パインウッドセンチュウの交配挙動の観察と定量化、マツノザイセンチュウ

Summary

マツノザイセンチュウ、Bursaphelenchus xylophilusの交配行動を調査するためのプロトコルが提示されます。B. xylophilusの行動特性は、交配過程で説明されています。

Abstract

マツ材線虫の交尾行動を観察し、定量化するための方法は、 マツノザイセンチュウは 、実体顕微鏡下で設立されました。 B.センチュウの交配効率を向上させると相手観察の機会を増加させるために、処女大人培養し、調査のために使用されます。卵を、水で線虫を維持し、女性は10分間産卵させることにより得ました。第二段目の少年（J2）は、暗所で25℃で24時間の卵をインキュベートすることによって同期化され、初期のJ4は、別の52時間、灰色カビ、 ボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea）とJ2を培養することによって得ました。この時点で、ほとんどのJ4線虫は彼らの生殖器の形態を使用して、男性または女性であるとして明確に区別することができました。男性と女性のJ4を回収し、バージン成体線虫を得るために、24時間に2つの異なるペトリ皿中で別々に培養しました。処女男性と処女雌はワットの低下に対になりました凹形スライドのウェル内の小胞体。交尾行動は、実体顕微鏡下でのビデオレコーダーで撮影されました。交配プロセスの全期間は82.8±3.91分（平均±SE）であったと4つの異なる段階に分けることができます、と連絡交尾、と余韻、検索。期間の平均分はそれぞれ、21.8±2.0、±1.9 28.0、25.8±0.7および7.2±0.5でした。イレブンサブ挙動が記載された：、クルージング近づいて、遭遇し、触れる、掛け、位置、取り付け、射精、分離、静止状態、およびローミング。一人の女性が3人の男性または女性3と1人の男性とグループ化されたときに興味深いことに、明らかなイントラ性的競争が観察されました。このプロトコルは、Bセンチュウの交尾行動を調査する中で、だけでなく、他の線虫の行動学的研究のための基準として機能するだけでなく、有用かつ貴重なものです。

Introduction

マツノイセンチュウ、Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickleは、最も破壊的な侵入種の一つであり、パインの木のしおれと最終的な死を引き起こします。この病原性線虫は米国原産であると考えられていますが、中国、日本、韓国、ポルトガルなど、いくつかの国に輸送されました。最近では、スペインでも報告されており、莫大な経済的損失で何百万本もの松を枯らし、森林生産と生態系の安定を脅かしています^1-5。

宿主の松の木がマツノザイセンチュウに感染すると、何千万もの子孫が幹内で急速に繁殖します。これは木部の機能不全を引き起こし、その結果、しおれ、最終的には宿主樹⁶が死に至る。しかし、現在のところ、この病気を効率的に制御する方法はありません。交配行動は、この線虫⁷の高い繁殖力に重要な役割を果たす可能性があります。そこで、B. xylophilusの交配行動を研究室で調べ、交配を乱し、繁殖力を低下させる効果的な方法を見つけようと試みました。

このプロトコルは、B. xylophilusの処女成虫の入手方法と、ビデオレコーダーと実体顕微鏡を使用して交尾行動を観察し分析する方法の詳細な方法を紹介することを目的としています。このプロトコルは、他の線虫の行動研究の参照としても使用できます。

