ハイスループットは、ロボットに温度に敏感な致死変異体の単離を支援しますクラミドモナス

Summary

温度感受性(ts)致死変異体は、本質的な機能を特定し分析するための貴重なツールです。ここでは、ts致死変異体をハイスループットで生成および分類する方法について説明します。

Abstract

遺伝的摂動の体系的な同定と特性評価は、遺伝子機能と細胞経路を解読するのに有用であることが証明されています。しかし、従来の永久的な遺伝子欠失のアプローチは、必須遺伝子には適用できません。私たちは、単細胞緑藻類Chlamydomonas reinhardtii¹の細胞周期調節を研究するために、~70種類の温度感受性(ts)致死変異体のユニークなコレクションを開拓しました。これらの突然変異は必須遺伝子を同定し、ts対立遺伝子は温度変化によって条件付きで不活性化される可能性があるため、必須機能を特定および分析するための貴重なツールを提供します。ミュータントコレクションは、散発的なコレクションが重要なコンポーネントを見逃す可能性があるため、包括的に近い場合、はるかに価値があります。しかし、そのためには、特にワイドターゲットの画面で、多数の変異体を効率的に収集する必要があります。ここでは、致死的な変異体を生成し、Chlamydomonasでその表現型を解析するためのロボット工学ベースのパイプラインについて説明します。この手法は、寒天で増殖するあらゆる微生物に適用できます。私たちは3000を超えるts変異体を収集しましたが、これにはおそらくほとんどまたはすべての細胞必須経路の突然変異が含まれており、約200の新しい候補細胞周期突然変異が含まれています。これらの変異体のその後の分子的および細胞的特性評価は、植物細胞生物学に新たな洞察をもたらすはずです。包括的なミュータントコレクションは、幅広い生物学的経路を確実にカバーするための必須の前提条件です。これらの方法は、この原稿の範囲を超えている原因となる突然変異の効率的なマッピングと同定のために、下流の遺伝学およびバイオインフォマティクス手順と統合されています。

Introduction

モデル生物の体系的な変異体のコレクションの表現型の特徴は、細胞の複雑さを解剖するための実証済みのアプローチです。半数体単細胞緑藻クラミドモナスは、植物のような遺伝子セットを持っていますが、それは陸上植物の系統²内の複数のゲノム重複の前に陸上植物から発散しました。原理的には、遺伝子重複主半数体ライフサイクルの欠如が大幅機能喪失遺伝的アプローチを容易にします。しかし、目的の遺伝子の標的破壊が原因で効率的な相同ゲノム統合の欠如のためにほとんど不可能です。ランダム挿入破壊ライブラリは、これまでに1,562の遺伝子^3を表す1935マッピングされた混乱の配列されたセットを得、破砕部位の同定と組み合わせて、建設中です。しかし、（ヌル変異を生成するために、一般的に予想される）このアプローチは、必須遺伝子には適用されません。温度感受性（TS）突然変異はrecovereすることができます必須遺伝子中のd、および最近の方法は、変異遺伝子と原因病変の効率的な同定を可能にします。高温での表現型分析は、その後、変異した遺伝子の機能についての直接の情報を提供します。我々は、細胞周期の進行に関与する遺伝子に特に焦点を当て、 クラミドモナスにおける〜70必須遺伝子中のts致死突然変異の単離および特徴について報告し^、1,4を制御^します 。

Tsの致死画面は何十年も^5,6のための微生物において遺伝子解析の主力となっています。原理的には、望ましい特徴は、致死性をtsはする変異の可能な全ての遺伝子が完全な分析を可能にする、少なくとも一つの変異によって識別されることを意味する「彩度を、 "近づくことです。しかし、実際には、いくつかの要因が飽和アプローチを制限します。ほとんど全ての遺伝子は、高温での活性の喪失に変異することができるが、最初に、このような変異体の回収効率は少なくともにわたって変化しますマグニチュード^7,8の順。したがって、ランダムな画面が飽和状態に近づくと長い前に「マイレージ」の再発ヒットをピックアップし始めます。 ts突然変異は、通常、機能の低下をもたらす一方で第二に、彼らは真の制限温度でヌルではないかもしれない（逆に、頻繁に許容温度で十分に機能しません）。この問題は、複数の対立遺伝子を比較することによって、ある程度対応することができます。それらはすべて、共通の表現型を共有する場合、これは、遺伝子の単純な不活性化の結果を反映する可能性が高いです。複数の対立遺伝子はまた、原因となる病変¹の決定的な分子同定のために非常に有用です。しかし、「マイレージ」の問題はほとんどヒットしない遺伝子内の複数の対立遺伝子が回復することが困難な場合があることを意味します。

