方法論記事

化学発光法を用いて、生物学的材料に、一酸化窒素経路に亜硝酸塩と硝酸塩、代謝物を測定します

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DOI：

10.3791/54879

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2016年12月25日

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Medicine Branch, NIDDK, NIH

この記事について

サマリー

一酸化窒素 (NO) は、血管の恒常性における重要なシグナル伝達分子です。NO in vivo の産生は、直接測定するには低すぎます。化学発光は、その前駆体と酸化生成物である亜硝酸塩と硝酸塩を測定することにより、NOサイクルに関する有用な洞察を提供します。体組織および体液中の亜硝酸塩/硝酸塩の測定について説明します。

要約

一酸化窒素（NO）は、血管の恒常性とも神経伝達物質の主要な調節因子分子の一つです。酵素的に生成NOは、様々なオキシヘムタンパク質および他のまだあまり知られていない経路との相互作用によって亜硝酸塩と硝酸塩に酸化されます。逆のプロセス、NOへの亜硝酸塩と硝酸塩の減少は10年で、哺乳類で発見されていた、あると考えられている心血管、代謝と筋肉の障害の全範囲を防止または緩和するのいずれかの可能な経路の一つとして注目を集めていますNOレベルの低下に関連すること。血液、体液、および様々な組織 - 異なる身体区画にNO及びその代謝産物の量を推定することが重要です。その簡単なアクセシビリティのために血液は、NO代謝物の推定のために使用される好ましいコンパートメントです。その寿命が短い（数ミリ秒）および低サブナノモル濃度、血液のNOの直接の信頼性の高い測定のために<em>の生体内存在の偉大な技術的困難インチしたがって、NO可用性は、通常、その酸化物、亜硝酸塩と硝酸塩の量に基づいて推定されていません。これら二つの代謝産物は、常に別々に測定されています。生物学的液体および組織におけるそれらの濃度を決定するためのいくつかの十分に確立された方法があります。ここでは、それぞれ、三ヨウ化物またはバナジウム（III）塩化物溶液によって亜硝酸塩や硝酸塩還元後にNOの分光光度検出に基づいて、化学発光法（CL）のためのプロトコルを提示します。亜硝酸塩と硝酸塩の検出感度はNO代謝経路の変化を決定するために現在利用可能な最も感度の高い方法としてCLを設定し、低ナノモル範囲です。私たちは、サンプル中のそれぞれの量を決定するために収集し、どの時点で亜硝酸塩と硝酸塩の存在の元の量を維持するために、生物学的流体および組織からのサンプルを調製する方法を詳細に説明します。 CL技術の限界もEXPありますlained。

概要

亜硝酸塩、およびより少ない硝酸塩を拡張するために、血液中の濃度は、身体の全体的な状態のNO代謝を反映していません。亜硝酸塩の血液中の濃度は、ほとんどの臓器や組織は、高ナノモルまたは低マイクロモルの範囲であるだけで、硝酸塩は、通常、はるかに高い量で存在する - マイクロモルの範囲内で。亜硝酸塩の疾患の進行に起因するレベルまたは食習慣の変化の変化は非常に小さく、非常に感度の高い方法を用いて測定することができます。そのため、それらの非常に異なるレベルと異なる代謝過程で、亜硝酸塩と硝酸塩のレベルの独立した決意が不可欠です。亜硝酸塩と硝酸塩が一緒に測定されている」 の NO x決意」いわゆるませんが、非常に小さな値となっています。

種々の生物学的試料中の亜硝酸塩を定量化するためのいくつかの方法が開発されている - 最も一般的には元々あっても現代modificatioと1879年に記載されたグリース反応に基づいて、最も古いものですNS、グリース」の方法によって達成亜硝酸塩のための感度限界は、低マイクロモルの範囲です。三ヨウ化物還元溶液と組み合わせた化学発光（CL）は、現在、亜硝酸塩濃度1-8,10,11の低いナノモル範囲の定量化を可能にする、最も敏感な方法であると考えられています。溶液を還元バナジウム（III）塩化物と組み合わされ、同じCL法は、ナノモル範囲9の精度と、硝酸塩の敏感な測定のために使用することができます。

