方法論記事

レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現

DOI：

10.3791/54858

⸱

2017年1月19日

 ,  ,  ,  , 
1Unit for Lymphopoieseis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, 2Center for Translational Science, Institut Pasteur, INSERM UMS20

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、クローンレベルでの遺伝子の大規模な配列の発現を評価する方法について説明します。単一細胞RT-qPCRをサンプルと数百の遺伝子のための強力な感度を有する信頼性の高い結果が得られます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

遺伝子発現の不均一性は、リンパ集団で調査する興味深い特徴です。これらの細胞における遺伝子発現は、細胞活性化、ストレス、又は刺激中に変化します。単一セルマルチプレックス遺伝子発現は遺伝子1、2、3の数十の同時評価を可能にします。単一細胞レベルでは、多重遺伝子発現は、集団の不均一4,5判定する。これは、成熟した細胞間の多様な前駆段階の可能性ミックスとも刺激に対する細胞応答の多様性の両方を決定することにより、人口の異質性の区別を可能にします。

先天性リンパ系細胞（ILC）は最近、免疫応答6、7の生来のエフェクターの集団として記載されています。 ILC彼のこのプロトコルでは、細胞の不均一paticコンパートメントは恒常性の間に検討されています。

現在、遺伝子発現を評価するための最も広く使用される技術は、RT-qPCRのです。この方法は、一度に遺伝子発現1つの遺伝子のみを測定します。複数のセルを1つのテストのために必要とされるのでさらに、この方法は、遺伝子発現の不均一性を推定することができません。これは、集団の平均遺伝子発現の測定をもたらします。多数の遺伝子を評価する場合、RT-qPCRのは、時間、reagent-、およびサンプルのかかる方法になります。したがって、トレードオフがグローバル画像を欠落するリスクを増大させる、評価することができる遺伝子または細胞集団の数を制限します。

この原稿は、単一細胞マルチプレックスRT-qPCRには、これらの制限を克服するために使用することができる方法を記載しています。この技術は、最近のマイクロフルイディクス技術の進歩1、2から恩恵を受けています。マルチプレックスRT-qPCRをチップに起こる反応はEXCありませんナノリットルレベルをEED。したがって、単一細胞遺伝子発現、ならびに同時に複数の遺伝子の発現、reagent-、試料 - 、および費用対効果の高い方法で行うことができます。異なる発達段階で、または異なる条件4,5の下で集団内の細胞のサブセット間クローンレベルでの細胞遺伝子シグネチャーの不均一性をテストすることができます。単一細胞レベルでの条件の数が多い希少な集団での作業はもはや制限ではありません。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

過去数年間、先天性リンパ系細胞（ILCS）は、ますます研究されてきました。抗原特異的受容体の欠如にもかかわらず、彼らはリンパ系統に属し、組織の恒常性や炎症のための重要な番兵を表します。 ILCSは、現在、特定の転写因子の組合せの発現におよびサイトカイン6,7を産生する能力に基づいて3つのグループに分けています。

ILCSは、特定のサイトカイン産生8、9を介して多様な器官における数多くの恒常性および病態生理学的状況に貢献しています。これらの細胞の役割を理解することができるためには、臓器ごとに様々なILC亜集団を決定し、それらの発達の関係を識別することが重要です。また、異なるサブセット間の可塑性の現象が関連しています。異質性を研究することによって1つの器官に存在する細胞では、成熟のその段階を区切るために、それらの特定の機能を区別することが可能です。

単一セルの多重RT-qPCRの技術を説明するために、肝ILCSは同じILCグループ（タイプ1 ILC）10内に、その異質性に特に重点を置いて、選択されました。まず、フローサイトメトリーを使用することによって、三つの異なるILC集団は、肝臓中で特徴づけました。他の二つの集団が、稀な肝ILC集団（先天性エフェクターの5％未満）でありながら、グループ1 ILCは、生来のエフェクターの約80％を占めています。これらの集団は、ILC集団の広く発現される細胞表面マーカーを用いて選別しました。その結果、肝臓におけるILC集団が別に広く同様のものを見て選別しました。