Protocol

ヴァージンアダルト線虫の1買収

1. マツ材線虫の分離株と培養条件
   注：B.センチュウ Nxy61はもともと中国の浙江省の寧波領域の病気の馬尾から抽出された隔離。
   1. ポテトデキストロース寒天（PDAを、 材料の表を参照してください）準備成長灰色かび病菌のためのプレート。
   2. 接種のために、B.シネレアマットから直径10mmの真菌マットの一部をパンチして、新しいPDAプレートの真ん中にそれを置きます。文化暗所で25℃で5日間B.シネレア 。
   3. 文化暗所で25℃においてB.シネレアを含む準備されたペトリ皿中のマツ材線虫。
2. B.センチュウ卵の取得
   1. 漏斗の下にクランプされたゴムチューブを配置し、組み立てるためのラックに準備された漏斗を開催Baermannロート装置。漏斗の口の中でろ紙の代わりにガーゼの二つの層を配置します。
   2. 漏斗のセットアップに真菌培養液を移し、真菌のマットが浸漬さまで水を追加します。 2時間待ってから、線虫は、真菌培養から出てくるろ紙を横断し、Baermannロートの最下部に落ち着くだろう。
   3. 15 mLのチューブにチューブの底からの水の滴の最初のカップルを収集し、ゆっくりとチューブにクランプを解放することによって線虫を集めます。
   4. 室温で2分間、3,000×gで、上記のコレクションを遠心。
   5. ピペットで水の上層を削除し、滅菌蒸留（DD）の1mLのH ₂ Oでそれを再懸濁
   6. ピペットを用いて、新しいガラスシャーレ（直径6cm）に上記の再懸濁を移します。線虫が自由に泳ぐことができることを保証するために、ペトリ皿に無菌のdd H ₂ Oの3ミリリットルを追加します。
   7. GLASで線虫を保ちます暗所で25℃で10分間、ペトリ皿は、S。卵は妊娠した雌によって敷設されます。そのため、それらの糖タンパク質表面の、卵は、ガラスペトリ皿の底に固執します。
   8. 卵を乱すことなく、慎重に水やワームを削除します。乾燥から卵を防ぐために、すぐにガラスシャーレに無菌のdd H ₂ Oの3ミリリットルを追加します。
   9. すべての幼虫と成虫を除去し、純粋な卵を得るための手順を繰り返し1.2.8 3倍。ペトリ皿に無菌のdd H ₂ Oの余分な2 mLの（合計で5ミリリットル）を追加します。
3. 4段目の少年の取得（J4幼虫）
   1. ハッチ25℃の暗所で24時間採取した卵は、J2の幼虫を得ることができます。
   2. 、15 mLのチューブにピペットでJ2の幼虫を移し2分間、3000×gで遠心分離し、水の上層を除去します。
   3. 無菌のdd H ₂ Oの200μLとJ2の幼虫を再懸濁し、その後に転送B.シネレアを含むPDAプレート。
   4. 文化暗所で25℃で52時間、J2の幼虫。この時点で、ほとんどのJ2幼虫はJ4幼虫の初期段階へと発展してきます。
4. 処女大人の線虫の取得
   1. アルコールバーナーの上に加熱した後、ガラスキャピラリーを描画することによって線虫を拾うための針を準備します。
      注：これは、単一の線虫をピックアップするためのツールとして使用することができるように、このキャピラリ針の先端は、通常、直径が50ミクロン、成体線虫の略車体幅である必要があります。
   2. Baermannロートを組み立て、ステップ1.2.1で説明したように、2時間の真菌の培養物から線虫を抽出 - 1.2.3。
   3. きれいなペトリ皿に水でJ4を転送します。
   4. （ 図1実体顕微鏡下で線虫を観察し、間宮と清原⁸で説明したように、生殖器の形態によって、男性と女性を区別）。準備されたキャピラリ針を希望する性別の線虫をピックアップし、男性または女性のための適切な真菌培養プレートに移します。
      注： - 70％、男性よりも女性が60の雌の割合であります。女性の外陰部は明らかに男性の骨片は異なっています。大人に比べて、初期段階のJ4で骨片や外陰部は小さいですが、彼らはまだ容易に見ると区別することができます。線虫は、常に時には、男性と女性を区別することの困難を増大させ、水、に移動しています。
   5. 文化暗所で25℃でさらに24時間J4幼虫。
      注：すべての線虫は成虫に開発する必要がありますが、彼らは嵌合解除されているので、それらは処女大人とみなされます。
   6. Baermannは、ファンネル2を組み立て、ステップ1.2.1で説明したように、2時間の真菌培養物から処女大人を抽出 - 1.2.3、および2つの独立した、きれいなペトリ皿に処女成人男性と女性を転送します。

2.観察と交尾行動のビデオ録画

1. いくつかの凹面のスライドを準備し、それらの各ウェルに無菌のdd H ₂ Oの200μLを追加します。
2. キャピラリ針を用いて調製バージン成人男性やと女性をピックアップし、各凹形スライドの水の中に一つだけの線虫を置きます。
3. 彼らは新たな水環境に適応させるために1時間だけでなく内部の処女大人にしてください。
4. ピペットを使用して、別の1つのウェルからそれらのいずれかを転送することにより、処女オスとメスをペア。
5. 実体顕微鏡下に凹のスライドで1♀+1♂組み合わせの交尾行動を観察します。
6. バージン成人の接合効率を分析するために、それらの交配成功率（R）を計算し、ランダムに選択された大人のペアのそれとを比較します。交尾を検討複製の総数に比べて観察された複製の割合としてRを計算します。
7. 、交配の選択とintrasexual競争を調査グループおよび2つの異なる組み合わせの処女線虫を観察するには、次の1♀+3♂と3♀+1♂。
8. 定性および定量分析のためのデータを収集するために、ビデオ顕微鏡を使用して、交尾行動をフィルム。通常、全体の交配プロセスは、彼らは交尾後に離れて移動したときに線虫が瞬間に凹形スライドのウェル内に配置された時点から、2時間以内に完了する。従って、一つの複製、少なくとも2時間、連続的に交配処理を記録します。組合せごとに合計で少なくとも30の反復を完了します。
   注：記録プロセスの間の蒸発を補償するウェルに（通常は_50μL）2 O毎に0.5時間をより無菌のdd Hを追加します。