CLは、遊離ガスのNOを検出します。従って、亜硝酸塩、硝酸塩、Rニトロソチオール（R-SNO）、R-ニトロソアミン（R-NNO）、または金属-NO化合物（後の原稿の「R-（X）-NO」と称する）に変換されなければなりませんCLを介して元の量を定量化するために、NOガスを解放しません。 NOへの変換は、NO代謝物の性質に応じて、いくつかの異なる還元性溶液を用いて達成されます。変換後、遊離NOガスは、キャリアガス（彼は、Nによって反応容器からパージされていませんオゾン（O 3）（NO 2）その活性化状態で二酸化窒素を形成するために、NOと組み合わされCL分析装置の反応チャンバ内に2またはAr）。基底状態に戻ると、NO 2が *赤外領域で発光し、放出された光子は、CL装置の光電子増倍管（PMT）によって検出されます。放出される光の強度は、適切な較正曲線を使用して、元の種の濃度の計算を可能にする反応チャンバ内のNO濃度に正比例します。

我々のプロトコルでは、我々最も使用される臨床現場における亜硝酸塩と硝酸塩の最初の存在CLベースの決意 - 血液および血漿中、およびその後、我々は、組織試料中のこれらのイオンを決定する方法について説明します。我々はまた、血液やそのコンパートメント、血漿および赤血球などの亜硝酸塩反応性環境でオリジナルの生理的亜硝酸塩濃度を維持する方法を詳細に説明します。

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プロトコル

動物の使用を含むすべてのプロトコルは、NIDDK動物実験委員会によって使用が承認され、ヒトの血液は、健康なドナーからNIHの血液バンクから入手しました。

1.試料の調製

  1. 亜硝酸塩保存溶液の調製
    1. 蒸留水に890 mMのフェリシアン化カリウムを含む溶液を準備する（K 3のFe（CN）6）および118 mMのNEM（N-エチルマレイミド）。それが存在していない結晶と黄色透明になるまでよく溶かします。 9比（V / V、NP-40 /ソリューション）：1にNP-40（オクチルphenoxylpolyethoxylethanol）を追加します。 ）約一週間のために4℃で発泡や店舗を避けるために、穏やかに混合。
  2. 収集および血液サンプルの調製
    1. 凝固（5 U / ml）を防止するためにヘパリンと溶血を回避するために、少なくとも20 G針を用いて血液を収集します。 4の比率（V：全血サンプルについては、亜硝酸塩は1ですぐに解決策を維持して血液を混ぜます/ v溶液/血液）。
    2. 血漿および赤血球サンプルについて、遠心分離を4℃で4,000×gで5分間採取した血液は、赤血球（RBC）および血漿を分離しました。上清（血漿）を取り、血漿中亜硝酸塩濃度の決意について上述したように亜硝酸溶液を保存して、それを混ぜます。
    3. 注意深く切断ピペットチップを使用して、血液細胞の他の種類による汚染を避けるために、管の底部からサンプルピペットRBC試料からの残りの血漿およびバフィーコートを除去し、そして同じで亜硝酸塩保存液を含むチューブにそれを転送します上記のような割合。
    4. 1または1：1の比率で冷メタノールで各サンプル（血漿およびRBC）を混ぜる2（V / Vのサンプル/メタノール）およびタンパク質を沈殿させ、15分間4℃で13,000×gで、それらを遠心。 -80℃のドライアイスや店舗に、必要に応じて、上清を取り、亜硝酸塩の測定のためにそれを使用するか、または調製したサンプルを凍結します。
      注：亜硝酸急速にREA血液形成硝酸中のオキシヘモグロビン（オキシヘモグロビン）とCTS。オキシヘモグロビンは常に亜硝酸塩を超える大過剰に存在するので、この反応は〜10分の時間枠でネイティブの血液亜硝酸塩がほぼ完全に消滅につながります。内因性の血液亜硝酸塩の大部分を維持するために、亜硝酸塩保存溶液は直ちに採血後の全血試料に添加されます。溶液は急速に、化学的に亜硝酸塩と反応しないヘモグロビンの不活性型の赤血球を溶解し、メトヘモグロビン（メト）にオキシヘモグロビンを酸化します。
  3. 他のタイプの体液からの試料の調製
    1. 適切な容器への試料採取後、亜硝酸塩保存液、deproteinateでよく混ぜ、すぐに測定するか、-80℃で凍結保存します。
  4. 収集及び組織サンプルの調製
    1. ヘパリン添加生理食塩水で灌流した動物から組織を収集（10 UのHEPARIN / mlで）。所望の組織の物品税約1グラムと均質化、手動ホモジナイザーや自動化されたホモジナイザーを使用して。
    2. 滑らかなホモジネートを達成するのに必要な亜硝酸塩保存溶液の既知量を加えます。
    3. 上記のように4℃で13,000×gで遠心分離、その後サンプルは15分間、（2比（v / v）のサンプル/メタノール：1または1）組織を均質化した後、冷メタノールを使用してタンパク質を沈殿させます。
    4. 上清を収集し、亜硝酸塩レベルを測定します。必要に応じて、-80℃でドライアイスとストアの調製の任意の段階でサンプルを凍結します。

