バイオフィルム感染症は、化学療法に対して高い耐性を示します。バイオフィルムの複雑さを捉える単一のアッセイはありません。代わりに、補完的なアッセイが必要です。生存率、バイオマス、およびバイオフィルムマトリックスのアッセイを組み合わせたスクリーニングプラットフォーム(黄色ブドウ球菌用に開発された)を紹介します。これにより、長期的な化学療法効果の評価を含む、抗バイオフィルム創薬が可能になります。
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この記事について
サマリー
要約
バイオフィルムは、現代の生物医学の最も困難な課題の一つと考えられている、と彼らは、潜在的に抗生物質耐性の感染症の80％を担っています。バイオフィルムは、多因子性であると考えられている化学療法に対する非常に高い耐性を示しています。例えば、マトリックスは、バイオフィルムへの抗生物質の浸透を減少させる物理的なバリアを提供します。また、バイオフィルム内の細胞は、表現型が多様です。そう、バイオフィルムの回復力は、これらおよび他の、未知の機構の組み合わせから生じます。現在、既存の抗生物質の全ては、単一細胞（浮遊性）細菌に対して開発されてきました。そのため、これまでのところ、分子の非常に限られたレパートリーは、それが選択的に成熟したバイオフィルムに作用することができる存在します。この状況は、抗バイオフィルムのための検索は、より目立つ場所を占めるように促しされた薬物の発見における漸進的パラダイムシフトを、推進してきました。追加の課題があるということですバイオフィルム研究のための標準化された方法、化学ライブラリーの大スループットスクリーニングのために使用することができる特に、非常に限られた数。ここでは、化学物質のスクリーニングのための実験的な抗バイオフィルムのプラットフォームが提供されます。それは、（レサズリン染色）バイオフィルムの生存率を測定するための3つのアッセイを使用しています（クリスタルバイオレット染色）総バイオマス、およびバイオフィルムマトリックス（ポリN -アセチルグルコサミンのコムギ胚芽凝集素を使用して、WGA-蛍光ベースの染色、PNAG 、分数）。すべてのアッセイは、モデル菌として黄色ブドウ球菌を使って開発されました。プラットフォームは、一次スクリーニングのために、ならびに同定された抗バイオフィルムヒットの機能的特徴付けのために使用することができる方法の例が示されています。この実験的なシーケンスは、さらに測定のエンドポイントに基づいて、ヒットの分類を可能にします。また、特に短期化学療法の効果に対する長期的に、それらの作用モードの情報を提供します。したがって、それは非常にアドバです様々な生物医学的応用のための出発点として機能することができ、高品質のヒット化合物の迅速な同定のためのntageous。
概要
細菌はバイオフィルムは、最も一般的な例となっている2つの非常に異なる生活様式、プランクトンや固着、切り替えることができます。バイオフィルムでは、細菌はセルフプロデュースマトリックス1に埋め込まれた構造化されたコミュニティを形成します。この自己生産マトリックスは、細菌とその外部環境との間の障壁であり、それは近接してそれらを維持する、微生物細胞を保護します。バイオフィルムマトリックスの組成物は、間にあっても種内で変化するが、それは主にリポ多糖、細胞外DNA、およびタンパク質の緊密なネットワークで構成されています。マトリックスは、有害物質の進入を阻害する物理的障壁として働くが、それはまた、脱水からバイオフィルムを保護し、セル2から逃げるの栄養素を防ぐことができます。
バイオフィルムは、現代の生物医学の最も困難な課題の一つとみなされ、それらは、抗生物質耐性の感染症3の80％以上のためのうわさによれば、責任があります。彼らは、DISP湿度、浸透圧、機械的ストレス4、熱、UV照射5、殺菌剤、抗菌剤、および宿主免疫系1：外部の脅威から本質的に高い耐性を築きます。例えば、バイオフィルムを殺すために必要な必要な抗菌剤の濃度は、浮遊細菌を死滅させるために必要なものと比較して最大で1000倍高いことが示されています。この高い耐性についての説明は、多因子であると思われます。マトリックスは、バイオフィルムへの抗生物質の浸透を減少させる物理的なバリアを提供します。