シングルセル多重RT-qPCRを速やかにこれらの集団11の不均一性を調査するための最良の手法の一つとして浮上していますアップ。二つの主な特徴は、単一細胞マルチプレックスRT-qPCRの技術を利用して決定されます。まず、クローンレベルを見て、明らかに類似した発達段階を示す細胞との比較のために、細胞特異的遺伝子発現を回復することが可能です。そして、遺伝子発現の予め選択された組み合わせを見ることによって、我々は、1つの時点での同時の遺伝子発現パターンに基づいて、新たな遺伝子特性を決定します。技術は、クローンレベルで行われるので、これらの態様は、さらに稀な集団に、多数の細胞のための発現データの多様な収集を可能にします。これにより、肝臓におけるILC異質性が適切に評価することができます。

次に、グローバルILC表現型を有するすべての細胞を選別することにより、肝臓ILC集団の複数の遺伝子の発現の広範な概要は、それらが非常にまれな集団を表していても、得られます。マイクロ流体ベースのチップもで実験を可能にします細胞物質の少量。その結果、希少細胞集団の遺伝子発現プロファイルを得ることができます。オンライン遺伝子特性分析ソフトウェアを用いて、細胞集団のクラスタと電位セルとの関係を調べることができます。これにより、機能テストは、in vivoレベルでクラスタリングデータを検証するために行うことができます。

遺伝子発現の十同じチップ3、11、12の数百以上の単一の細胞に同時に評価することができます。アッセイの設計は、実験の最長かつ最も重要な部分です。試験されるべき仮説に関連する遺伝子の決意は、適切な結果を得るために最も重要です。 （そのようなソートに使用される公知の表面マーカーなど）第二に、内部統制および特定のコントロールが必要とされています。これは、プライマー増幅特異性、増幅効率、およびtをテストすることが重要ですプライマー競争の彼が不在。セルの複数の遺伝子発現を同時に評価されるようにそのため、単一セル多重RT-qPCRをでの作業は、時間節約テクニックです。

すべてのセルのための試薬の同じチップとミックスを使用すると、操作のエラーの可能性を制限し、サンプル間の再現を可能にします。要するに、単一セル多重RT-qPCRをのさまざまな側面は​​、サンプルや遺伝子の幅広い感度の偉大なレベルで、クローンレベルでの信頼性の高い結果の生成を可能にします。得られた結果は、生物統計学的試験のための強力かつ堅牢なデータを提供しています。

これは、材料の非常に少量の作業を可能にし、徹底的な結果をもたらす方法のマイクロ流体態様に達成することができます。最後に、オンラインソフトウェアを使用して、所望の集団を比較することができます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

全ての動物実験は、フランス農業省とEUのガイドラインに従ってパスツール研究所安全委員会の承認されました。

1. 96ウェルシングルセルソーティングプレートを準備します

  1. 特定のレトロ転写緩衝液5.0μlを、低エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、TE緩衝液（10mMのTE溶液を、pHが8、および0.1mM EDTA溶液の1.3μLを添加することによって、1.5mlチューブ中でプレ増幅ミックスを調製し、0.2μM濾過）、そしてウェル当たりのTaq DNAポリメラーゼ0.2μlの（ 図1a）。
  2. 96ウェルプレートに、各ウェル（最大48ウエル）にプレ増幅混合物の6.5μLを配布します。このプレートを、96ウェルの単一細胞選別板です。
    注：電子ピペットを用いて、このプロトコルのために推奨されます。これは、正確で再現性の体積測定を可能にし、時間を節約できます。

figure-protocol-1
（a）は、96ウェルの単一細胞選別プレートに、前増幅ミックスは、0.2×アッセイ混合物、続いて最初に分配されます。 （b）は 、それぞれの単セル位置の記録は、スプレッドシート上で維持されるべきです。ウェルの細胞なしの「入力なし」ウェルと呼ばれ、コントロールとして使用することができます。 2つの行がcDNAの希釈（1セルに10 5個の細胞の等価からシーケンシャル1・イン・10希釈液）でプライマー効率を制御するために免れることができます。 （C）96ウェルアッセイプレートに、アッセイローディング試薬は、プライマーを添加し、最初に分配されます。各プライマーの位置のレイアウトを維持することを忘れないでください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. 各プライマーの1.4μlの（; 48異なるプローブまで、 表1を参照のプライマー20倍）を添加することにより、1.5ミリリットルチューブで0.2×アッセイミックスを調製します。低EDTA TEバッファーで140μLへの最終的な音量を調整します。
  2. プレ増幅混合物を含む96ウェルシングルセルソーティングプレート48ウェルに0.2×アッセイミックスの2.5μLを配布します。
    注：96ウェルサンプルプレートの各ウェルの最終容量は9μlであるべきです。
  3. カバーフィルムでプレートをシール。プレートをボルテックスし、45秒間280×gでスピンダウン。 -20℃で96ウェルシングルセルソーティングプレートを保存したり、すぐにそれを使用しています。

