膵島β細胞死は1型糖尿病の発症に先行し、このプロセスを検出することで早期の治療介入が可能になるかもしれません。ここでは、β細胞死のバイオマーカーとして、ヒト血清中の異なるメチル化INS DNA種を測定する方法について詳しく説明します。
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この記事について
サマリー
要約
膵島β細胞の死は、事実上すべての形態の糖尿病の病因の根底にあり、特に1型糖尿病における率直な高血糖症の発症に先行すると考えられています。β細胞死の高感度で信頼性の高いバイオマーカーの開発により、糖尿病の発症を予防または遅延させるための早期治療介入が可能になる可能性があります。最近、私たちのグループを含むいくつかのグループが、循環中のプレプロインスリン(INS)をコードする無細胞の差別化メチル化DNAが、プレタイプ1糖尿病および新たに発症した1型糖尿病のβ細胞死と相関していることを報告しています。ここでは、-69 bp(転写開始部位に対して)のシトシンで差動的にメチル化される無細胞INS DNAを測定するためのデジタルPCRを使用した段階的なプロトコールを示します。このアッセイは、-69 bpの位置でメチル化シトシンと非メチル化シトシンを区別でき、数桁にわたって直線的であり、DNAコピー数の絶対定量を提供し、新たに発症した1型糖尿病および無病対照の個人のヒト血清サンプルに適用できることを示しています。ここで説明するプロトコルは、循環からであろうと単離された細胞や組織からであろうと、異なるメチル化シトシンの検出が望まれる任意のDNA種に適合させることができ、DNA断片の絶対定量を提供することができる。
概要
1型糖尿病（T1D）は、自己反応性T細胞1によるインスリン産生膵島β細胞の破壊により特徴付けられる自己免疫疾患です。 T1Dの診断は、通常、インスリン欠乏の証拠としてケトアシドーシスを呈する可能性があるリーン、若い個体で高血糖（血糖値>が200mg / dl）の測定時に行われます。 T1Dの診断時に、β細胞機能及び質量の実質的な損失の証拠がある（50〜 - 90％）2。臨床研究では、診断時に制定されたいくつかの免疫調節薬は、疾患の臨床的寛解をもたらしたβ細胞機能（およびおそらく質量）が、いずれの安定化の発展のためにコールを調達している知見をもたらしました病気の早期発見のためとの併用療法3,4の有効性の長手方向の追跡のためのバイオマーカーの。国際コンソーシアムの取り組み、などヒース5の国立研究所のヒト膵島研究ネットワークコンソーシアムはね、T1D中のβ細胞ストレスと死に焦点を当てたバイオマーカーを開発する必要性を強調してきました。
9 -これらの取り組みに沿って、私たちのグループなどが最近β細胞6を死んでから主に生じる循環、エピジェネティック修飾されたDNA断片を測定するバイオマーカーアッセイを開発しました。現在まで発表されたアッセイの全てにおいて、焦点は他の細胞型と比較して、コードおよびプロモーター領域における非メチル化....
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プロトコル
倫理に関する声明: プロトコルは、インディアナ大学の治験審査委員会によって承認されました。被験者の両親は書面によるインフォームドコンセントを提供し、7歳以上の子供は彼らの参加に同意しました。
1. 血清処理
注:記載されているアッセイは、以下のように単離されたヒト血清を用いて厳密に試験されています。
- 1本の赤いトップ(無添加、コーティングなし)の採血チューブに血液を採取します。
- 血栓が形成されるまで、室温で30分間放置します。 チューブを
- 2,000 x gで室温で10分間遠心分離します。上清(血清)を血清保存用に指定された新しいチューブ(ポリプロピレンスクリュートップチューブ、サイズはサンプルによって異なります)に移します。
- DNA単離の準備ができるまで、サンプルを-80°Cで保存します。
2. 血清DNA抽出
注:DNAは、50 μlの血清(推奨)を使用したDNA抽出キットで、メーカーのプロトコルに従っていくつかの変更を加えて抽出します。
- 微量遠心チューブにサンプルあたり200 μlの溶解バッファー + 1 μlのポリ(A) (5 μg)を調製します。15秒間渦巻きます。ステップ2.3まで取っておきます。
- -80°Cの冷凍庫から血清サンプルを採取し、室温で解凍します。リン酸緩衝生理食塩水 (P....