これらの理由から、我々は分離して表現型のts変異体を特徴づけるために強化されたパイプラインを開発してきました。私たちは、私は、これまでに3,000人以上のts変異体を収集しています約200新たな候補細胞周期変異をncluding。すでに可能性がほとんどまたはすべての細胞の必須経路に突然変異を含み、このコレクション、の分子と表現型分析は、植物細胞生物学における新たな洞察や仮説を提供すべきです。重要なことには、このパイプラインは、効率のts突然変異体のコレクションを構築するために寒天上に成長する任意の微生物にも適用することができます。

機器上の注意：2台のロボットは、この手順（コロニーピッカーと組み合わせレプリカめっき装置/チェリーピッカー）に効率のために非常に重要です。ピッカーは、典型的には、金属ピンを持っています。摘みコロニーが（モデルに応じて、数秒〜数分）、いくつかの期間のために、これらのピン上の空気中に保持されています。クラミドモナスは、空気中の金属ピンには約20秒で死にます。これは、生物のためのモデル選択を制限します。精度の問題。私たちのコロニーピッカーは、合理的に正確です。しかし、それはその作用がやや暴力的であり、スプレーベースの交差汚染のためのいくつかの可能性があります。これは、高で使用されていませんえーより384密度（4.5ミリメートルの中心から中心の間隔）。この密度で、精度は完全に許容可能です。ロボット（これらの用途に使用されるさまざまな添付ファイルを）レプリカ採取メッキ/チェリーピッキングではるかに遅いですが、1536密度のために十分に正確である（6144も、この非常に正確なロボットのため、挑戦であり、私たちは、この密度を評価したが、選出されていません）は、その様々な困難のためにそれを使用することができます。プレートはなど 、不均一にロードされている場合、ロボットはうまく動作しません。正しいことが起こっていることを確認するためにスポットを確認することが重要です。もちろん、ロボットは無人で実行され、最初のいくつかのプレートが正しかった場合、一般的に、すべてがうまく行きます。

Protocol

1. UV突然変異誘発

1. トリス-酢酸-リン酸（TAP）と200長方形の寒天平板培地^9,10 - 100のバッチを準備します。数日後に控え、これらのプレートを用意し、次のステップに懸濁した細胞の迅速な吸収を確実にするために乾燥させるためにベンチに保管してください。
2. 0.2への文化クラミドモナス細胞まで- 0.5の光学密度（OD _750;〜2日）液体TAPの100ミリリットルの光の下で、25℃および100 rpmで振とう。
   注：Mat-ハイグロ^rを（ハイグロマイシンBに対する耐性を付与する）とマット+パロ^R（パロモマイシンに対する耐性を付与する）：UV突然変異誘発は、二つの遺伝的背景に独立して行われます。抗生物質の選択は、2つの接合型が相補的な薬剤耐性を有する設け、任意です。
3. 細胞が生存し、健康（水泳・未）、および汚染なしであることを保証するために、顕微鏡下で培養物の各々のサンプルを確認してください。
   注：生い茂る文化「クラッシュ」と位相差顕微鏡で「ゴースト」として表示され、生存能力を失います。彼らは飽和状態に達すると行くシェーカー培養を保管しないでください。 「ゴースト」現象は、ステップ1.3で容易に検出可能です。
4. 0.003 OD ₇₅₀に文化を希釈します。株は運動性であり、光に反応して、方向泳ぐように、均質な密度を確保するためにアルミホイルで瓶を包みます。
   1. 600生存者コロニープレート（ 図1）上に形成することになる-細胞死滅を占め、200はそのように、計画されたUV線量に基づいて、懸濁液の密度を調整します。 UV露光時間については、 表1を参照してください。
5. 汚染を防ぐために、製造元の指示に従って、液体ディスペンサーにフィットする小型のチューブカセットを取り付け、殺菌のための一連の洗浄を行います。
6. 8×12液体ディスペンサーを使用して、長方形のプレート上に2μlの各4×96滴を分配する（ 図1 ）。すべてのマージが液体の薄いシートに落下確保し、直ちに光への暴露を防止するために、プレートをカバーするために、プレートの縁に緩やかにタップします。
   1. 、非常に均一な単一細胞分散を確実に上述したように、乾燥したプレートを使用し、すぐに光に応答して水泳から細胞を防ぐために、プレートをカバーします。すべての液体が吸収されるまで覆われたプレートレベルと暗所に保管してください。
7. 生存者の間でTS-突然変異体の最適な収率を与えることを経験的に決定された時間の期間のための殺菌UVランプ（30ワット殺菌UVチューブ）の下にプレートを置きます。 99.9％の殺害 - 90になり、50センチメートル - 40の距離で1.5分 - ここでは、0.5の時間を使用。千UV誘発点突然変異、の〜10％の変化コーディング配列 - 生存者は100を含んでいます。
   1. ためには、このステップでは、光による依存性DNA修復^11,12にノーと復帰して暗所での作業をUV照射の最大効力を保証するために、すぐにパック照射後暗箱でプレート。
8. 室温で24時間 - 8暗所でプレートを保管してください。
9. コロニーを形成する照明で21℃のインキュベーターでプレートを置きます。コロニー形成は、10日〜かかります。ビニール袋でプレートをラップし、液体結露を吸い取るために内部に吸収紙を追加してください。汚染物質がプレートを入力するための蒸発と凝縮のサイクルは、そうでなければ液膜のルートを提供することができます。
10. ロボットコロニーピッキング（ 図2）のソースなどの関連スタックにプレートをロードします。長方形のプレート上で384アレイのコロニーを選んで、照明（〜1週間）で21℃でそれらを成長させます。
11. 1536アレイ（4：1）中に384配列を凝縮レプリカメッキロボットを用いた（ 図3）、そしてプレートを21℃のインキュベーター中で2~3日間増殖することを可能にします。
12. 各二つのプレートに1536-配列を複製し、（21℃のインキュベーターに許容1を配置温度）および33℃のインキュベーター（制限温度の他）。 24時間後、予め温めたプレートの新しいセットに33℃でプレートを複製し、33℃のインキュベーターに置いてください。
    注：この二次めっき理由は、それは致命的な変異体は、いくつかの場合において、細胞をプレーティングした後、最初の細胞周期で逮捕されていても、実質的にバイオマスを蓄積することができるtsはあります。セカンダリレプリカは、この信号を排除し、大幅に感度を向上させます。
13. 33℃での成長の3日後および21℃での成長の5日後に、デジタルカメラでプレートを撮影。固定フレームにプレートを保持します。培養プレート（ 図4）と一緒に撮影された9位置合わせインジケータでマークされた「グリッド・プレート」を使用してください。交番として写真培養プレートを21°Cと33°C（33分の21）の画像をペアリング。
    注：野生型は、有意に増大するので、様々なインキュベーション時間は、成長を均等化するために使用され高速33℃で、21℃よりも。