2.単一細胞解離

  1. CO 2の送達システムを使用して、低酸素によってマウスを安楽死させます。解剖プレートの上でマウスを修正し、ハサミを使って縦に腹腔を開きます。
  2. 肝臓からILCSを回復します。
    1. 肝臓の分離に先立ち、フラッシュLIVER-循環細胞。
      1. 門脈を引き出すために、マウスの左側に小腸および大腸を移動します。門脈は、腹腔内の最大の静脈として表示されます。
      2. 10mLの注射器0.45ミリメートルの針を用いて、門脈を介してリン酸緩衝生理食塩水媒体（PBS）を用いて肝臓をフラッシュします。肝臓洗浄を容易にするために、ハサミで胃動脈を切りました。
      3. 胆嚢を削除するには、鉗子で胆嚢の底をつまんでハサミで肝臓から分離。
      4. 肝臓を単離するために、鉗子で肝臓のベースをピンチし、はさみを使用して、腹腔の残りの部分から肝臓を分離します。
      5. ロズウェルパーク記念研究所培地5mlの（RPMI）、2％ウシ胎児血清（FCS）でポッターチューブに肝臓を転送します。
  3. 乳棒を用いてメカニック解離で肝臓を解離。 15ミリリットルチューブにメディアを転送します。全量をRPMI、2％FCSを含む14ミリリットルに。肝細胞をデカントするために15〜20分間氷上で細胞懸濁液のままにしておきます。
  4. 1ミリリットルピペットを使用して、新しい15mlチューブ中（肝細胞なし）、上清を回収（上清の12ミリリットルを期待することができます）。 10℃で7分間、120×gでスピンダウン。遠心分離後、上清を捨てます。
  5. 密度勾配培地14 ml中の工程2.4で得られたペレットを再懸濁（ 例えば、パーコール40％）。 20℃で20分間、600×gでスピンダウン。吸引により上清を取り除きます。
  6. 酢酸カリウム（ACK）1mlにペレットを再懸濁します。 1分間室温のままにしておきます。 1分後、ハンクス平衡塩漬け溶液（HBSS）、2％FCSを含む14ミリリットルに全量を。 10℃で7分間、120×gでスピンダウン。上清を捨てます。
  7. 細胞を染色。
    1. ビオチン化抗体混合物300μlの中にペレットを再懸濁（ 材料表を参照してください。すべてのビオチン化抗体を追加言及編）1.5 mlチューブに細胞を移します。 4℃で20分間、暗闇の中でそれを残します。
    2. HBSS 2％FCSを1ミリリットルに全量を。 10℃で7分間、120×gでスピンダウン。 （ 材料表を参照してください。上記のすべての蛍光色素結合抗体を追加）蛍光色素結合抗体混合物および蛍光標識ストレプトアビジン300μlの中にペレットを再懸濁。 4℃で20分間、暗闇の中でそれを残します。
  8. HBSS 2％FCSを1ミリリットルに全量を。 10℃で7分間、120×gでスピンダウン。 1ミリリットルピペットを用いて上清を取り除きます。 1ミリリットルHBSSでペレットを再懸濁し、（PI; 1：4000）ヨウ化プロピジウム。
    注：広く発現ILC細胞表面マーカーを使用する場合は、3集団が定義されています。NKp46の+ IL-7Rαを- 、NKp46の+ IL-7Rα+、およびNKp46の- IL-7Rα+。すべての集団は系統をソートされている- CD3 - CD4 - CD45.2 +。

