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方法論記事

肺癌標的化ナノ粒子と光線力学療法の抗がん効能

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DOI:

10.3791/54865

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2016年12月1日

 ,  , 
1Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University Bundang Hospital, 2College of Pharmacy, Kangwon National University, 3Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Seoul National University College of Medicine

この記事について

サマリー

光線力学療法(PDT)は、肺がん治療の代替選択肢です。PDTの治療効果を高めるために、化学療法と組み合わせた肺がん標的ナノ粒子が開発されました。調製されたナノ粒子を用いたPDTのin vitroおよびin vivoの両方の抗がん効果を評価しました。

要約

光線力学療法(PDT)は、非侵襲的で非外科的な方法であり、肺がん治療の魅力的な代替選択肢を表しています。光増感剤は腫瘍組織に選択的に蓄積し、酸素と適切な波長の光の存在下で腫瘍細胞死を引き起こします。

PDTの治療効果を高めるために、私たちは光増感剤と抗がん剤の両方を充填した肺がん標的ナノ粒子を開発しました。EPR(Enhanced Permeability and Retention)効果に基づくパッシブターゲティングと、ヒアルロン酸-CD44相互作用に基づくアクティブターゲティングの両方を適用した。CD44は、非小細胞肺がんのバイオマーカーとしてよく導入されるヒアルロン酸受容体としてよく知られています。

さらに、本研究ではPDTと化学療法の組み合わせが採用されています。この組み合わせの概念は、抗がん剤治療効果を高め、副作用を減らす可能性があります。

この研究では、新規の光増感剤としてヒポクレリンB（HB）を選択しました。HBは、ヘマトポルフィリン誘導体と比較してPDTの抗がん効果が高いことが報告されています1。 パクリタキセルは、肺がん2の潜在的な治療法であることが証明されているため、抗がん剤として選択されました。

光増感剤(HB)溶液、光増感剤カプセル化ヒアルロン酸-セラミドナノ粒子(HB-NP)、およびPDT後の光増感剤および抗がん剤(パクリタキセル)カプセル化ヒアルロン酸-セラミドナノ粒子(HB-P-NP)の抗腫瘍効果をin vitroとin vivoの両方で比較しました。A549(ヒト肺腺癌)細胞のin vitro光毒性と、A549担がんマウスのin vivo抗腫瘍効果を評価しました。

HB-P-NP治療グループは、PDT後に最も効果的な抗がん効果を示しました。結論として、本研究で調製されたHB-P-NPは、PDTによる肺がんの治療における潜在的で新しい光増感剤送達システムを表しています。

概要

光線力学療法(PDT)は、光増感剤、光、酸素の3つの主要な要素で構成されています。PDTは、さまざまながんの有望な治療法として報告されています3。光増感剤をがん患者に投与すると、腫瘍組織に選択的に蓄積します。適切な波長の光が印加されると、反応性の高い一重項酸素やその他のフリーラジカルが腫瘍細胞の損傷につながります4。

肺がんは、1980年代初頭にPDTの最初のアプリケーションの一つとして導入されました5。PDTは、肺がんの治療にいくつかの利点を提供します。PDTは非侵襲的で非外科的な治療法であるため、外科的切除が不適切な患者にとって魅力的な代替選択肢です。

光増感剤の癌標的効果を高めるための多くの課題がありました。がん部位における光増感剤の蓄積を増加させることと、正常組織における蓄積を減少させることは、がんを標的とする研究の同じ目標です。ポリマー、リポソーム、ナノ粒子など、さまざまな標的薬物送達システムが光増感剤キャリアとして採用されています6-8。我々の以前の研究では、ナノ粒子は光増感剤9,10のがん標的能力を効果的に増加させた。ナノ粒子は、受動的および能動的標的化能力の両方を備えているため、理想的ながん標的キャリアです。リーキーな腫瘍血管は、ナノサイズの担体が腫瘍に容易に蓄積する機会を提供し、これは強化された透過性と保持(EPR)効果11,12としてよく知られている。ナノ粒子とがん細胞上の特異的受容体との間の相互作用により、積極的ながんターゲティングが可能になります。本研究では、肺がん細胞で過剰発現する主要なヒアルロン酸受容体であるCD44と相互作用するヒアルロン酸系ナノ粒子を作製した13。

抗がん効果を最大化するために、本研究ではPDTと化学療法の組み合わせが採用されています。この組み合わせの概念により、治療効果の向上が可能になる場合があります。.さらに、光増感剤と抗がん剤の両方の用量を減らすことで、副作用を減らすことができます。本研究では、新規の光増感剤としてヒポクレリンB(HB)を選択した。HBは、中国の薬用真菌Hypocrella bambuaseから分離されます。Shangらは、HBベースのPDTは、ヘマトポルフィリン誘導体ベースのPDTと比較して高い抗がん効果を有することを報告しました1。パクリタキセルは、肺がんを含むさまざまながんの治療薬としての可能性が証明されているため、抗がん剤として選択されました2。

