臨床的に関連のセフォペラゾン処理されたマウスモデルクロストリジウム・ディフィシルひずみR20291

Summary

このプロトコルは、臨床的に関連すると遺伝的に扱いやすい歪み、R20291を使用して、 クロストリジウム・ディフィシル感染症（CDI）のセフォペラゾンマウスモデルの概要を説明します。臨床疾患のモニタリング、 ディフィシル細菌列挙、毒素の細胞毒性、およびマウスモデルにおいてCDIを通じて組織病理学的変化を重視したプロトコルで詳述されています。

Abstract

クロストリジウム・ディフィシルは、嫌気性、グラム陽性、胞子形成性の腸内病原体であり、罹患率と死亡率の増加と関連しており、その結果、公衆衛生に緊急の脅威をもたらします。抗生物質による治療が成功した後のC.ディフィシル感染症(CDI)の再発率は高く、患者の20〜30%に発生しているため、この病原体に対する新しい治療法の発見が必要です。現在のCDIの動物モデルは死亡率が高いため、CDIのヒトに見られる慢性の潜行性疾患の発現には近似していません。C. difficileに対する治療薬を評価するには、臨床的に関連性のある株を利用したヒト疾患に近似するマウスモデルが必要です。このプロトコルは、臨床的に関連性があり、遺伝的に扱いやすい株であるR20291を使用したCDIのセフォペラゾンマウスモデルの概要を示しています。臨床疾患モニタリングの技術、C.ディフィシル細菌の計数、毒素の細胞毒性、およびマウスモデルにおけるCDI全体の組織病理学的変化は、プロトコルで詳しく説明されています。 CDIの他のマウスモデルと比較して、このモデルは投与された用量で一様に致死的ではなく、ヒトの疾患と一致する感染の長期にわたる臨床経過の観察を可能にします。したがって、このCDIのセフォペラゾンマウスモデルは、新規治療薬が臨床疾患の改善およびC.ディフィシルに対するコロニー形成抵抗性の回復に及ぼす影響を評価するための貴重な実験プラットフォームであることを証明しています。

Introduction

クロストリジウム・ディフィシルは、生命を脅かす下痢^1の原因^となる嫌気性、グラム陽性、芽胞形成桿菌です。 クロストリジウム・ディフィシル感染症（CDI）が増加し、ヒトの罹患率および死亡率と年間^1-4あたりの医療費のオーバー$ 4.8十億の結果と関連しています。 2013年には、疾病管理予防センター（CDC）は、それが公衆衛生¹に緊急の脅威をもたらすことを示す、緊急の抗生物質耐性のリスクとしてクロストリジウム・ディフィシルを分類しました。現在、抗生物質バンコマイシンによる治療およびメトロニダゾールはCDI ⁵のためのケアの標準と考えられています。患者^2,5-7の30％ -残念ながら、抗生物質による治療成功後のCDIの再発は20で発生した、高いです。したがって、この腸管病原体に対する新規治療法の発見が必要です。 ディフィシル 、交流で人間の病気を近似するモデル動物に対する治療薬を評価するために、linically関連株が必要とされています。

最初は、コッホの仮説は、クリンダマイシン処理したシリアンハムスターモデル^8を使用して、1977年にC.ディフィシルのために設立されました。このモデルは、まだ病因^9,10上の....

Protocol

倫理的な声明：
獣医のノースカロライナ州立大学カレッジの施設内動物管理使用委員会（IACUC）（NCSU）は、この研究を承認しました。 NCSU動物管理ポリシーを使用しNCSUで1985実験動物施設の動物保護法およびヘルスリサーチ延長法に定める基準とガイドラインは、 実験動物の管理と使用に関する指針に定められたガイドラインに準拠して適用されます。動物の健康状態を毎日評価し、瀕死の動物は人道的に二次対策が続くCO ₂窒息により安楽死させました。訓練された動物の技術者や獣医師は、この研究の間、AAALAC認定施設で畜産業を行いました。

C.ディフィシル植民地や疾患に対する感受性を達成するために飲料水における抗生物質セフォペラゾンの1.管理

注：5〜8週齢のC57BL / 6 WTマウス（雌雄）前抗生物質の水の投与開始に購入し、1週間のために隔離されました。検疫に続いて、マウスをオートクレーブ処理、食品、寝具、水で飼育しました。ケージの変化は、層流フード中で実験室のスタッフが、毎週行われました。

1. 7日前の課題の目標日（ 図1）に滅菌蒸留水にセフォペラゾン（0.5 mg / mlで）を準備します。
2. セフォペラゾン水でオートクレーブ処理水ボトル（0.5 mg / mlで）を記入し、各マウスのケージの中にそれらを配置しま....