3.単一細胞蛍光活性化細胞選別（FACS）

  1. 単セル13をソートするために、FACSを使用してください。
    注：異なる細胞型は、同じ96ウェル単一細胞選別プレート上で選別することができる（ 図2）。
    1. よく0.2×アッセイミックスし、96ウェルシングルセルソーティングプレート上のプレ増幅混合物を含むごとに1つのセルをソートするために、FACSを使用してください。新たに調製した96ウェルのシングルセルソーティングプレートを使用するか、-20℃で保存した場合、それを解凍。
      1. FACSプレートホルダーに密封された96ウェルプレートを置きます。テストとして、空の96ウェルプレートを使用してください。でプレートを置きA1ウェル左側にし、実験者の方へ。
      2. 検証ビーズでA1ウェルの中心の低下を得るために、プレートホルダーを調整します。
      3. ラインA内のすべてのウェルを有する繰り返し手順3.1.1.2
      4. 96ウェルプレートからシールを取り外して、ソートウェルあたり100検証ビーズ。 Dをチェック井戸の中心部にあるROP形成。
      5. 適切に調整すると、プレートホルダーに96ウェルのシングルセルソーティングプレートを配置します。プレートレイアウトやウェルあたりソート1セルを描画します。
        注：96ウェルシングルセルソーティングプレート上の各セルの適切な位置決めが不可欠です。プレートレイアウトは、表計算ソフト上で維持されるべきです。プレートレイアウトは、次のいくつかのステップ（ 図1b）14で使用されます。細胞なしで96ウェルサンプルプレート上の1つのウェルを含む0.2×アッセイミックスとプレ増幅混合物を残します。このウェルは、無入力コントロールとして使用します。 cDNAの希釈のために6ウェルの2行を残します。これらのウェルは、プライマー効率（ 図1b）のためのコントロールとして使用されています。
      6. -20℃で96ウェルシングルセルソーティングプレートを保存したり、すぐにそれを使用しています。

4.プレ増幅

  1. 新鮮なまたは解凍した96ウェルのシングルセルソーティングプレートOBTを使用しますステップ3.1.1.6でained。 （45秒間280 XG）プレートをボルテックスして、それをスピンダウン。
  2. サーモサイクラー上の96ウェルシングルセルソーティングプレートを置きます。 図3および表2に記載されたプログラムに従って逆転写およびプレ増幅を行います。

figure-protocol-2
図3：プレ増幅プログラム。十分な材料を得るために、ソートされた単一の細胞に特異的な標的遺伝子のプレ増幅が必要です。 96ウェルの単一細胞選別板は、前増幅プログラムに従うことをサーモサイクラーにロードされています。前増幅産物は、その後、低EDTA TE緩衝液で希釈され、すぐに使用するか、または-20℃で凍結することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. プリアンプを希釈各ウェルに低いEDTAのTE緩衝液36μLを追加することにより、サンプルをlified。
  2. カバーフィルムでプレートをシール。 （45秒間280グラム）プレートをボルテックスして、それをスピンダウン。 -20℃で予備増幅し、96ウェルシングルセルソーティングプレートを保存したり、すぐにそれを使用しています。

5. 96ウェルサンプルプレートを準備

  1. 定量PCRマスターミックスとサンプルローディング試薬の17.5μlの175μlのを追加することによって、マスターミックスの191μLを準備します。
  2. 新しい96ウェルプレートに、各ウェル（最大48ウエル）にマスターミックスの3.6μLを配布します。これは、96ウェルサンプルプレートです。
  3. 新しい96ウェルプレートに96ウェルサンプルプレートからプレ増幅したcDNAの2.9μLを移します。 96単一細胞選別プレートと96ウェルサンプルプレート間の各サンプルに対して同じ位置にしてください。
  4. カバーフィルムでプレートをシール。 （45秒間280 XG）プレートをボルテックスして、それをスピンダウン。光から保護氷上で新しい96ウェルプレートを置きます。 96ウェルSを格納します-20℃で十分なプレートはすぐにそれを使用しますか。