ソリューションを減らすの調製

  1. 三ヨウ化物（I 3）亜硝酸塩とR-（X）-NO種の決意1,3,4のためのソリューションを削減します
    1. 水中の138 mMのI 2溶液と一緒に301 mMのKIの溶液を調製します。すべてまで、約30分間マグネチックスターラー上7の比（V / v溶液/酸）：2に氷酢酸と混合結晶を溶解させます。好ましくはヨウ化物は、光に敏感であるように、暗いボトルに保管し、準備から1週間以内に使用します。
      注：このソリューションは、NOに亜硝酸塩を削減し、それはまた、R-SNO、R-NNOとFe-NO官能基（R-（X）-NO）からNOを放出しますが、硝酸塩は影響を受けません。上記でNO系官能基からの信号は、酸性化スルファニルアミド（AS）と試料の半分を処理することにより真の亜硝酸塩信号から分離し、AS処理および未処理の信号を比較することができます。 AS不可逆的に亜硝酸とジアゾニウム陽イオンを形成し、この複合体はI 3溶液によって低減することができません。治療としては、1 M HClにスルファニルアミドの290 mM溶液を準備し、比1に試料のアリコートに追加：9（V / V AS /サンプル）。サンプルのAS-処理および未処理の部分でCL信号を測定します。サンプルのAS-処理および未処理部分の差として真の亜硝酸塩信号を計算します。亜硝酸塩はまた、選択NITを用いて測定することができます儀式低減部分2.2で説明したように、アスコルビン/酢酸混合物の溶液を。しかし、現在の通常小さいR-量（X）-NO種に、AS-未処理試料を用いた測定は、ほとんどの場合、総亜硝酸塩の含有量の非常に良好な近似です。
  2. 亜硝酸塩2の選択的決意のためのアスコルビン酸/酢酸（4A）ソリューション
    1. 水の中の500mMアスコルビン酸を準備します。反応混合物を調製するための7（V / V、アスコルビン酸/酢酸）：比1氷酢酸を用いてこの溶液を混合します。
      注：このソリューションは、亜硝酸塩に特異的である、任意のR-（X）-NO種または硝酸塩からNOを放出しません。アスコルビン酸は容易に溶液中で酸化するようしかし、アスコルビン及び酢酸の溶液は、毎日測定の前に新たに調製しなければなりません。
      亜硝酸還元の完了は、アスコルビン酸の濃度に依存します。少なくとも50 mMのアスコルビン酸は完全なrのために推奨されていますプラズマ亜硝酸塩の排気行程。しかし、前に最終的なサンプル測定に予想される亜硝酸塩濃度範囲内アスコルビン酸及び亜硝酸規格の異なる濃度のいくつかのパイロット実験を行うことをお勧めします。アスコルビン酸はわずかガラス製反応容器内の反応混合物のように頻繁な変更が推奨され、測定中に枯渇することに注意してください。
  3. 硝酸決意9用の塩化バナジウム還元溶液
    1. 1 M HCl中のVCl 3の51 mM溶液を準備します。暗いボトルで200μmのフィルターとストアを介してフィルタソリューションは、2週間以内に使用します。
      このソリューションは、硝酸塩、亜硝酸塩、すべてのR-（X）-NO種を削減する、亜硝酸塩または他のR-（X）-NO種の匹敵する量が一緒に硝酸で存在しているので、もし、最後の硝酸塩含量を計算しなければならない注： VCl 3とIで得られたCL信号の差として3ソリューションを減少させます。