ここでは、光増感剤(ヒポクレリンB、HB)溶液、光増感剤内包ヒアルロン酸セラミドナノ粒子(HB-NP)、および光増感剤および抗がん剤(パクリタキセル)内包ヒアルロン酸-セラミドナノ粒子(HB-P-NP)のPDT後の抗がん効果を比較しました。A549(ヒト肺腺癌)細胞のin vitro光毒性と、A549担がんマウスのin vivo抗腫瘍効果を評価しました。

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プロトコル

注：すべての動物実験プロトコルは、盆唐ソウル大病院（BA1308-134 / 072から01）の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

ヒアルロン酸セラミドの1の合成（HACE）

  1. 二重蒸留水（DDW）の60ミリリットルでヒアルロン酸の12.21ミリモル（HA）オリゴマー及びテトラn個の -butylammonium水酸化物（TBA）の9.77ミリモルを可溶化します。 30分間撹拌しました。
  2. DS-Y30リンカーを合成するために、テトラヒドロフラン25ミリリットル（THF）中のDS-Y30セラミドの8.59ミリモルおよびトリエチルアミン9.45ミリモルを溶解します。 THF中の4-クロロメチルベンゾイルクロリドの8.59ミリモルと混合。 60℃で6時間撹拌します。
  3. THFの混合物及びアセトニトリルでDS-Y30リンカーの合成されたHA-TBAの8.10ミリモル及び0.41ミリモル溶解（4：1、v / v）でした。 40℃で5時間撹拌します。
  4. フィルター剤で濾過することにより不純物を除去し、真空蒸着法により、有機溶媒を除去します。 （透析膜を使用して生成物を精製分子量カットオフ：3.5キロダルトン）および凍結乾燥。

ナノ粒子の作製

  1. HB 1mgのジメチルスルホキシド（DMSO）0.5mlのパクリタキセル1mgを溶解し、ボルテックス混合し、5分間によってDDW 0.5mlでブレンド。その後、さらに5分間ボルテックス混合することにより、その混合物中のHACEを可溶化します。
  2. 窒素ガスの穏やかな流れの下で4時間、70℃で溶剤、熱を除去するために。
  3. DDW 1mlでHACE、HBからなる膜、及びパクリタキセルを再懸濁します。封入されていない薬物を除去するために、シリンジフィルター（孔径0.45μm）でフィルタします。