TS突然変異体候補の2同定：最初の画面

1. 1536アレイに画像の背景を排除するために、カスタムMatlabの画像解析ソフトと対になった33分の21のプレート画像を処理し、セグメントに。プログラムは、それぞれの位置（ 図5）で検出されたバイオマス（総画素強度）を決定します。
   注：（指示と共にSIで提供）ソフトウェアが使用倍率とプレートのアライメントで1536アレイ内のセル（個々のエントリ）の位置を決定するために、グリッドプレートの画像を使用し、各セル内の全ピクセル強度を計算します。各変異体のためのこれらの値は、21°のように定義された標準のts +および温度感受性の程度のC相対的で必要な成長を決定するために調整可能なパラメータと比較される：S（ムート_33）/ S（WT _33）/ S（ムートSは信号（ピクセルである_21）/ S（WT _21）、バックグラウンドを差し引いた後のtensity）は、ムートは、個々の変異体であり、「WT」は、ランダムに選択された非温度感受性コロニーのts +表現型を持っていた（変異誘発株）です。 21℃での増殖は、S（ムート_21）/ S（WT _21）として定義されます。この最初の画面では、偽陰性率を低く保つために（21℃の比較的低い成長と温度感度の比較的低い度を可能にする）リラックスした選択基準を適用します。
2. シングルコロニーピッキングロボット（一般的に384配列に）のための指示ファイルなどのソフトウェアによって生成された選択されたコロニーのリストをロードします。ロボット工学の指示に従って、ソースとターゲットプレートを準備した （ 図6）配列にコロニーを選択します。
   注：従来のピッカーは、.csvファイル、.txtファイル、または.XLSのように、いくつかの形式で指示ファイルが必要です。すべてのピッカーは、ファイル駆動させる能力を持つことになります。異なるフォーマットは、MATLABコード（ソースコード提供）のマイナーな編集が​​必要になります。
3. ストックプレートを成長させるために〜5日間21℃のインキュベーターにターゲットプレートを置きます。

3.のts変異体の同定：第二画面を

1. 選んだコロニーを再テストするための手順を繰り返し2.1。典型的には30 - UV変異誘発を存続初期コロニーに比べて5％のts致死 - コロニーの50％は、2％の収率のために、クリアのts致死を再テストします。
2. 繰り返し二回スクリーニングのts致死を選ぶためのステップ2.2が、384密度で長方形のプレート上の100個のコロニーのブロックに配列コロニーに設計変更された指示ファイルを持ちます。これは、次のステップで便利な顕微鏡検査のためのものです。指示ファイル形式は、MATLABコードによって実行時に指定されています。
3. コントロールとして、いくつかのWTコロニーを含み、〜5日間、21℃でプレートを配置することを確認します。