3.データ収集

1. コンピュータの画面上で、慎重にすべての動画と定性的サブ行動を特徴づけます。
2. 目を使用して、相手の持続時間を測定しますビデオレコーダーの電子フレーム単位で機能。手動でエンドポイントから開始時間を引きます。
3. 1♀+1♂組み合わせについては、それぞれのビデオ録画を分析し、次のイベントの継続時間を測定します：
   1. 検索の所要時間を測定します（ つまり、女性と男性は、彼らが遭遇した瞬間に凹形スライドのウェルに導入し、互いに接触しているときからの時間）。
   2. 接触の持続時間を測定する（ すなわち 、男性が正確に最初の交尾のために女性の外陰部に位置している瞬間の最初の接触からの時間）。
   3. （彼は射精後の女性の体から滑り落ちるまで男性が正確に女性の外陰部に位置しているときから、 すなわち時間）交尾の持続時間を測定します。注：一部の線虫を2時間に数回交尾することができます。このような場合には、ラスの端部に第一の交尾から交尾の継続時間を測定します間の時間を含むトン1、。
   4. 余韻の長さを測定する（ すなわち 、男性と女性の水泳まで互いに離れる交尾後の期間と線虫の体の長さ（通常は1ミリメートル）以上の距離で分離されています）。
4. 交尾頻度とすべての交尾の期間と異なる組み合わせのそれぞれについて、2時間内のすべてのcopulationsの平均期間をカウントする（ すなわち、1♀+1♂、3♀+1♂、および1♀+3♂）。
5. すぐに任意の休憩なしで行われた第1の接触、後の交尾の成功率など、さまざまな組み合わせのための最初の接点（P）用の交尾成功率を計算します。接触させる段階では、いくつかの連絡先は、実際の交尾の前に観察されることがあります。
   1. 2人の間の距離は、本体の長さ以上である場合には、以上のことを一つの接点を考えます。 1複製、レコードP 100％と交尾iについてsがブレークすることなく、最初に接触した後すぐに観察、または0.00パーセント全く交尾が観察されなかった場合や交尾が、2つ以上の接点の後があった場合。
      注：ここで説明する組み合わせごとに30の複製がありました。

Results

バージン成人の交配成功率（R）は、ランダムに選択された成人のものよりも有意に高かった、平均で86.67％であった：13.33±4.65％（F = 1301.71、DF = 1、P = 0.0001）（ 図2）。この知見は、ランダムに選択された大人と比べ処女大人とB.センチュウの交尾行動を観察することが容易であることを示唆しています。

1人の男性が一人の女性とペアになったときに、全体の交配プロセスは、平均で82.8分続きました。全体のプロセスは、4つの異なる位相によって記述することができます、検索接触し、交尾、と余韻。これらの4つのフェーズの継続時間は21.8±2.0分、28.0±1.9分、25.8±0.7分、および7.2±0.5分で、それぞれ（ 図3）でした。最近の刊行物では、我々は、近づいて、encounteriをクルージングと...

Discussion

行動試験は、化学生態学、神経生物学、分子生物学、遺伝学の基本的な側面です。線虫、特にC.エレガンスは 、広くこれらの分野での研究のために使用されています。 線虫の交尾行動は、以前^10-11検討されています。しかし、B.のセンチュウは gonochoristicと雌雄同体C.エレガンスとは異なり、その嵌合プロセスは、異なる行動機能^9を有しています。最近では、 マツノザイokinawaensis、B. センチュウの雌雄同体の姉妹種の交尾行動は^、12を報告^しました。別の実験方法を用いたが、この雌雄同体の種はBに類似したセックスの魅力を示したセンチュウ 、 それらの間の種間の引力が観察されました。この雌雄同体の姉妹種は、 マツノザイの生物学上の更なる調査を実施するためのモデルとして使用される場合があります。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B. xylophilus 分離株 Nxy61			寧波地域の Pinus massoniana から抽出
灰色カビ株			中国林業アカデミーから取得
ベアマン漏斗	センゴン
鷹のチューブ	センゴン
ピペット	Sengong
sterile dd H2O			121°Cの高圧蒸気で滅菌されています。Cで30分間。
ペトリ皿	センゴン
PDAミディアム	Huankaiバイオ。	021050
インキュベータ	ーSengong
層流	Sengong
ガラス毛細管	Sengong
ステレオスコープ	ライカ	LED5000 RL
倒立実体顕微鏡	Zeiss	A1
凹面スライド	Sengong