3. インビトロ光毒性

  1. 肺癌細胞株中のナノ粒子の取り込み
    1. RPMI-1640培地を含む10％の（v / v）のウシ胎児血清および1％（w / v）のペニシリン - ストレプトマイシンを準備します。
    2. 1×10 5細胞/ウェルの各々について（三連の密度で24ウェル細胞培養プレート中の種子A549細胞グループ）。加湿5％CO 2及び95％空気雰囲気中37℃で24時間インキュベートします。
    3. 細胞付着後に、培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を1ml添加して細胞を洗浄します。
    4. 2μM/ mlのHBの最終濃度になるようにPBS中のナノ粒子を溶解させます。その後、暗所で4時間、各ウェルにPBS、空のNP、HB-のNP、またはHB-P-NPの1ミリリットルで細胞を培養します。
    5. ソリューションのすべてを削除し、冷PBSの1ミリリットルを追加することによって、細胞を洗浄。もう一度洗浄工程を繰り返します。新鮮な培地を追加します。
  2. 細胞生存率アッセイ
    1. （ウェルにPDTファイバからの距離から1cmで）PDT繊維の下で細胞培養プレートを置きます。レーザー安全メガネを着用し、種々の時間暗所でPDTレーザー（630 nmで、400ミリワット/ cm 2）を用いて細胞を照らす：0、5、10、20、30、および40秒（0、2、4 、8、12、16 J / cm 2）でした。その後、暗所で24時間細胞をインキュベートします。
    2. 培地を吸引し、冷PBSを1mlを加えることによって細胞を洗浄します。もう一度洗浄工程を繰り返します。
    3. 各ウェルに細胞毒性測定溶液10μlを加えます。 2時間暗所でインキュベートします。
    4. マイクロプレートリーダーを用いて450nmで吸光度を測定します。
  3. 顕微分析
    1. （ウェルにPDTファイバからの距離から1cmで）PDT繊維の下で細胞培養プレートを置きます。レーザー安全メガネを着用し、0、20、または40秒（0、8、または16 J / cm 2）を、暗所でのPDTレーザー（630 nmで、400ミリワット/ cm 2）を用いて細胞を照らします。その後、暗所で24時間細胞をインキュベートします。
    2. 培地を吸引し、冷PBSを1mlを加えることによって細胞を洗浄します。もう一度洗浄工程を繰り返します。
    3. アネキシンV-FITCを50μlと4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI、/ mlの1.5μgの）の50μLを加えます。静かにプレートを振る、暗所で室温で15分間静置します。
      注：アネキシンV-FIを使用してください蛍光顕微鏡キットからTC。
    4. 冷PBSの1ミリリットルを追加することによって、細胞を洗浄。もう一度洗浄工程を繰り返します。新鮮なPBSで細胞を保管してください。 100Xの倍率で光学顕微鏡を用いて、アポトーシス細胞を識別します。
  4. （FACS）分析、蛍光活性化細胞選別
    1. （ウェルにPDTファイバからの距離から1cmで）PDT繊維の下で細胞培養プレートを置きます。レーザー安全メガネを着用し、0、20、または40秒（0、8、または16 J / cm 2）をするためのPDTレーザー（630 nmで、400ミリワット/ cm 2）を用いて細胞を照らします。その後、暗所で24時間細胞をインキュベートします。
    2. 培地を吸引し、冷PBSを1mlを加えることによって細胞を洗浄します。もう一度洗浄工程を繰り返します。
    3. 転送100μlを、1×結合緩衝液1mlに細胞を再懸濁（0.1MのHepes / NaOHで（pHは7.4）、1.4 MのNaCl、および25mMのCaCl 2 9重量部を蒸留水10×結合緩衝液の1部を希釈） 5ミリリットルの試料溶液の培養管。
    4. アネキシンV-FITCおよびヨウ化プロピジウム（PI）を5μlの5μlを添加します。静かにチューブをボルテックスし、暗所で室温（RT）で15分間インキュベートします。 1×結合緩衝液の400μlのを追加します。
      注：蛍光顕微鏡キットから、アネキシンV-FITCおよびPIを使用してください。
    5. FACS 14を使用して、アポトーシス細胞を識別します。 PIおよびアネキシンV-FITCの励起レーザー線は、それぞれ、488 nmおよび635 nmです。それぞれ、610±20 nmおよび660±20 nmでPIとアネキシンV-FITCの蛍光発光を測定します。 10,000事象ごとのフローサイトメーター上で獲得した細胞を収集します。

担癌マウスのin vivo抗腫瘍効果4.

  1. 肺癌誘発性マウスモデル
    1. 0.1ミリリットルRPMI-1640培地に1×10 6 A549細胞を準備し;氷の中に保管してください。
    2. キシラジンの腹腔内注射およびチレタミンとゾラゼパム（1の混合物をマウスに麻酔：2、1ミリリットル/kg）。優しくマウスの皮膚の小さな倍をつまんで適切な麻酔を確認してください。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
      注：移動が観察されない場合、動物は、実験を開始するのに十分な麻酔です。
    3. （ - 7週齢、20〜22グラム6）BALB / C雄ヌードマウスの左脇腹に皮下細胞を注入します。
    4. 彼らはケージの周りに移動を開始するまで、マウスを観察してください。
      注：それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。それは完全に回復するまで他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。特定病原体フリー（SPF）の条件下でマウスを保管してください。
    5. 毎日ノギスで腫瘍の大きさを測定します。腫瘍サイズが体積で約200ミリメートル3に達したとき（長さ×幅2）/ 2として腫瘍体積（mm 3で）を計算し 、実験を開始します。
  2. 抗がん効果の研究
    1. 無作為に4群（各群n = 10）にマウスを分けます。
    2. （：2、1ミリリットル/キログラム1）キシラジンの腹腔内注射およびチレタミンとゾラゼパムの混合物をマウスに麻酔。優しくマウスの皮膚の小さな倍をつまんで適切な麻酔を確認してください。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
      注：移動が観察されない場合、動物は、実験を開始するのに十分な麻酔です。
    3. 2 mg / mlでのHBの最終濃度になるようにPBS中にナノ粒子を溶解します。 0日と7日に二回、尾静脈（HBとしての2mg / kg）を介して、PBS、無料のHB、HB-のNP、またはHB-P-のNPを注入します。
    4. 彼らはケージの周りに移動を開始するまで、マウスを観察してください。
      注：それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。完全になるまで他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。回収されました。暗く、特定のSPF条件下でケージを保管してください。
    5. （：2、1ミリリットル/キログラム1）各注射後24時間は、キシラジンおよびチレタミンとゾラゼパムの混合物の腹腔内注射でマウスを麻酔します。優しくマウスの皮膚の小さな倍をつまんで適切な麻酔を確認してください。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
      注：移動が観察されない場合、動物は、実験を開始するのに十分な麻酔です。
    6. （腫瘍に対するPDTファイバからの距離から1cmで）PDT繊維の下に腫瘍部位を配置します。 、レーザー安全メガネを着用してスイッチをオフにして、1日目と8日に二回500秒（200 J / cm 2）をするためのPDTレーザー（630 nmで、400ミリワット/ cm 2）を用いて腫瘍を照らします。
    7. 彼らはケージの周りに移動を開始するまで、マウスを観察してください。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでください。 undergonを持つ動物を返さないでください。他の動物の会社に電子手術は完全に回復するまで。
    8. SPF条件下でケージを保管してください。レーザー治療後24時間暗所でケージを維持します。
    9. 視覚的に毎日の腫瘍体積と腫瘍部位での変化を監視します。ノギスで腫瘍の大きさを測定し、（長さ×幅2）/ 2（ミリメートル3）などの体積を計算します。 PDT後の腫瘍表面変化を確認するために、毎日の腫瘍部位の写真を撮ります。
    10. 16日目には、イソフルランを用いて、端末麻酔によって群当たり5匹のマウスを生け贄に捧げます。
    11. 鉗子やハサミで、外側の皮膚をカットし、腫瘍15を露出させます。慎重にそれらを収穫。 、10％ホルマリンでそれらを修正し、パラフィン中にそれらを埋め込む、組織学的分析16のためにヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）でそれらを染色します。
    12. モニタリングの45日後に、イソフルランを用いて、端末麻酔によって残りのマウスを生け贄に捧げます。