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結果
適切にデータを解釈するために、我々は各デジタルPCR実行で非メチル化およびメチル化ターゲットINS DNAの両方のためのプラスミドコントロールを使用します。これらのコントロールは、メチル化および非メチル化DNAに対応する信号が明確に区別されていることを確認してください。 図1は、重亜硫酸塩変換されメチル化されていないINS DNA（ 図1A）を含むプラスミド対照、メチル化INS DNA（ 図1B）が液滴に対応する2次元散布図を示しており、1：二つのプラスミド（ 図1C）の1：1混合物。メチル化INSを含むプラスミドは、VIC信号に対する陽性の液滴によって示されているのに対し、非メチル化INSを含むプラスミドは、6-カルボキシフルオレセイン（FAM）信号用ポジティブ液滴によって示されています。 1：1のプラスミド混合物、二重陽性の液滴の人口は、両方の種.......
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ディスカッション
DNAメチルトランスフェラーゼによってシトシンのメチル化は、多くの遺伝子における転写のエピジェネティックな制御を可能にします。ヒトでのINS遺伝子がほぼ独占的に膵島β細胞で発現し、その転写11のサイレンシングにINS遺伝子中のシトシンのメチル化の頻度との間に相関関係があるように表示されます。 13 -このように、ほとんどの細胞型は、β細胞11に比べ、様々なシトシンにおけるINS遺伝子のメチル化の実質的に高い周波数を示します。それらのDNA 12を遊離β細胞死滅から主として生じるであろう、β細胞死の有病率は、無細胞非メチル化INS DNAの血清レベルの分析によって監視することができることが提案されています。
重亜硫酸塩反応は14不変のメチル化シトシンを残し、ウラシルに非メチル化シトシンを変換します。シークエンシングまたはPCR分析OFの重亜硫酸塩変換DNAは、した.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作業は、国立衛生研究所の助成金UC4 DK104166（RGMに対して支援を受けました。国立衛生研究所の助成金P30 DK097512によってサポートされているインディアナ糖尿病研究センター翻訳コアの支援に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| レッドトップバキュテイナー | Beckon Dickinson | 366441 無添加、コーティングなしの内部、10 ml | |
| クライオバイアル チューブ | Simport | T310-3A | ポリプロピレン、スクリュー キャップ チューブ、任意のサイズ |
| QIAamp DNA 血液ミニ キット | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | TE バッファー (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) から 5 µg/µl |
| 無水エタノール (200プルーフ) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl2 and MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8ストリップチューブ | MidSci | AVST | |
| 8ストリップキャップ、ドーム | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA メチル化-ライトニングキット | Zymo | D5031 | |
| プローブ用ddPCRスーパーミックス(dUTPなし) | プローブ用バイオラド | 1863024 | |
| バッファー制御 | バイオラッド | 1863052 | |
| ヒト非メチル化/メチル化プライマー/プローブミックス | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCRプレート96、セミスカート | エッペンドルフ | 951020346 | |
| ピアス可能なホイルヒートシールBiorad | 1814040 | ||
| PX1 PCRプレートシーラー | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG液滴デジタルPCRシステム | Biorad | 1864101 | |
| プローブ用自動液滴生成オイル | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 自動液滴発生器用カートリッジ | Biorad | 186-4108 | |
| 自動液滴発生器用ピペットチップ | Biorad | 186-4120 | |
| 自動液滴発生器用ピペットチップビン | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 タッチサーマルサイクラー | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
参考文献
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
- Maganti, A., E....
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