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方法論記事

示差メチル化の測定

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DOI:

10.3791/54838

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2016年12月21日

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 2Department of Pediartics, Omaha Children's Hospital and Medical Center, University of Nebraska Medical Center, 3Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Medicine, and Cellular and Integrative Physiology, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 4Indiana Biosciences Research Institute

この記事について

サマリー

膵島β細胞死は1型糖尿病の発症に先行し、このプロセスを検出することで早期の治療介入が可能になるかもしれません。ここでは、β細胞死のバイオマーカーとして、ヒト血清中の異なるメチル化INS DNA種を測定する方法について詳しく説明します。

要約

膵島β細胞の死は、事実上すべての形態の糖尿病の病因の根底にあり、特に1型糖尿病における率直な高血糖症の発症に先行すると考えられています。β細胞死の高感度で信頼性の高いバイオマーカーの開発により、糖尿病の発症を予防または遅延させるための早期治療介入が可能になる可能性があります。最近、私たちのグループを含むいくつかのグループが、循環中のプレプロインスリン(INS)をコードする無細胞の差別化メチル化DNAが、プレタイプ1糖尿病および新たに発症した1型糖尿病のβ細胞死と相関していることを報告しています。ここでは、-69 bp(転写開始部位に対して)のシトシンで差動的にメチル化される無細胞INS DNAを測定するためのデジタルPCRを使用した段階的なプロトコールを示します。このアッセイは、-69 bpの位置でメチル化シトシンと非メチル化シトシンを区別でき、数桁にわたって直線的であり、DNAコピー数の絶対定量を提供し、新たに発症した1型糖尿病および無病対照の個人のヒト血清サンプルに適用できることを示しています。ここで説明するプロトコルは、循環からであろうと単離された細胞や組織からであろうと、異なるメチル化シトシンの検出が望まれる任意のDNA種に適合させることができ、DNA断片の絶対定量を提供することができる。

概要

1型糖尿病（T1D）は、自己反応性T細胞1によるインスリン産生膵島β細胞の破壊により特徴付けられる自己免疫疾患です。 T1Dの診断は、通常、インスリン欠乏の証拠としてケトアシドーシスを呈する可能性があるリーン、若い個体で高血糖（血糖値>が200mg / dl）の測定時に行われます。 T1Dの診断時に、β細胞機能及び質量の実質的な損失の証拠がある（50〜 - 90％）2。臨床研究では、診断時に制定されたいくつかの免疫調節薬は、疾患の臨床的寛解をもたらしたβ細胞機能（およびおそらく質量）が、いずれの安定化の発展のためにコールを調達している知見をもたらしました病気の早期発見のためとの併用療法3,4の有効性の長手方向の追跡のためのバイオマーカーの。国際コンソーシアムの取り組み、などヒース5の国立研究所のヒト膵島研究ネットワークコンソーシアムはね、T1D中のβ細胞ストレスと死に焦点を当てたバイオマーカーを開発する必要性を強調してきました。

9 -これらの取り組みに沿って、私たちのグループなどが最近β細胞6を死んでから主に生じる循環、エピジェネティック修飾されたDNA断片を測定するバイオマーカーアッセイを開発しました。現在まで発表されたアッセイの全てにおいて、焦点は他の細胞型と比較して、コードおよびプロモーター領域における非メチル化CpG部位のより大きな程度を実証するヒト遺伝子をコードするプレ（INS）の定量にされています。非メチル化INS DNA断片の放出は（壊死性、アポトーシス）β細胞を瀕死から主に発生していると仮定しました。我々の最近の研究では位置で、若者にいることを非メチル化とメチル化の両方INS DNAの上昇を示した-69 bpの（トンへの相対彼は新たな発症T1Dで観察され、そして一緒にこの集団6のような特異的バイオマーカーを務めた）転写開始部位。これらのバイオマーカーアッセイは、（ウラシルに非メチル化シトシンを変換するために、無傷のメチル化シトシンを残して）単離されたDNAの重亜硫酸塩変換に続く商用スピンキットを用いて、血清または血漿からの無細胞DNAの単離を伴います。

この報告書では、我々は、血清からの無細胞DNA、重亜硫酸塩変換、および示差的メチル化INS DNAのための液滴のデジタルPCR（以下、デジタルPCR）の性能の単離を、血清サンプル収集の技術的側面を説明します。

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プロトコル

倫理に関する声明: プロトコルは、インディアナ大学の治験審査委員会によって承認されました。被験者の両親は書面によるインフォームドコンセントを提供し、7歳以上の子供は彼らの参加に同意しました。