6. 96ウェルアッセイプレートを準備します

  1. 新しい96ウェルプレートに、各ウェル（最大48のウェル）でアッセイローディング試薬の3μLを配布します。このプレートは、96ウェルアッセイプレートと呼ばれます。
  2. 各ウェルにプライマーの3μLを加えます。表計算ソフトでレイアウトを維持し（ 図1cおよび表1、 表1に記載されているすべてのプライマーを使用します）。 96ウェルアッセイプレート上の各プライマーの適切な位置決めは、次のいくつかのステップのために不可欠です。
    1. サンプル数が48未満の場合、未使用のウェルに水の代わりにプライマーを加えます。
  3. カバーフィルムでプレートをシール。 （45秒間280 XG）プレートをボルテックスして、それをスピンダウン。 -20℃で96ウェルアッセイプレートを保存したり、すぐにそれを使用しています。
    注：プライマーの凍結融解の繰り返しを避けるために、プレ増幅混合物のため、96 WELのためのプライマーを配布同時にリットルのアッセイプレート。

7.単一細胞遺伝子発現チップ

  1. ベンチに統合されたマイクロ流体回路（IFC）を配置し、キャップされた注射器を使用してバルブを確認してください。 、注射器を開き、バルブに垂直に置き、しっかりと押します。 Oリングが移動する必要があります。制御線流体（ツベルクリンの0.3ミリリットル）でチップを埋めます。
  2. 第二の弁で手順を繰り返し7.1。
    注：いいえ液体がチップ上にこぼしてはなりません。
  3. チップの底部から青いフィルムを削除します。 IFCコントローラにチップをロードします。 IFCコントローラの画面で、「PRIME」を選択し、「RUN」。マイクロ流体ラインの制御は、10分間続きます。
  4. チップを取り出し、チップの底に青いフィルムを再密封します。

figure-protocol-3
図4：単一細胞多重遺伝子発現チップ搭載。これらの手順は、グラムを必要とします特に、単一セルの多重遺伝子発現チップに96ウェルプレートの転送中reat精度、。ロードエラーとmisplacementsを回避するために、非常に順次動作することをお勧めします。各転送のためのボリュームは、ピペッティングプロセスの間に制御されなければなりません。最後に、気泡を回避し、形成した場合に、それらを除去することが重要です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. 8チャンネルピペット、転送チップのA1側（左側）に96ウェルアッセイプレートから5μLを使用しました。 図4に示すように、チップの左側を埋めます。常に先端に同じボリュームを描画するように注意してください。
    1. 泡を作成しないでください。泡が表示された場合は、10μlのヒントを使用してそれらを削除します。チップの各ウェルのためのヒントを変更します。
  2. 右側O上の繰り返し手順7.596ウェルサンプルプレートから5μLを使用してFチップ。
  3. チップの底部から青いフィルムを削除します。 IFCコントローラにチップをロードします。 IFCコントローラの画面で、「RUN SCRIPT」を選択し、「RUN」。マイクロ流体ラインのロードは45分続きます。
  4. チップを取り出し、チップの底に青いフィルムを再密封します。

8.チップを実行します。

  1. マイクロ流体のqPCRコンピュータでは、「データ収集」ソフトウェアを選択します。それが開始されると、「新しいファイル名を指定して実行」を選択します。
  2. 「取り出し、「チップの底部から青い膜を除去し、チップのロードを選択します。左側に実験者に向かってA1ウェルを得るためにチップを置きます。
  3. 「プロジェクトの設定、 "その後" None "を選択し、上の「次へ」を
  4. 「新しいチップラン、「「新しいチップディレクトリ」（実験用のフォルダを作成）、および「Next]を選択します。」
  5. 「遺伝子発現」を選択し、「オン;パッシブリファレンス= ROX」（カルボキシ-X-ローダミン）および「単一プローブは、「プライマーに応じて適切なフィルタを選択選択します。「次へ」。
  6. 「ブラウズ」と使用するプライマーに応じて正しいプログラムを選択する]を選択します。
    注：「デフォルト - 10分-Hotstart.pclは、「シングルセル多重RT-qPCRのための最も一般的に使用されるプログラムです。
  7. 「スタートファイル名を指定して実行」を選択します。反応は、約90分かかります。
  8. いったん終了し、「取り出し-完了」を選択します。