4.初期の表現型決意

1. ステップ3.2に配列された100-ブロックプレートを複製し、21℃のincuに配置しますたて増殖するコロニーを得るために〜2日間ウランバートル。
2. 3コピーに100ブロックプレート（4.1）の新しいコピーを複製します。 21℃のインキュベーターやコントロールなどの33℃のインキュベーターで1に一つのコピーを配置します。
3. ロボットのセットアップに第三のコピー（ "プレートをスクリーニング」）を置き、滅菌水で触れた長いピンでコロニーを発見。
   注：寒天に固定クラミドモナス細胞は、ロボット顕微鏡検査のために利用可能ないくつかの単一細胞で、細胞のかなり密なスポットとして最初に上陸する傾向があります。 （ロボット長いピンによって転送水の体積は〜100ナノリットルである）、顕微鏡検査のためのコロニーを最適化一滴の水で最初に移入された細胞を発見するには。これは、多くの孤立した単一細胞で、初期のピン止め中心を中心半径が小さい（〜1ミリメートル）で細胞の分散につながります。
4. （まだ単一の分割されていない細胞間）（時間0でスクリーニングプレートの各スポット領域の顕微鏡写真を撮ります図7）とのインキュベーションのために33℃でプレートを配置します。 384密度アレイの4.5 mmの中心間距離で停止を与えるように設定変更された四分子解剖顕微鏡の手動ステージ制御により、画像の場所を決定します。
5. 時点（10時間、20時間、48時間）を変化させて、33℃のインキュベーターからスクリーニングプレートを取り外し、顕微鏡写真を取り、ステップ4.4のように。ステージ、プレートホルダー、及びステージコントローラを正確に毎回ポイントで同じ細胞の画像を取得するために校正されていることを確認します。迅速な顕微鏡写真の取得（〜10分）を行います。
6. ts表現型を確認し、画像取得時の温度変動がtsの表現型には大きな影響を及ぼさないことを確認するために、33℃のインキュベーター中で第二のコピーを使用してください。
   1. 顕微鏡画像を分析し、所望の基準に基づいて変異体（ 図8）を選択。 96並べ寒天プレートの最後の選択されたセットを発見。ことを確認し、各プレートは、同じ交配型と薬剤耐性の変異体が含まれています。
   2. 各プレートについて、最後の2つの列の正（クエリ変異）と相補性アッセイのための負（WT）コントロールを組み込みます。

5.新しい変異体の補完と連携テスト」マイレージプログラム」へ

1. 96ウェルマイクロプレート（各コロニーの密度は約0.2 ODでなければならない）で媒体¹⁰窒素を含まない配偶子誘導に配列されたコロニーを大量に転送します。配偶子形成を可能にするために〜5時間 - （20 W水銀電球13）光の下で培養します。
   注：この手順は簡単なメッキ装置を用いて複製するロボットのセットアップまたは手動のいずれかで行うことができます。
2. 配偶子形成のための窒素を含まない配偶子誘導培地¹⁰とチューブに代替耐性カセットを保有反対の接合型を持つクエリを一時停止します。
3. 交配MIXTにターゲットプレートにサンプルを混ぜます20μlの（ 図9）のUREボリューム。続いて〜光の下で10分間、各ウェル二回からスポットを5μl：一度リンケージ試験のためのTAPプレート上で、かつて相補性試験のためのTAP + 5μMパロ+ 9μMハイグロに。
4. 一晩21℃のインキュベーター内でリンケージプレートをインキュベートし、次いでホイルでそれらをラップします。接合胞子形成を可能にするために5日間暗所に保管してください。
5. 21℃での光の中で10日間〜のための相補性テストプレートをインキュベートします。
   注：薬物の量は、二重ヘテロ接合二倍体の生存を可能にするために較正され、彼らはまだ交配半数体を除去するのに十分なされています。これらの金額は、この特定のプロジェクトで使用される標準的な耐性カセットの統合のために較正しました。新しい連動で、用量を再較正する必要があります。ほとんどのバイオマスは、フローサイトメトリー（ 図9）によって二倍体であることが確認されているが、おそらく減数分裂と二重耐性の成長から半数体（の可変レベル分離個体）は、通常、同様に観察されます。
6. TS-表現型の識別のための2つのコピーに相補テストプレートを複製します。 〜5日間33℃で21℃で1コピーと一つのコピーを配置します。
7. 2.1節で説明したように、TS-表現型のためのテストコロニー、（ 図5）。そうクエリで補完されていないコロニーは、クエリ（同じ遺伝子の突然変異のための二倍体は、ヘテロ対立遺伝子）と同じ遺伝子の対立遺伝子を表します。
8. リンケージ試験のために、ステップ5.4以下、〜7日間半数体分離体の減数分裂と伸長を可能にするためにバックライトにプレートをシフトします。
9. （カセットがリンク解除されているので、一倍体の子孫の25％であると予測）、二重耐性子孫のために選択して、週に21℃でインキュベートし、TAP + 10μMパロおよび10μMハイグロへの結合テストプレートを複製します。
   注：二重耐性半数体のための薬剤の投与量を増やします。
10. 私としてTS-表現型のための試験コロニー、nは2.1ステップ。
    注：TS-表現型は、クエリと同じ相補群における突然変異体について予想（観察）されます。また、リンケージアッセイにおけるTS-表現型は、クエリを補完する変異体について、クエリと新しい突然変異の間の緊密な連携を反映することができます。試験されたクエリを補完する変異体は、原因となる病変のバイオインフォマティクス同定するための、そして最終的にさらなる表現型分析のためにパイプラインに入ることになる可能性の高い新たな遺伝子です。