また、バイオフィルム内の細胞は、表現型が多様です。それらが原因のバイオフィルム6の内側と外側の部分との間の酸素、栄養素、および代謝産物の既存の勾配に異なる代謝状態間の遷移します。したがって、このようなコアのようないくつかのバイオフィルム領域において、細菌は、酸素と栄養を奪われていると代謝活性の低いまたは完全に休止状態に住んでいます 7。完全に休眠細胞は存続細胞と呼ばれ、それらは、従来の抗菌治療8の影響を受けやすいものではありません。従って、バイオフィルムの回復力は、現在提案及び他の、未知の機構の組み合わせから生じる可能性があります。 ブドウ球菌属 。厳しい、多くの場合、バイオフィルム関連、感染4を引き起こし、最も問題とグラム陽性菌の中ではまだです。すべての細菌の最大99％がそれ優勢な細菌のライフスタイル3作り、バイオフィルム内に関連していることが示唆されています。しかし、現在、既存の抗生物質のすべては、単一細胞（浮遊性）細菌に対して開発されてきました。これまでのところ、分子の非常に限られたレパートリーは、それが選択的に成熟したバイオフィルムに作用することができる存在します。この状況は、抗バイオフィルムのための検索は、より目立つ場所を占めるように促しされた薬物の発見における漸進的パラダイムシフトを、推進してきました。
methodologからiCalの斜視バイオフィルム法の限られた数だけが、標準化団体、化学ライブラリーのハイスループットスクリーニングに適用特ににより開発されているように、追加の課題が存在します。 （唯一の1つの例外を除いて）すべての標準化されたアッセイは、バイオフィルムリアクターに基づいて、これらの方法は、通常、初期の治験段階9-12中は利用できません大きな作業量と試験すべき化合物を大量に必要としています。唯一の既存の標準化されたスクリーニング-適用アッセイは、市販の最小バイオフィルム排除濃度（MBEC）システムは13-15を開発された、いわゆるカルガリーバイオフィルムデバイス、です。しかし、このアッセイの制限は、バイオフィルムは、ペグ上に成長しており、すべての細菌種または同じ種内でも株はないが、この装置にバイオフィルムを形成することができるということです。また、特に、天然化合物の探索にも適用することができる方法であります必要に応じて。天然物は、前世紀16以上の抗菌薬の発見の革新のための主要な源となっています。彼らはまた、存続細胞に対して有効であることができるユニークな作用機序を有する新規抗バイオフィルム化合物を提供することができます。このように、自然と自然にインスピレーションを得たライブラリの探査は、有望な、ユニークな抗バイオフィルムリードを製造する高い可能性を持っています。
ここでは、 黄色ブドウ球菌のバイオフィルムの生存率、総バイオマス、およびマトリックスに対する効果を測定するための3つのアッセイを用いて、抗バイオフィルム化合物の化学的スクリーニングのために開発されたアッセイのプラットフォームの実験の詳細を提示します。第一のアッセイは、バイオフィルムの生存率を測定し、それはレザズリン染色に基づいています。レサズリンは、その酸化状態にある青と非蛍光であり、細菌の代謝活性によって減少するとき、ピンク、蛍光性の高いレゾルフィンになるレドックス染色です。これは非常にシンプルかつ高速メートルです一次スクリーニング17-20に適しethod。クリスタルバイオレット染色に基づく第2のアッセイは、全バイオフィルムの質量を測定します。クリスタルバイオレットは、バイオフィルム19,21-23中の細菌や細菌を研究するために広く使用されている染色です。アッセイは、安価な試薬に基づいており、単純な吸光度エンドポイント測定値を有しています。最後に、第3のアッセイは、ブドウ球菌のバイオフィルム24のマトリクス中に存在するN-アセチルグルコサミン残基（PNAG）をポリ-するために特異的に結合するコムギ胚芽凝集素（WGA）を介して細胞外高分子物質（EPS）バイオフィルムの-マトリックスを対象としています。 WGAは、蛍光強度リーダ25を用いて検出することができるフルオロフォアとコンジュゲートされています。ここでは、我々はアプリケーションの例を含め、開発プラットフォームの根拠と詳細を提示します。
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プロトコル