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結果

私たちは、上記の技術とHB-のNPとHB-P-NPの両方を用意しました。 HB-のNPとHB-P-NPの平均直径はそれぞれ220.9±3.2 nmおよび211.9±1.6nmでした。

光照射（0〜16 J / cm 2）を、続いてPBS、空のNP、HB-のNP、及びHB-P-のNPとのインキュベーションの4時間後のA549細胞の細胞生存率は、光がない。 図1に示されています、 HB-P-NPで処置した細胞は、81.28±0.14％の細胞生存率を示したHB-NP処置群は、全く細胞毒性を示しませんでした。これは、ナノ粒子から放出されたパクリタキセルの抗癌効果、に起因する可能性があります。 PDTの下で、細胞生存率は、HB-NP-及びHB-P-NPで処理した細胞の両方における露光時間に応じて減少しました。 HB-P-NPで処理した細胞は、同一の照射条件下でHB-NPの群より増加した光毒性を示しました。と...

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ディスカッション

波長、パワー、照射時間：この研究の中で最も重要なステップは、適切なレーザー条件を選択されています。特定の光増感剤に適した光の適切な波長は、PDTのために必要です。私たちは、出力電力が多くのパイロット研究に基づいて400ミリワット/ cm 2に設定したもう一つの重要な要因であったヒポクレリンBについて適切であった630 nmのレーザーを使用していました。 400 mWの/ cm 2の下の出力電力は、任意の治療効果を示すにはあまりにも弱であったが400mW / cm 2とを超える出力パワーは、照射による自体に細胞または動物の皮膚表面を損傷しました。 インビトロおよびインビボ研究における適切な照射時間は、それぞれ40秒（16 J / cm 2）で500秒（200 J / cm 2）でした。 PDT繊維由来の細胞または動物モデルの腫瘍組織への距離も、この研究における重要な因子でした。でセル全体または腫瘍の表面を覆うように光は1センチ最適な距離であることが見出され...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、助成金なしによってサポートされていました。 SNUBH研究基金から14-2014-017。

著者は、この原稿の彼のプロボノ編集のためにJ.パトリック・バロン、名誉教授、東京大学医科大学と非常勤講師、盆唐ソウル大病院にお世話になっています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
オリゴヒアルロン酸バイオランド株式会社_
DS-Y30(セラミド3B、主にN-オレオイル-フィトスフィンゴシン)斗山バイオテック(株)_
アジピン酸ジヒドラジドシグマアルドリッチA0638
N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N′-エチルカルボジイミドSigma Aldrich39391
4-(クロロメチル)ベンゾイルクロリドSigma Aldrich270784
Tween 80東京化学工業(株)T0546
シリンジフィルターSartorius Stedim Biotech GmbH1776215 mm、RC、PP、0.45 &m
トリエチルアミンSigma AldrichT0886
Mini-GeBAflex tubesGene Bio-Application Ltd.D070-12-100
パクリタキセルタイファ コーポレーション_
RPMI-1640ギブコ ライフ テクノロジーズ11875
ペニシリン–ストレプトマイシンGibco Life Technologies, Inc.15070
ウシ胎児血清Gibco Life Technologies, Inc.
Celite (フィルター剤)Sigma Aldrich6858ステップ 1.4 を参照
16140071

参考文献

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