Results

私たちは、クラミドモナスでのts突然変異体を単離するための加速パイプラインを示しています。細胞を、寒天プレート上に分配され、すぐに単一細胞密度のために顕微鏡下で迅速に検証した後、プレートをUV照射（ 図1）です。典型的な照射コロニーを同定し、許容温度（ 図2）での成長の10日後に配列されたフォーマットに選択されます。 384形式で得られたプレートは1536-配列（ 図3）にマージされます。照射されたコロニーを収集し、これらの最初の段階から、我々はこれまでに200,000個のコロニーを配列しています。 600生存者コロニープレート上に形成することになる - 懸濁液の密度は、死を占め、200はそのように計画されたUV線量に基づいて調整されます。三つのUV露光時間（1.5分、1分、および0.5分）と3つの濃度をそれに応じて（ 表1）を試験しました。経験的に、1.5分間の暴露時間は、TSのほとんどを得- 突然変異体（〜50％）。しかし、はるかに、1分は、細胞周期の候補の大部分を得ました。したがって、将来のUV突然変異誘発ラウンドはわずか1分で行いました。重要な問題は、最初のピッキング（特に高密度フォーマットで）交差汚染中に飛散します。これは、重複や二度同じ変異体のさらなる表現型をもたらすことができます。このようなシナリオの確率を最小限に抑えるために、最適なサイズでコロニーを収集するために世話をし、隣接するコロニーは最初のアッセイで取り上げていないことを確認します。

次に、2つの連続したTS-表現型アッセイ（ 図5）を実施し、約3,000 TS-突然変異体を単離し、表現型タイムラプス顕微鏡（ 図8）によって特徴付けられました。一定の基準を満たしている表現型に関心の細胞周期の研究に生物学的な焦点に、我々は、各ターゲット世代に二つ以上の対立遺伝子を収集することに興味を持っていません電子。したがって、我々は下流のパイプライン（ 図9）から、高度に再発性の遺伝子を除去するために、新たに収集した候補者に対して、二つ以上の対立遺伝子（クエリ）で、既に特徴付けられた遺伝子との相補と連携テストを行いました。

図1： 制服Unmutagenized細胞およびUV突然変異誘発の広がり。 （a）は、384×2μlの滴を試薬ディスペンサーを用いて寒天プレート上に分配されています。 （B）ランダムプレートを単一細胞密度を確認するために顕微鏡下で試験し、1分間の曝露とUV照射されています。 =50μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2. UV-変異誘発コロニーは384配列に対して摘み。 （a）は、UV照射単一細胞が目に見えるコロニーに〜10日間増殖させます。スケールバー= 2 cmです。 （b）は画像解析プログラムは、特定のパラメータに応じて分離可能なコロニーを認識し、ロボット384のプレートにそれらをするアレイ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

1536-配列にマージ 3.図 。フォー384フォーマットプレートは1 1536-プレートにマージされます。一度成長し、彼らはTS-表現型をテストするために再び複製されます。 ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。

定量化のため4.イメージング図。シリーズの全てのプレートが同一の倍率と位置で撮影されるように、（a）は、プレートは、文書の写真撮影スタンドの下枠に保持されています。 （b）第一の画像は、隅と中央に配置された赤色ドットで1536ウェルマイクロタイタープレートです。この「グリッド・プレート」の画像は、アレイの位置を定義します。 （c）のインキュベーション後の1536アレイの例。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