1.細菌の成長
- 一晩振とうを220rpm（16-18時間）と37℃でのトリプシン大豆ブロス（TSB）で前培養菌。
- 光（新鮮なTSBに、（ここでは、1000倍の黄色ブドウ球菌のために使用された細菌の増殖速度に依存する）及び指数増殖に達するために、それは37℃、200rpmで成長させて前培養100〜1,000倍に希釈0.2と0.6）の間の595nm（OD 595）での濃度。
注：このステップは、株特異的な最適化を必要とします。
2.バイオフィルム形成：前後の暴露
- （これはミリリットル当たり約10 6コロニー形成単位（CFU / ml）を等しい）指数関数的に増殖させた培養液100倍に希釈します。
- 前露光プロトコル
- 未処理の対照サンプルについては、滅菌96マイクロウェルプレートのウェルあたり希釈した細菌培養液200μlを追加します。
- 試験化合物またはコントロールの4μLを追加抗生物質（50倍ストック溶液）とウェルあたり希釈した細菌培養物の196μlの。
- 18時間200rpmでプレートシェーカー上で37℃でそれをインキュベートします。
注：ここでは、2ミリメートル軌道でシェーカーを使用しています。
- 露光後のプロトコル
- すべてのサンプルについては、滅菌96マイクロウェルプレートのウェルあたり希釈した細菌培養液200μlを追加します。
- 18時間200rpmでプレートシェーカー上で37℃でそれをインキュベートします。
注：ここでは、2ミリメートル軌道でシェーカーを使用しています。 - マルチチャンネルピペットを使用して、バイオフィルムに触れることなく、慎重に全体プランクトンソリューションを削除します。
- 試験化合物または対照抗生物質（50×ストック溶液）とウェル当たりTSBの196μlと4μLを加えます。
- さらに24時間、200rpmでプレートシェーカー上で37℃でそれをインキュベートします。
注：ここでは、2ミリメートル軌道でシェーカーを使用しています。
3.レサズリン染色Protocoバイオフィルムの生存率評価のためのリットル
- 滅菌PBS中0.1mg / mlのレサズリン（0.4ミリモル）のストック溶液を準備します。 、滅菌この株式を保持し、露光から保護し、そして4℃で。
- 20μMの最終濃度を達成するために、無菌のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でレサズリンストック1:50に希釈します。
- マルチチャンネルピペットを用いて、別々の、きれいな96ウェルプレートに、バイオフィルムを触れたり、気泡を作成せずに、慎重に（ウェル中のバイオフィルムを残して）全体プランクトンソリューションを転送します。
- ウェルあたり200μLを添加することにより、滅菌PBSで一度バイオフィルムを洗浄し、そして慎重にマルチチャンネルピペットを使用して、それを削除してください。
- マルチチャンネルピペットを用いて、バイオフィルムプレートのウェルあたり希釈レサズリンの200μLを加えます。
- 未処理のバイオフィルムコントロールが均等にピンク色になるまで約20分間振とうし、室温（RT）、および200 rpmで、暗闇の中でそれをインキュベートします。
- で蛍光を測定しますEXC = 560 nmおよびλEMがプレートリーダー（トップリーディング）と590 nmのを=λ。
ステップ3のように同じプレートを使用したバイオフィルムのバイオマスの定量化のための4クリスタルバイオレット染色プロトコール
- マルチチャンネルピペットを用いて、ウェルから慎重にレサズリンの汚れを取り除きます。
- 15分間のメタノール200μlでバイオフィルムを固定してください。
- 10分間のプレートの空気が乾燥してみましょう。
- 慎重にマルチチャンネルピペットを使用して、クリスタルバイオレット溶液（体積/体積、脱イオン水で希釈した）0.02％の190μLを加えます。ピペッティングしながら染色でウェルの側面に触れないようにしてください、ブローアウトを完了するために、ピペットを押していないことにより、気泡の形成を防止します。
- RTで5分間それをインキュベートします。
- マルチチャンネルピペットを使用して、慎重に汚れを除去します。
- 脱イオン水（各時間μlの200）で2回、それを洗ってください。
