレームをクロップ。
3. OCTスキャン（X、Y、Z）から較正パラメータを用いて、（画像のプロパティの下）のボクセルサイズを設定します。
4. 第4流路を作成するために、各チャネルに等しい重みで、（画像のプロパティの下）「RGBグレーに「プラグインを実行します。オリジナルの赤 - 緑 - 青のチャンネルを削除します。
5. コントラスト変化を使用して、灰色のチャネルを反転。店舗イメージ。
6. "[追加]をクリックします3Dビュー]タブでEW面」ボタン、および表面を作成するためのガイド付きの4段階のプロセスを開始します。
   1. 表面レベルの詳細（ステップ4の1）を設定します。
      注：我々の経験では12.0から8.0が最も効果的な範囲でした。
   2. 7.1.2で測定された最大剥離のサイズよりやや少ないに（背景の選択の下で）最大球サイズを設定します。灰色のチャネル反転（ステップ4の2）の表面を作成し、元に戻します。
   3. 網膜の外側に負のスペースと剥離の表面が接触（4のステップ3）で来ることはありませんので、最大値にしきい値を設定します。
   4. ボクセルの数にフィルタタイプを設定し、サイズによって剥離サイト内の負の空間を分離します。表面（ステップ4の4）を終了します。
      注：剥離面のボリュームが統計]タブにボリュームの下に位置しています。

Results

アプローチの後方経強網膜下注射は（N = 8）、1.0μL（n = 5）を、0.01％のフルオレセイン0.5μL、0.3μL（N = 18）の注射で16野生型マウスからの31の健康な眼に対して行いました。一つ目は、原因の構造と機能解析を防止し、既存の角膜混濁に注入から除外されました。すべての注入された目は、このレポートに含まれています。意図しない網膜剥離は、硝子体への神経感覚網膜、または漏れの穿刺は検出されなかったにも観察された任意の目のレンズニッキング、炎症反応、ブドウ膜炎、または手術後の感染の証拠がありました。

網膜の構造は、注入前、10分の注射後4週間のOCTイメージングを用いて、注射後（ 図2及び3）を評価しました。 9点の格子は、最大剥離の中心の上に位置する中心点で、10分間に置きました顔スキャン（ 図2B） エンポスト噴射。血管のランドマ...

Discussion

網膜下注射は、ウイルスベクターの送達のための選択の方法であり、光受容体と基礎研究と臨床治療の両方でRPEを操作するための幹細胞を利用した治療法。患者では、網膜下注射は一般的に、直接可視化と針で、扁平部で前部強膜切開と網膜の後部コア硝子体切除術と浸透を行っています。目が偽すでにある場合を除き白内障形成が途中で発生するための最も硝子体切除手順と同じように、それが一般的です。マウスでは、網膜下注射は伝統的に、網膜への強膜切開の前方で頻繁に眼の後部空洞の大部分を占めるレンズのニッキング、および硝子体捕捉し、フルにつながることができ経網膜浸透の両方に関連した方法を行っています網膜剥離。マウスにおける後方接近法を使用すると、これらの望ましくない影響を低減し、EFを解釈する能力を向上させます意図された操作のfects。

ここで報告網膜下注入技術の利点は、最小限の構造的または機能的効果と減少巻き添え被害を含む（ 例えば、レンズニッキング、硝子体漏れや炎症から曇り）実験の結果およびより速い回復時間のより容易な評価を可能にします。この技術は後極に到達するために、目の大きい操作を必要と...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ハミルトンモデル62 RN SYR	ハミルトン	87942	シリンジ×1
ハミルトン針33 G、1.0 "、20度、ポイント3(304ステンレス鋼)	ハミルトン	7803-05	針×6
ヴァンナス湾曲はさみ	テッドペラ、INC.	1347	5 mmブレード
22.5度マイクロサージェリーナイフ	ソン眼科株式会社	91204
ケタジェクト	フェニックス	NDC 57319-609-02	ケタミン
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	キシラジン
フルオレセイン 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 mg/ml
0.9% 生理食塩水 USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0.9% NaCl
抗生物質軟膏	Akorn	NDC 17478-235-35	眼
科用水循環ポンプ	Gaymar	TP-500 T/ポンプ	品番 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	Rシリーズ	業務用
眼底カメラ	フェニックス研究所	MICRON III
ピンセット Type 3	テッド・ペラ	5385-3SU
2.5% フェニレフリン	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	眼科
用IMARIS8	ビットプレーン		バージョン 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Hypromellose 2.5%	Goniovisc	AX0401	メチルセルロース
点眼薬(リンス)	Bausch &Lomb		Saline Solution
Microscope	Zeiss	Stemi 2000	顕微鏡
光源	Fostec	P/N 20520	光源