セミによるTS-表現型の図5.同定-automated画像解析。プレートの画像は（SIで提供される）カスタムMATLABソフトウェアによって分析されます。画像は自動的にセルアレイ（96、384、または1536）に分割され、各セルにおける信号が定量されます。 21℃での成長は青色でマークされ、33℃での成長が黄色でマークされます。 33°Cに比べて21℃で有意に高い成長を示すコロニーを選択し、緑色のドットと黒四角でマークされている（TS +に標準化）。これらの選択は手動で編集することができます。最終的な選択は、コロニーピッキングロボットで使用されるファイルに転送されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

第一ラウンドのts致死候補の 図6. ロボットピッキング。チェリーpickingのロボットは、新しいアレイの候補を選択するステップ2.1で説明したように生成されたファイルからの指示に従います。トップパネルは滅菌ピンの負荷を示しています。下のパネルは、ソースプレート内の特定のコロニーからの正確なピッキングを示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

tsの致死表現型の初期ソート図 7. タイムラプススクリーニング。 図5に示すスクリーニングプロトコル二ラウンドを通過したクローンは、個々の細胞を顕微鏡で解決することができるように、細胞密度でプレートに複製されます。修正された四分子解剖顕微鏡は顕微鏡写真は、0時間、10時間、および20時間のインキュベーションAの後に撮影された位置を識別するために使用されトン33°C。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図8：タイムラプス顕微鏡で識別クラミドモナス細胞周期変異体。 （a）は、クラミドモナスのユニークな細胞周期のイラストは、生まれたばかりの娘細胞のハッチングで終わる核分裂SMサイクル、続いて細胞増殖によって特徴づけ長いG1期を、記述する。 （b）の顕微鏡画像は、細胞周期および有糸分裂を完了するのに失敗する典型的な細胞周期変異体の同定の際にWT細胞を示します。 =50μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図9：補完と連携テスト。 （a）は、頻繁に繰り返される変異した遺伝子と抗生物質耐性（ 例えば、ハイグロ）クエリは（ 例えば、パロ）は、第2の抗生物質耐性カセットを保有反対の接合型の変異体のセットで96ウェルプレート中で交差します。フローサイトメトリーにおける核酸染色および分析（左下のパネル）に示すように、相補性プレートは二倍体の高い割合を生じます。 （b）の交配混合物を二倍体における相補性のために二重性減数分裂子孫における連携のために両方のテストされています。ポジティブコントロールは、予想通り、反対の接合型でクエリ自体であり、ネガティブコントロールはWTであるとTS +表現型を示したのに対し、33℃でTS-表現型を示しています。丸で囲まれたコロニーは、クエリと全く相補性を示さないので、あるn個クエリの遺伝子のためのEW TS-対立。唯一の "頻繁にチラシは、「相補性試験セットであるため、これらは一般的に、さらなる特徴付けから除外されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 0.5 '

時間	OD	コロニーをピッキング（＃）	TS-表現型	細胞周期の候補
1.5 '	0.012	6000（平均=〜200）	200（3.3％）	7（3.5％）
1 '	0.003	11,000	131（1.19パーセント）	15（11.4％）
		（平均=〜360）
6E-04	9000	40（0.45％）	1（2.5％）
	（平均=〜300）

表1：細胞周期変異候補の収量を最大化するための照射時間のキャリブレーション。三照射時間は、生き残ったコロニー数（ - 600 200）を確保するためのODを対応する（30プレートずつ）を試験しました。

Discussion

TS致死突然変異体の高収量の単離のために、ここで説明したパイプラインは、クラミドモナスのゲノムの、おそらくすべての細胞に必須な経路が表現されることが保証されます。潜在的な細胞周期遺伝子の効率的な収集のために、繰り返し「マイレージ」の対立遺伝子の排除のための2つの最も重要な手順は次のとおりです。不完全な細胞周期および2）既に識別さに対する並列相補性アッセイのための逮捕表現型特性の1）コヒーレント定義新たに単離されたもので、コレクションを拡大する遺伝子を照会。

明暗サイクルで同期すると、クラミドモナスは、任意のDNA複製や細胞分裂¹³なしで日照時間とセルサイズ> 10倍の増加時に光合成を成長させます。夜の開始とほぼ一致し、次いで、細胞を、DNA複製、有糸分裂、および細胞分裂（ 図8）の交互の複数のサイクルを経ます。この規制SCHEMEは、細胞分裂周期のために特に必要主に細胞増殖および完全性に必要な遺伝子および遺伝子間の自然な区別を提供します。私たちは、10時間および20時間の時点では、最初のラフな表現型が^1をカットするために非常に有益であることがわかりました。私たちはこれらの画像をもとに、現在認識のts致死突然変異体の広範なクラス（Tulin氏とクロスでSI、2014を参照^）1は 、次のとおりですノッチ、ポップコーン、ラウンド、小、中、早期の溶解、および複数サイクル（ 図8 ）。