- ウェルを室温で5分間乾かし、残りの汚れを溶解96％エタノールまたは33％の酢酸です。
- RTで1時間のためにそれをインキュベートし、595nmで吸光度を読み取ります。
5.バイオフィルムと同様のサンプルプレートを使用した浮遊性細菌の殺菌効果の評価
- 3.3から浮遊性溶液を用いて、プレートの595nmでの濁度を測定します。
- ウェル当たりレサズリンの株式の10μLを添加することにより、レサズリンと浮遊性細菌を染色。ピペッティングでよく混ぜます。
- 未処理のコントロールが均等にピンクになるまで、約5分間、室温で暗闇の中でそれをインキュベートします。
- λEXC = 560nmで蛍光を測定し、λEMが 590 nmのを=。
マトリックス定量化とバイオフィルムの蛍光顕微鏡イメージングのための6コムギ胚芽凝集素染色
- 行列の定量化
- 滅菌PBS中のWGAプローブの5μg/ mlの溶液を調製します。
- 並列サンプルナンプラーを使用しますこの染色のためのテ。井戸からプランクトン溶液を除去し、慎重にバイオフィルムを触れることなく、マルチチャンネルピペットを使用して、無菌PBS（ウェル当たり200μlの）で1回洗浄します。
- 染色するウェル当たりWGA溶液200μlを追加します。
- 2時間4℃で暗闇の中でそれをインキュベートします。
- PBS200μlの3回でウェルを洗浄することにより未結合の汚れを取り除きます。
- RTで15分間プレートを乾燥させてください。
- ウェルあたり200μlのを使用して、33％酢酸中で結合した汚れを溶解します。
- ストリップキャップでウェルを密閉し、室温で30秒、40 kHzのための水浴超音波処理を使用してそれらを超音波処理します。
- 室温で1時間静置します。
- 超音波処理の手順を繰り返します。ウェルは、超音波処理工程の間に封入されたままにすることができます。
- λの元 = 495 nmで蛍光を測定し、λEMプレートリーダー（トップリーディング）と520 nmのを=。
- マトリックスとの可視化蛍光顕微鏡検査法
- ステップ6.1.6まで上記と同じプロトコルを使用してください。
- 乾燥工程の後、FITCフィルター（または別の適切な緑色励起フィルタ）を用いて、蛍光顕微鏡を用いて試料を可視化。
蛍光顕微鏡およびシグナルの定量化とイメージングのためのバイオフィルム内の7染色生存細胞と死細胞のグリーン・ツー・赤比（G / R）のための
- 蛍光顕微鏡でのイメージング
- メーカーのガイドラインに従って、各プローブ（1染色生存細胞および他の1染色死細胞）の溶液を調製します。
- 井戸からプランクトン溶液を除去し、マルチチャンネルピペットを用いて、無菌PBS（ウェル当たり200μlの）で1回洗浄します。
- ウェル当たりの染色液の6μlを添加します。
- 15分間、暗闇の中でプレートをインキュベートします。
- 顕微鏡検査の前に、余分な液体mを削除しますanuallyマルチチャンネルピペットを使用して。
- 例えば、FITCフィルター（緑色蛍光のために、生細胞）またはTRITCフィルター（赤色蛍光、死細胞）を用いて、蛍光顕微鏡を用いて画像を捕捉します。
- 緑色〜赤色蛍光比（G / R）のようなシグナルの定量化
- ステップ7.1.1と7.1.2と同じプロトコルに従ってください。
- ウェル当たりの染色溶液200μlを加え、暗所で15分間、それらをインキュベートします。
- 励起/発光波長の緑色と赤色蛍光のための535分の485 nmおよび635分の485、それぞれ（上読み）でプレートリーダーで蛍光を測定します。
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結果
提案されたプラットフォームでは、生存力、バイオマス、およびバイオフィルムマトリックスへの影響を定量化しています。作業配列（ 図1）においては、一つのサンプルプレートを同時に細菌性バイオフィルムの生存率に、全バイオフィルムのバイオマスへの影響を評価するためにクリスタルバイオレットでレサズリンと、続いて染色します。それはレサズリンとの最初の染色は、クリスタルバイオレットプレートの間の最大信号の吸光度単位の比較のためにクリスタルバイオレット染色結果の統計的に有意な影響（p = 0.4149で別々に染色したことが以前に実証されたので、両方のアッセイは、同じプレートで連続して行うことができ、または染色をレサズリンした後、N = 20）26。浮遊性細菌に対する効果を同時に評価することができます。