9.データ解析

  1. 実験のフォルダを検索し、選択して "オープン"、 "リアルタイムPCR解析」ソフトウェアを開き、「ファイル」を選択し、「ChipRun.bmlファイルを。」
  2. 「分析ビュー」、「結果表」と「ヒートマップビューをクリックして、「 "X"でマークされたボックスは、閾値検出レベル未満であり、および/または不良な増幅曲線を有していました。
  3. サンプルに名前を付けます。 「サンプルの設定」に移動し、SEL電気ショック療法 "新SBS 96」 「マッピング」をクリックして選択し、「...」をコピーして表計算ソフトからのサンプルレイアウト設計を貼り付けます。貼り付けレイアウトの定義」サンプル名。 "
  4. アッセイに名前を付けます。繰り返しステップにおけるプライマーの名前を持つ9.3 "検出器のセットアップ。」貼り付けレイアウトの定義」を検出器の名前。 "
  5. 「分析ビュー」をクリックし、「分析; "サンプルおよびプライマー名は、サンプルおよびプライマー（ 図7）に自動的に関連付けられます。
  6. CT、デルタのCtを計算し、各サンプルの変更を折ります。内部統制（ここでは、GAPDH）としてハウスキーピング遺伝子を使用します。
    ΔCt= Ctをサンプル - Ctを内部統制
    = 2倍変化- （ΔCtsample-ΔCtnegative制御）
    1. （遺伝子発現を正規化するための内部コントロールとしてハウスキーピング遺伝子を使用）」検出器のセットアップ」をクリックし、無入力コントロールとよくを選択します。選択して "Editor、 ""、参照を定義」と「更新」。
    2. 上記に定義された内部統制が適用されると、すべてのウェルを選択します。 「エディタ」を選択し、「テストとして定義しています。」適切なリファレンス遺伝子を選択し、クリックして「更新」を
    3. よくネガティブコントロールを選択するには、「サンプルの設定」を選択します。 「エディタ」を選択し、定義する「リファレンス」を参照してください。 「更新」をクリックします。
    4. 「分析ビュー」を選択し、「分析; "デルタCTおよび倍の変化を自動的に計算されます。
  7. データをエクスポートします。 、表の結果」として保存、エクスポート」「ファイル」と選択」先のフォルダを選択し、ヒット "保存"と "終了"。
  8. 繰り返しステップ9.7が、代わりの「表の結果、「名前を付けて保存」ヒートマップの結果。」

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

リンパ系集団は、遺伝子発現に大きな多様性を示します。このプロトコルでは、肝臓ILC区画の不均一は、単一細胞マルチプレックスRT-qPCRの遺伝子発現を用いて調べました。他の遺伝子発現技術とは異なり、単一細胞マルチプレックスRT-qPCRの遺伝子発現を同時に、さらに希少、いくつかの集団での作業を可能にします。クローンレベルで高感度に結合されたこの特異性は、集団内で希少な集団間の遺伝子特性の違いを調査することができます。一例として、4週齢のマウスの肝臓から3 ILC集団の遺伝子サインを評価しました。他の2つは肝臓で（系統陰性細胞の1％未満）はまれであるのに対し、一つの人口は、容易に識別するのに十分に頻繁です。

96ウェルシングルセルソーティングプレートと96ウェルアッセイプレートは、肝dissectio前に調製しましたnおよび解離（ 図1）。各ミックスは無菌フード下で調製し、ボリューム精度と再現性のための電子ピペットで配...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、クローンレベルでの網羅的な遺伝子発現情報を取得する方法について説明します。ここでは、肝臓ILCコンパートメントの不均一性を調べました。 （広く発現ILC表面マーカーに基づいて）異なるILC集団の単一細胞選別後、サンプルを特定の予め選択された遺伝子のための予備増幅しました。次に、得られたcDNAおよびプライマーは、多重RT-qPCRをマイクロ流体チップにロードしました。最後に、我々は48の単一細胞からの48の異なる遺伝子の発現を得ました。遺伝子発現の結果は、遺伝子サイン及び細胞集団の関係を調査するためのオンラインソフトウェアによって分析しました。