私たちに焦点を当てる3最も関連性の高いカテゴリはノッチ、ポップコーン、およびラウンドです。 「ノッチ」と「ポップコーン」の表現型は、以前にほとんどの細胞周期特異的な病変（ 例えば、有糸分裂サイクリン依存性キナーゼ、DNA複製機構、及びトポイソメラーゼII）の特徴であることが示された^1。 1（ノッチ）または複数の外観（ポップコーン）初期のが、失敗した細胞分裂の見かけの面は便利モルフォリンであります細胞周期開始のogical指標。これらの変異体は、一般的に10時間のマークでWTと類似の細胞容積の増加と、ほとんど、あるいは全く成長欠陥を示します。 Notchおよびポップコーンの表現型は、10時間で明らかであり、完全に20時間まで（しばしば細胞溶解に関連する）が開発されています。 「ラウンド」細胞は、このように大規模な、丸い逮捕細胞を得、WTではなく、見かけの初期の分割面の大いに減少生産と同様に成長します。このカテゴリの前の変異体は、後期促進¹⁴コンプレックスや微小管機能（チューブリン折り補因子、ガンマチューブリンリング複合体^）1に必要な遺伝子内のコンポーネントに陥っています。後の時点で、これらの細胞は、しばしば顕著な細胞溶解を示します。

「小」と「中」の細胞は、WT（ミディアム）未満のいずれか無視できる（小）または大きく成長。現在までに同定されたこれらの変異体の多くは、注釈基本蜂巣における役割を示唆している遺伝子内の病変を持っていますR成長プロセス（翻訳又は膜生合成）。 （：;：減少ミディアムWTのようなラウンド）ミディアムとラウンドの間の主な微視的な差別が10時間で成長量にかかっています。中小カテゴリが非常に大きく、おそらく細胞経路の偉大な範囲の病変を反映しているため、我々は、これらのカテゴリを飽和しようとしていません。しかし、我々は、分子の多様な経路に損失の表現型を理解するために、クラスの代表者を識別するために。たいです二つの自然と口から出たカテゴリは次のとおりです。1）早期溶解前の細胞増殖の証拠がほとんどないと2）複数のサイクルで、10時間のマークが緑色の（損失、屈折性の喪失）整合性を失う変異体を。彼らは長期の増殖を行うための完全なことができないことを示すものの細胞は、10および20時間で、WTと同様に増殖します。

私たちは、ほとんどが同様に、中小丸い細胞を「ノッチ」、「ポップコーン」と「ラウンド」を特徴づけると、除外されています完全な少数の細胞分裂とリーキー変異体。これは、成長や膜の完全性、などの基本的な細胞機能は、機能していることを確認し、分裂関連遺伝子の確率を豊かに主です。このアプローチは、経験的に効率的であることが分かりました。しかしながら、それは、細胞周期遺伝子が多面的であり、以前のG1において、実際の分割の前に追加の役割を有することとすることができます。我々は稀であることを期待このような例は、逃しています。より一般的に、我々は高確率で完全に機能不全タンパク質である1原因となる変異が原因である均質な逮捕、を目指します。しかし、ちょうど記載したのと同じ理由で、いくつかの逮捕点があるかもしれないので、ある程度の柔軟性が候補を選択する際にお勧めします。

新たに同定された遺伝子を持つコレクションを豊かにするために、選ばれた候補者は、相補性のためにアッセイします。私たちは、ネガティブコントロール（QUERに+ポジティブコントロール（クエリ変異に対するクエリ）にTS-を必要とTSWTに対するy）とします。クエリと同じ相補群における新しい変異体は、TS-です。同じ相補グループのメンバシップは、ほとんど常に（これは我々がテストしたすべてのこのような遺伝子のためのケースとなっている）同じ遺伝子の分子病変を反映しています。したがって、のために「マイレージ、「この基準は、さらなる特徴付けのために排他的です。テストされたクエリと同じ相補群ではなかった変異体は、新しい遺伝子の候補であると、さらにバイオインフォマティクスと実験ツールによって特徴付けられます。異なる相補群へのTS-対立遺伝子の高度に可変回復はよく知られた現象-では、変動が原因で異なる遺伝子の間で、TS-する可変性の大きな本質的な変動に、ポアソンノイズよりも著しく大きいことです。原因は、固有の熱不安定性の違いを含めることができます。異なるタンパク質のサイズ、大規模として、複雑な安定化対単量体のようなタンパク質の存在;および変異原性のホットスポット。これは、ほぼ純粋なnuisaですNCE。しかし、1結果の良好な転帰は、「マイレージ」リスト（リストのほとんどを占めるだけでいくつかのターゲットで）長くないので、労働集約型の相補性テストは、プロジェクトの後の段階まで大規模な事業ではないということです。