Results

代表的な研究の間、5週齢のC57BL / 6 WTマウスは、5日間、飲料水（0.5 mg / mlで）でセフォペラゾンで前処理し、2日間は、通常の飲料水で洗い流すせました。マウスを、0日目に強制経口投与を介して、 クロストリジウム・ディフィシル R20291の10 ⁵胞子（ 図1A）で攻撃しました。マウスは、14日間のCDIの体重減少および臨床的徴候（嗜眠、食欲不振、下痢、および猫背の姿勢）をモニターしました。 C.ディフィシル R20291胞子とC57BL / 6 WTマウスの課題は、24時間および48時間後にチャレンジ（ 図1B）内に有意な体重減少の中に下痢になりました。この実験では観察されなかったが、C。ディフィシル R20291の高用量でチャレンジしたマウスは、重症になったり、48で20％以上の体重減少を持つことができます- 72時間チャレンジ後、このように人道的な安楽死を必要とします。したがって、マウスは1日2回の最小値.......

Discussion

このプロトコルは、 C. difficile R20291胞子に挑戦された抗生物質治療マウスの体重減少、細菌のコロニー形成、毒素細胞毒性、および消化管の組織病理学的変化を含む臨床経過を特徴付けます。プロトコル内には、細部への注意が不可欠な重要なステップがいくつかあります。 C.ディフィシル 胞子接種物の正確な計算は重要です。この計算は、元の C.ディフィシル 胞子ストックの列挙に基づいており、このプロトコルを開始する前に、複数の胞子の列挙で一貫している必要があります。接種量の計算が間違っていると、マウスの接種量が不正確になります。同様に、これらの計算に基づく C.ディフィシル 胞子の調製と希釈は注意して調製する必要があります。希釈エラーがあると、開始胞子接種物が不正確になります。最後に、抗生物質で処理された対照マウス( C.ディフィシル 胞子を接種していない)の汚染を避けるための予防措置を講じる必要があります。セフェラゾンで処理されたマウスは、 C.ディフィシル のコロニー形成に非常に敏感であるため、 C.ディフィシル

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#62 ペリセプト 散形除菌クリーナー	SSS Navigator	48027	この製品は、メーカーが推奨する
0.22 μmフィルター	フィッシャーブランド	09-720-3	ベロセルアッセイで試験された個々のサンプル用のフィルタープレートの代替品
0.25% トリプシン-EDTA	Gibco	25200-056	37°Cで水浴中で加熱する必要があります。C 使用前に
0.4% トリパン ブルー	Gibco	15250-061
1% ペニシリン/ストレプトマイシン	Gibco	15070-063
10% 熱不活性化 FBS	Gibco	16140-071	37°Cでウォーターバスで加熱する必要があります。C:
1mlのプラスチックシリンジを使用する前のC	BD医療用品	309628
1x PBS	Gibco	10010-023
2 ml マイクロ遠心分離機スクリューキャップ	コーニング	430917
96ウェル細胞培養フラットボトムプレート	Costar コーニング	CL3595
96ウェルフィルタープレート	ミリポア	MSGVS2210
接着シール	ThermoScientific	AB-0558
Bacto Agar	Becton Dickinson	214010	TCCFAプレートの一部(下記参照)
Bacto Proteose Peptone	Becton Dickinson	211684	TCCFAプレートの一部(下記参照)
セフォペラゾン	MP Bioworks	199695
Cefoxitine	Sigma	C47856	TCCFAプレートの一部(下記参照)
Clostridium difficile Antitoxin Kit	Tech Labs	T5000	Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin A	List Biological Labs	152C	Positive control for Vero Cell Assay
D-cycloserine	Sigma	C6880	TCCFAプレートの一部(下記参照)
蒸留水	Gibco	15230
DMEM 1x Media	Gibco	11965-092	37°Cで水浴中で加熱する必要があります。C フル
クトース	ッシャーL95500	TCCFAプレートの一部(下記参照)
血球計算盤	Bright-Line, Sigma	Z359629
KH2PO4	Fisher	P285-500	TCCFAプレートの一部(下記参照)
MgSO4(無水)	Sigma	M2643	TCCFAプレートの一部(下記参照)
Millex-GS 0.22 μmフィルター	Millex-GS	SLGS033SS	TCCFAプレート用フィルター
Na2HPO4	Sigma	S-0876	TCCFAプレートの一部(下記参照)
NaCl	Fisher	S640-3	TCCFAプレートの一部(下記参照)
Number 10 使い捨てメス刃	Miltex, Inc	4-410
PCRプレート	フィッシャーブランド	14230244
プラスチックペトリ皿	Kord-Valmark Brand	2900
滅菌プラスチックL字型細胞散布機	フィッシャーブランド	14-665-230
シリンジステッパー	ダイマックスコーポレーション	T15469
タウロコール酸	シグマ	T4009	TCCFAプレートの一部(下記参照)
超純水	Invitrogen	10977-015
C57BL/6J マウス	ジャクソン研究所	664	マウスは生後5〜8週齢である必要があります
オリンパスBX43F光学顕微鏡	オリンパスライフサイエンス
DP27カメラ	オリンパスライフサイエンス
cellSens Dimensionソフトウェア	オリンパスライフサイエンス