この手法の主な利点は、同時に複数の遺伝子の発現を評価する能力です。また、クローンレベルで、非常にまれな集団での作業を可能にします。遺伝子発現は、クローンレベルで評価されているので、従来のRT-qPCRの方法とは異なり、単一セル多重RT-qPCRを、ない平均化効果がありません。このようにして、集団内の不均一性を検出し、分析することができます。ごく少数の細胞が遺伝子発現の全体の情報を得るために必要とされるので、単一細胞RT-q...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作業は、Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot, and the Ministère de la Recherche (to S.C.); Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ''Twothyme'' to A.C.);ANR助成金「Myeloten」(R.G.へ)。および国立がん研究所(肝臓発がん中の免疫微小環境の役割、R.G.)。パスツール研究所のCenter for Human Immunology and Cytometryプラットフォームのご支援に感謝いたします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Cells Direct One Step qRT-PCRキットApplied Biosystems 11753100プライマープローブ検出キット。2x反応ミックス、SSIIIプラチニウム酵素が含まれています。
Low TE EDTA BufferAffymetrix75793 100ML
96 ウェルプレートThermofisher ScientificAB 110096 ウェルプレート 細胞のソーティングとサーモサイクリングに対応
カバーフィルムDominique Dutscher106570アルミニウムカバーフィルム; 汚染と蒸発を回避
ActbThermofisher ScientificMm00607939_s120x プライマー
AESサーモフィッシャー・サイエンティフィMm01148854_s120x プライマー
Ahrサーモフィッシャー・サイエンティフィックMm00478932_s120x プライマー
Bcl2サーモフィッシャー・サイエンティフィ・Mm00477631_s120x プライマー
c-mycサーモフィッシャー・サイエンティフィMm00487804_s120x プライマー
Cbfbサーモフィッシャー・サイエンティフィック・サイエンティフィMm01251026_s120x プライマー
Cd27Thermofisher ScientificMm01185212_s120x プライマー
Cd49aThermofisher ScientificMm01306375_s120x プライマー
CD49bThermofisher ScientificMm00434371_s120x プライマー
Cxcr5Thermofisher ScientificMm00432086_s120x プライマー
Cxcr6Thermofisher ScientificMm02620517_s120x プライマー
EomesThermofisher ScientificMm01351985_s120x プライマー
Ets1Thermofisher ScientificMm01175819_s120x プライマー
Foxo1Thermofisher ScientificMm00490672_s120x プライマー
GapdhThermofisher ScientificMm03302249_s120x プライマー
Gata3Thermofisher ScientificMm00484683_s120x プライマー
Gm-csfサーモフィッシャー サイエンティフィMm01136644_s120x プライマー
Hes1サーモフィッシャー サイエンティフィックMm01342805_s120x プライマー
Hprtサーモフィッシャー サイエンティフィックMm00446968_s120x プライマー
Id2サーモフィッシャー サイエンティフィMm01293217_s120x プライマー
Il-12rb2サーモフィッシャー・サイエンティフィMm00711781_s120x プライマー
Il-18r1サーモフィッシャー・サイエンティフィック・Mm00515178_s120x プライマー
Il-1rl1サーモフィッシャー・サイエンティフィック・Mm00434237_s120x プライマー
Il-22モフィッシャー・サイエンティフィMm001226722_s120x プライマー
Il-23rサーモフィッシャー・サイエンティフィMm00519943_s120x プライマー
Il-2raサーモフィッシャー サイエンティフィMm01340213_s120x プライマー
Il-2rbサーモフィッシャー サイエンティフィックMm01195267_s120x プライマー
IL-7rサーモフィッシャー サイエンティフィックMm00434295_s120x プライマー
KLR5サーモフィッシャー サイエンティフィMm04207528_s120x プライマー
Lef1サーモフィッシャー サイエンティフィック Mm00550265_s120x プライマー
Ncr1サーモフィッシャー サイエンティフィMm01337324_s120x プライマー
Nfil3サーモフィッシャー サイエンティフィックMm01339838_s120x プライマー
Notch1サーモフィッシャー サイエンティフィMm00435249_s120x プライマー
Notch2サーモフィッシャー サイエンティフィMm00803069_s120x プライマー
ローラサーモフィッシャー サイエンティフィックMm01173766_s120x プライマー
RorcThermofisher ScientificMm01261022_s120x プライマー
Runx3Thermofisher ScientificMm00490666_s120x プライマー
Tbx21Thermofisher ScientificMm01299453_s120x プライマー
Tcf3サーモフィッシャー サイエンティフィMm01175588_s120x プライマー
Tcf7サーモフィッシャー・サイエンティフィMm00493445_s120倍プライマー
Tle1サーモフィッシャー・サイエンティフィック・サイエンティフィック・Mm00495643_s120倍プライマー
Tle3サーモフィッシャー・サイエンティフィMm00437097_s120倍プライマー
Tsc22d3サーモフィッシャー・サイエンティフィック・サイ20倍プライマー
Tnfrsf11aサーモフィッシャー・サイエンティフィックMm00437132_s120倍プライマー
ToxThermofisher ScientificMm00455231_s120x プライマー