補完的なアプローチとして、我々はリンケージアッセイを行いました。このアッセイでは、二重耐性子孫が選択されると、TS-表現型について試験します。 TS-表現型は、クエリとして、あるいはしっかりとリンクされている変異のために、同じ相補群に期待（および観察された）変異体のためにされています。試験した遺伝子の各々について、WTの子孫が遺伝的距離に応じて、一定の確率で（TS +表現型）表示されるように期待されています。私たちは、これらのスポットの各交配のために約100 zygosporesがあると推定しています。 100％減数分裂の効率を仮定すると、これはMに起因するリンクされていない薬剤耐性カセット（減数分裂の子孫の25％、減数分裂あたり4から約100二重薬剤耐性子孫になりますendelian継承）。これはまた、子孫の25％が二重変異体となり、TS-突然変異のための場合であると、クエリとテスト変異がリンク解除された場合25％は、WTになります。したがって、二重薬剤耐性の子孫のうち、25％は、WT（約25細胞）となります。これは、完全にリンクされていない突然変異の場合です。しかし、中程度の結合（〜20センチ、約2メガビット、またはゲノム¹¹⁵の2％以内）を強く軽減又はTS +信号を除去することができます。抗生物質カセットを試験突然変異の結合の場合には、TS +二重薬剤抵抗性である半数体は、非常に低い量で存在します。これは、全ての変異体テストし、簡単に注目される異常な結果を補完するにもかかわらず、試験した全ての変異体と再結合するなどの明らかな失敗を明示する。このような場合において、戻し交配は、問題を解決します。

事前の知識から、および配列分析の両方から、我々は、MOが、クラミドモナスにおける細胞周期遺伝子は、約500の遺伝子²であることを期待しますSTは、おそらくすべてではない、不可欠です。私たちは、複数の変異体が収集される追加の突然変異誘発ラウンドの必要性と彩度上昇のレベルを評価します。

この手順は、一意の必須の生物学的プロセスおよびそれらを行う遺伝子及びタンパク質を研究するために設計されています。必須遺伝子に摂動を生成する他の方法は、（ 例えば、ランダム変異誘発対立遺伝子の変換^16、条件付きで転写された対立遺伝子^17、または低形質対立遺伝子^18）が存在します。しかし、それらはすべて強く栄養クラミドモナスに抑制されている相同組換えを必要とします。クラスタ化され、定期的にinterspaced短いパリンドローム反復（CRISPR）/ Cas9システムは、遺伝子改変¹⁹のための強力なツールとして確立されています。しかし、それはクラミドモナス²⁰で効率的に動作するようにまだあります。批判的に、これらの方法の全ては、ターゲットの事前知識を必要とします。これは重大な制約であります1は何か新しいことを学ぶために可能性を持っているしたい場合は！我々のアプローチは、任意の事前知識の独立した必須遺伝子を同定変異が得られます。したがって、現在の技術レベルでは、深い配列決定による遺伝子同定に続いて、ランダムのts突然変異の単離は、植物の上界における微生物細胞生物学への迅速なエントリを獲得する最も効率的な方法であり得ます。

（各クローン中〜100のコード配列を変える突然変異の中から）原因となる変異の同定は、この論文の範囲を超えています。バルク分離個体のプール¹のディープシーケンシングは有効であるが、労働集約的です。株の大規模な数のすべての突然変異の決意ためのコンビナトリアルプール戦略は、プールの少数の配列を決定した後、非常にコストと労力対効果です。コンビナトリアルバルク分離個体配列決定のための新しい戦略は、SIM変異体の数十に原因となる変異の同定を可能にする、開発中です（準備中）単一の配列決定ランでultaneously。これらの効率は、ここに記載の方法により可能となる変異体の非常に急速な蓄積のペースを保つために重要な遺伝子の同定工程を可能にするために非常に重要です。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<ストロング>機器:
ハドソン RapidPickコロニーピッカー	Hudson Robotics
MultiDrop Combi試薬ディスペンサー	Thermo Scientific	5840300
スモールチューブメタルチップカセット	Thermo Scientific	24073295
Singer RotoR レプリカプレーティングロボット	Singer Instruments		プロセスにとって非常に重要です。低スケールのスクリーニングでは、社内の手動ツール
であるSingerシングルコロニーピッキングアタッチメント('スティンガー')	歌手の楽器		は手動で選ぶことができますが、大規模な場合はほぼ不可能です
名前	会社	カタログ番号	コメント
素材:
SYTOXグリーン核酸染色	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S7020