1. 血清処理

注:記載されているアッセイは、以下のように単離されたヒト血清を用いて厳密に試験されています。

  1. 1本の赤いトップ(無添加、コーティングなし)の採血チューブに血液を採取します。
  2. 血栓が形成されるまで、室温で30分間放置します。
    3. チューブを
  3. 2,000 x gで室温で10分間遠心分離します。上清(血清)を血清保存用に指定された新しいチューブ(ポリプロピレンスクリュートップチューブ、サイズはサンプルによって異なります)に移します。
  4. DNA単離の準備ができるまで、サンプルを-80°Cで保存します。

2. 血清DNA抽出

注:DNAは、50 μlの血清(推奨)を使用したDNA抽出キットで、メーカーのプロトコルに従っていくつかの変更を加えて抽出します。

  1. 微量遠心チューブにサンプルあたり200 μlの溶解バッファー + 1 μlのポリ(A) (5 μg)を調製します。15秒間渦巻きます。ステップ2.3まで取っておきます。
  2. -80°Cの冷凍庫から血清サンプルを採取し、室温で解凍します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含む) を使用して、血清サンプル量を合計 200 μl まで増やします。
  3. 20 μl のプロテアーゼ (1.4 Anson units/mL) をサンプルに加え、続いて 200 μl の溶解バッファー/polyA ミックス (ステップ 2.2) を加えてサンプルを溶解し、8 秒間ボルテックスします。サンプルを 56 °C で 10 分間インキュベートした後、微量遠心分離機 (>10,000 x g) で最高速度で 7 秒間短時間遠心分離します。
  4. 100%エタノール230μLをサンプルに加え、8秒間ボルテックスしてDNAを沈殿させ、最高速度(>10,000 x g)で7秒間短時間遠心分離します。
  5. ミニスピンカラムに600μlのサンプル混合物を加えて、DNAをスピンカラムにアプライします。6,000 x gで1分間遠心分離します。フロースルーを捨て、カラムをきれいなチューブに入れます。
  6. 500 μl の洗浄バッファー 1 をカラムに添加して DNA を洗浄します。6,000 x gで1分間遠心分離します。フロースルーを捨て、カラムをきれいなチューブに入れます。500 μl の洗浄バッファー 2 をカラムに加え、最高速度 (>10,000 x g) で 3 分間遠心分離します。新しい1.5 mLの微量遠心チューブにカラムを入れ、再び最高速度で1分間遠心分離します。
  7. 新しい1.5 mLの微量遠心チューブにカラムを入れ、60 μlの溶出バッファーをフィルターに直接加えて、DNAを溶出します。クロスコンタミネーションを防ぐために、サンプル間でチップを交換することが重要です。室温で5分間インキュベートした後、6,000 x gで1分間遠心分離します。さらに60 μlの溶出バッファーを添加し、6,000 x gで1分間遠心分離します。
  8. 後で使用するためにDNAを-20°Cで保存するか、すぐにバイサルファイト変換に進みます。

3. 亜硫酸水素塩変換

注:バイサルファイト変換は、バイサルファイト変換キットを使用して、製造元のプロトコルに従っていくつかの変更を加えて実行します。

  1. 非メチル化シトシンをウラシルに変換するには、ステップ2.7のDNA20 μlに130 μlのバイサルファイト変換試薬をPCRチューブ(1本の0.2 mL PCRチューブまたは8ストリップPCRチューブ)で加えます。残りの40 μlのDNAは、将来の使用のために保存するか、または複製反応に使用します。ピペッティングで上下させて20回混合し、短時間遠心分離して、側面や蓋に水滴が落ちていないことを確認します。ウォーターバスまたはサーマルサイクラーで、98°Cで8分間、54°Cで60分間、4°Cで5分間インキュベートします。
    1. 手順3.2に進むか、4°Cで最大20時間保存します。
  2. スピンカラムに600 μlの結合バッファーを加え、付属のコレクションチューブにカラムを配置します。重亜硫酸塩DNAをカラムにアプライし、ピペッティングで10回上下させて混合します。最高速度(>10,000 x g)で30秒間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
  3. 100 μlの洗浄バッファーをカラムに添加してDNAを洗浄し、最高速度 (>10,000 x g) で30秒間遠心分離します。
  4. 脱スルホン化を行ってスルホン酸基を除去し、非メチル化シトシンからウラシルへの変換を完了するために、200 μlの脱スルホン化バッファーをカラムに添加します。室温で20分間放置した後、最高速度(>10,000×g)で30秒間遠心分離します。
  5. 200 μlの洗浄バッファーをカラムに添加してDNAを洗浄し、30秒間全速力で遠心分離します。フロースルーを破棄し、この洗浄ステップを繰り返します。
  6. カラムを 1.5 mL の微量遠心チューブに入れます。10 μLの溶出バッファーをカラムフィルターに直接添加してDNAを溶出します。1分間インキュベートします。全速力で30秒間遠心分離し、DNAを溶出します。A260.
    の分光光度法により回収されたDNAを定量 注:分光光度法によって検出されるDNAは、主に上記のステップ2.3で追加されたキャリアpolyA DNAを表します。通常、polyAの回収率は入力の≥85%(>4.25μg)です。
  7. デジタルPCRに進む準備ができるまで、DNAを-20°Cで保存します。