Zbtb16Thermofisher ScientificMm01176868_s120x プライマー
Zbtb7bThermofisher ScientificMm00784709_s120x プライマー
qPCR マスターミックス Applied BioSystemsP/N 4304437
2x Assay Loading ReagentFluidigmP/N 85000736マルチプレックスRT-qPCRマイクロ流体チップにアッセイをロードするための比密度媒体です。 
2x サンプルローディング試薬FluidigmP/N 85000735比重媒体 マルチプレックスRT-qPCRマイクロ流体チップにサンプルをロードします。 
48.48 マルチプレックス RT qPCR マイクロ流体チップFluidigmBMK-M-48.4848.48 遺伝子発現用ダイナミックアレイ IFC;シングルセルマルチプレックスRT-qPCR反応用チップ
48.48 マルチプレックス RT qPCR マイクロ流体チップコントローラFluidigm8900002048.48 IFC Controller; チップ内部の流体システムを制御し、サンプルとアッセイを反応チャンバーにロード
マルチプレックスRT qPCR マイクロ流体サーモサイクラーFluidigmGE48.4848.48 ダイナミックアレイ IFC サーモサイクラー
96ウェルプレートサーモフィッシャーサイエンティフィックAB 1100細胞の選別とサーモサイクリングに適した96ウェルプレート
C57Bl/6マウスJanvierC57Bl/6 miceJ@RJ
10 ml シリンジBD Biosciences309639
PBSLife Technologies14040174
HBSSLife Technologies24020133
RPMILife Technologies61870044
FCSCVFSVF000UEurobio AbcysStandard 子牛胎児血清
ポッターチューブN/A
15 ml チューブコーニング352097
1.5 ml チューブSigma-AldrichT9661-1000EA
FACS マシンN/A
遠心分離機 サーモフィッシャーサイエンティフィック75004538
1,000 & マイクロ;l tipsフィッシャー・サイエンティフィック・サイエンティック・10313272
P1000 GilsonF123602
PercollDominique Dutscher17-0891-01
Facs tubeFalcon352235
anti-CD8 Biotin mouse antibodySony1103520lineage antibody
anti-CD19 Biotin mouse antibodySony1177520lineage antibody
anti-TCRab Biotin mouse antibodyBioLegend109204系統抗体
抗TCRgd ビオチンマウス抗体BD Biosciences553176系統抗体
抗Ter119 ビオチンマウス抗体BD Biosciences553672系統抗体
抗Gr1 ビオチンマウス抗体BD Biosciences553125系統抗体
抗CD45.2 PerCPCy5.5 マウス抗体BioLegend109828
抗IL7ra PeCy7マウス抗体ebioSciences25-1271-82
抗CD3 BV510マウス抗体BD Biosciences563024
抗CD4 BV786マウス抗体BD Biosciences563727
抗NKp46 PEマウス抗体ebioSciences12-3351-82
ストレプトアビジンソニー 2626025
ヨウ化プロピジウムSigma-AldrichP4864-10ML
電動ピペットエッペンドルフ4986000017
Combitips 0.1 mlエッペンドルフ30089405
マルチチャンネルピペットレイニンL8-10XLS+
AccudropBD Biosciences345249FACS用検証ビーズ
ック・サイエンティフィック ・ックック・ック・ック ック ック・ サーック・ック・ック ック ック ック ック ック ック・ック・エンティフィック・Mm01306210_s1 ・サイエンティフィック・フィ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
  2. Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
  3. Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
  4. Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
  5. Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
  6. Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
  7. Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
  8. Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
  9. Monticelli, L. a, Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
  10. Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
  11. Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
  12. Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
  13. Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
  14. Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
  15. Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
  16. Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

Single cell Gene ExpressionMultiplex RT qPCRRare Lymphoid PopulationsInnate Lymphoid CellsHepatic ILC CompartmentFluorescence activated Cell SortingMicrofluidic qPCR ChipPre amplification MixGene Expression HeterogeneityReal time PCR Analysis

関連記事