ヒットは生存能力やバイオマスベースのアッセイのいずれかから識別されると、第2のプレートがstがあ...
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ディスカッション
同時に生存力、バイオマス、およびバイオフィルムマトリックスに対する化合物の効果を測定することができる単一の方法はありません。したがって、好ましくは、一次スクリーニング段階で三のエンドポイントへの影響を検出するためのアッセイを組み合わせる必要があります。
レサズリンは、レドックスプローブの添加のみからなる非常に単純な染色プロトコルです。しかし、レサズリンとバイオフィルムの最適なインキュベーション時間を確立することは、このアッセイの成功に不可欠です。他の人にそれが数時間19を最後にすることができますしながら、いくつかの細菌株では、ピンク、蛍光レゾルフィンにレサズリンプローブの減少は、非常に迅速に発生します。また、同じ細菌株内で、また、プランクトン細菌とバイオフィルムとの間に有意な違いがあるかもしれません。浮遊性細菌は、典型的には、より簡単に細菌密度は、バイオフィルムの経口よりもプランクトン集団が低い主な理由は、到達しています反応の速いターンオーバーを促進するpulations、。バイオフィルムの生存率染色プローブの公開された比較では、レサズリンが最も正確な使用...
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開示事項
著者には開示すべき利益相反はありません。
謝辞
著者は、彼の研究室での撮影プロセスの間に彼のサポートのための教授ポールコスとLMPH、アントワープ大学、ベルギーに感謝します。この作品は、フィンランドのプロジェクトアカデミー（272266と282981を投影）とスヴェンスカTekniska Vetenskapsakademien私フィンランドによって賄われていました。修士課程Janniクジャラの技術的な貢献が認められています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| レサズリン | シグマ アルドリッチ | R7017 | |
| クリスタルバイオレット | シグマ アルドリッチ | HT90132 | |
| 小麦胚芽凝集素、Alexa Fluor 488コンジュゲート | サーモフィッシャーサイエンティフィック | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | 分子プローブ | L7012 | SYTO 9 生細胞を染色するための緑色および死細胞を染色するためのヨウ化プロピジウム 赤色 |
| リン酸緩衝生理食塩水 | |||
| トリプトン大豆寒天 | 培地 Lab M、Neogen | LAB011 | |
| Tryptine 大豆 broth | Lab M、Neogen | LAB004 | |
| F96 ウェルプレート ポリスチレン 滅菌透明平底 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 161093 | |
| ブランドキャップ、8シ | グマアルドリッチ | BR781413-300EA | |
| のストリップ ブランソンCPXシリーズ超音波バス | シグマアルドリッチ | Z769428-1EA | |
| マルチピペット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ||
| マルチドロップディスペンサー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ||
| メック3000 | ベックマンコールター | ||
| Varioskan Flash マルチプレートリーダー | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
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