4. マルチプレックスデジタルPCR

  1. 各サンプルとコントロールに十分な溶液を含むマスターミックスを作成します。水を含むサンプル(ネガティブコントロール)、非メチル化INSを含むプラスミドのサンプル1つ(1 pg、ポジティブコントロール)、メチル化INSを含むプラスミドのサンプル1つ(1 pg、ポジティブコントロール)、およびプラスミドの1:1混合物を含むサンプルを少なくとも1つ含めます。
    1. PCRマスターミックスを調製するには、PCRバッファーの反応あたり12.5 μl(例:10サンプルあたり125 μl)、反応プライマー/プローブミックスあたり1.25 μl(例:10サンプルあたり12.5 μl)、反応水あたり8.25 μl(例:10サンプルあたり82.5 μl)、反応EcoR1酵素(例:1反応あたり0.5 μl)を添加します。 10サンプルあたり5μl).
      注:ここで使用されるプライマーとプローブは次のとおりです:フォワードプライマー:5'-GGAAATTGTAGTAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGT-3';リバースプライマー:5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3';FAMプローブ:FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB;VICプローブ:VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB。
  2. マルチプレックスPCR反応を96ウェルプレートにセットアップします。各ウェルに19.5μlのマスターミックスを加えます。2.5 μlのバイサルファイト変換DNAサンプルを各適切なウェルに加えます (残りの7.5 μlのバイサルファイト変換DNAを保存するか、反復反応に使用します)。数回ピペッティングで上下させて混合します.
    注:行内の8つのウェルすべてにサンプルまたはバッファーコントロールが含まれている必要があります。
  3. プレートシーラーを使用してホイルシールでシールし、ウェルの側面に液体がなくなるまでプレートスピナーで遠心分離します。
  4. タッチスクリーンで自動液滴発生器を設定します.
    注:カートリッジ内の8つのウェルすべてに、サンプルまたはバッファーコントロールが含まれている必要があります。
    1. ステップ4.2から96ウェルプレート上のサンプルがロードされる行に触れて、使用する行の数を設定し、行を青色で強調表示してアクティブな行を示します。
    2. 汚染を避けるために、消耗品を背面から前面にロードします。まず、装置の後列に沿ってカートリッジを追加します。チップを機器の中央列にロードします.
      注意: カートリッジは、正しい向きでホルダーに収まるだけです。
    3. 96ウェルプレートを装置にセットします。-20°Cの冷凍庫からコールドブロックを取り出し、新しいスカート付き96ウェルプレートをその中に入れます。サンプルをロードした96ウェルプレートの隣の装置内に置きます。
    4. 機器の前面にあるディスペンサーにオイルを追加します。タッチスクリーンでオイルの種類を選択します。
    5. 青いスタートボタンをタッチして、実行を開始します。プレートのセットアップを確認し、スタートランボタンをタッチして開始します。
  5. 終了したら、新しく形成された液滴を含む96ウェルプレートを取り外し、プレートシーラーを使用してホイルシールでシールします。
  6. サーマルサイクラーで PCR10 を以下のプログラムで実行します: 95 °C で 10:00 分、40 サイクル: 94 °C で 00:30 分、57.5 °C で 01:00 分、98 °C で 10:00 分、12 °C で 10 分または最大 24 時間。
  7. プレートを液滴リーダーに置き、リーダーをセットアップします。
    1. [設定] タブをクリックします。[テンプレート] > [新規] をクリックして新しいテンプレートを開きます。ファイル名を入力します。
    2. ウェルエディターを使用して、各サンプルのパラメーターを設定します。各サンプルに一意の名前を付け、実験をレアイベント検出(R-RED)に設定し、マスターミックスをステップ4.1で使用したミックスに設定します。
    3. Target 1 に名前 (つまり、非メチル化) を付け、Target 1 を不明 (U) に設定します。Target 2 に名前 (メチル化) を付け、Target 2 を参照 (R) として設定します。
    4. 「実行」タブをクリックして、実行を開始します。実行オプションウィンドウで、検出ケミストリー(FAM/VIC)を選択します。

5. データ分析

  1. 解析タブで結果を開き、ポジティブコントロールに基づく2Dプロットを使用して解析します(図1を参照)。
  2. Droplet Readerで生成したCSVファイルを表計算ソフトにエクスポートして、データ解析を行います。
  3. 血清の「1μlあたりのコピー数」を生成するには、(濃度*250)/(DNA単離に使用した血清の量(μl))の式を使用します。6
    注:データは通常、ヒト血清から取得すると、正規分布を確保するためにlog10に変換されます。あるいは、データをlog10スケールでプロットし、ノンパラメトリック統計で分析することもできます。

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結果

適切にデータを解釈するために、我々は各デジタルPCR実行で非メチル化およびメチル化ターゲットINS DNAの両方のためのプラスミドコントロールを使用します。これらのコントロールは、メチル化および非メチル化DNAに対応する信号が明確に区別されていることを確認してください。 図1は、重亜硫酸塩変換されメチル化されていないINS DNA（ 図1A）を含むプラスミド対照、メチル化INS DNA（ 図1B）が液滴に対応する2次元散布図を示しており、1：二つのプラスミド（ 図1C）の1：1混合物。メチル化INSを含むプラスミドは、VIC信号に対する陽性の液滴によって示されているのに対し、非メチル化INSを含むプラスミドは、6-カルボキシフルオレセイン（FAM）信号用ポジティブ液滴によって示されています。 1：1のプラスミド混合物、二重陽性の液滴の人口は、両方の種...

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ディスカッション

DNAメチルトランスフェラーゼによってシトシンのメチル化は、多くの遺伝子における転写のエピジェネティックな制御を可能にします。ヒトでのINS遺伝子がほぼ独占的に膵島β細胞で発現し、その転写11のサイレンシングにINS遺伝子中のシトシンのメチル化の頻度との間に相関関係があるように表示されます。 13 -このように、ほとんどの細胞型は、β細胞11に比べ、様々なシトシンにおけるINS遺伝子のメチル化の実質的に高い周波数を示します。それらのDNA 12を遊離β細胞死滅から主として生じるであろう、β細胞死の有病率は、無細胞非メチル化INS DNAの血清レベルの分析によって監視することができることが提案されています。

重亜硫酸塩反応は14不変のメチル化シトシンを残し、ウラシルに非メチル化シトシンを変換します。シークエンシングまたはPCR分析OFの重亜硫酸塩変換DNAは、した...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は、国立衛生研究所の助成金UC4 DK104166（RGMに対して支援を受けました。国立衛生研究所の助成金P30 DK097512によってサポートされているインディアナ糖尿病研究センター翻訳コアの支援に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
レッドトップバキュテイナー Beckon Dickinson366441 無添加、コーティングなしの内部、10 ml
クライオバイアル チューブSimportT310-3Aポリプロピレン、スクリュー キャップ チューブ、任意のサイズ
QIAamp DNA 血液ミニ キットQiagen51106
Poly(A)SigmaP9403TE バッファー (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) から 5 µg/µl 
無水エタノール (200プルーフ)Fisher ScientificBP2818-500
DPBS (with CaCl2 and MgCl2)SigmaD8662
0.2 ml PCR 8ストリップチューブMidSciAVST
8ストリップキャップ、ドームMidSciAVSTC-N
EZ DNA メチル化-ライトニングキットZymoD5031
プローブ用ddPCRスーパーミックス(dUTPなし)プローブ用バイオラド1863024
バッファー制御バイオラッド1863052
ヒト非メチル化/メチル化プライマー/プローブミックスLife TechnologiesAH21BH1
EcoR1New England BiolabsR0101L
twin.tec PCRプレート96、セミスカートエッペンドルフ951020346
ピアス可能なホイルヒートシールBiorad1814040
PX1 PCRプレートシーラーBiorad1814000
QX200 AutoDG液滴デジタルPCRシステムBiorad1864101
プローブ用自動液滴生成オイルBiorad186-4110
DG32 自動液滴発生器用カートリッジBiorad186-4108
自動液滴発生器用ピペットチップBiorad186-4120
自動液滴発生器用ピペットチップビンBiorad186-4125
C1000 タッチサーマルサイクラーBiorad1851197
QX200 Droplet ReaderBiorad186-4003
ddPCR Droplet Reader OilBiorad186-3004

参考文献

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