3.化学発光（CL）アナライザのセットアップと測定

  1. 標準溶液
    1. 亜硝酸ナトリウム（NaNO 2を）の1μM溶液を調製します。同じ溶液は、亜硝酸塩と硝酸塩の測定のために使用することができます。
  2. NOアナライザを使用していません
    注： - SieversのNOAとEcophysics CLD 88Y現在の生物学的研究目的のために十分な感度である2つの市販されているNOアナライザはありません。これらは両方とも同じ原理で動作します。主な違いは、CLD 88Y、オゾンを作るために室内空気からの酸素を使用することである（O 3）、NOAは、この目的のために外部の酸素タンクを必要とします。手順は以下のSievers NOAのためのセットを記述します。
    1. 機器の設定
      1. 製造業者の推奨に従ってNO分析装置の初期セットアップを実行します図1に見られるように。
      2. 機器に接続されたオープン・O 2のタンク。 「分析」を選択し、前面パネルのメインメニューから「入力します」。次の画面で選択し、「開始」を押し「入力してください。」 図1に見られるような機器に（1 M NaOHを含む）は、酸トラップを接続します。
      3. 光電子増倍管は、-12℃以下の温度まで冷却し、反応室は6 Torrまで排気されるまで待ちます。これは、安定した平らなベースラインに達するのに約30分かかります。ベースラインが1以内に安定化する必要がある - 2 mVの、公称値は、その安定性よりも重要です。
        注：硝酸塩が測定された場合、冷却（酸と水と蒸気用としてコールドトラップを提供しています4°Cに設定）水浴及び加熱水浴（主反応室、95°C）をオンにします。 VCl 3溶液中のNOへの硝酸塩の減少率は、温度依存性であり、そしてそれは部屋テンペで非常に遅いですratureは、温度のように実質的な増加は、反応を観察するために必要とされます。
      4. 彼タンクを開き、 図1に見られるような酸トラップするガラス反応容器を接続します。適切な還元溶液との反応チャンバを満たす最小の泡立ちを減少させ、酸トラップへの反応チャンバを接続します。試行錯誤を使用して、機器の吸引速度（SieverのNOAのための通常〜200ミリリットル/分）を一致させるために彼バブリング速度を調整します。
      5. 楽器を制御するコンピュータの電源を入れおよびLabVIEWベースのリキッドソフトを起動します。機器および取得ソフトウェア、プレスの間の通信を有効にするには、画面を読み取るまで「データメニュー」の「出力が有効になって」と、その後、「クリア」を押し、データ画面に戻って戻るために「決定」。
      6. 画面上の安定したベースライントレースを待ってセプタムを通してソリューションを減らすにサンプルおよび亜硝酸標準を注入開始。常に安定したベースライン後方に到達するのを待ちますピークえー。これは2分かかることがあります。液体ソフトウェアは、注射のオプションに "マーク"時間があり、注射に注釈を付け、それがデータファイル（filename.data）に役立つ補完するものとして、別のファイル（filename.info）にこれらのコメントをエクスポートします。
      7. これは「filename.data」として知られている永続的なファイルに一時ファイルからデータを書き込みます - サンプルおよび標準が測定されると、液体のソフトウェアメニューのオプションを「停止」を選択します。押すと「中止」オプションは、永続的なファイルに取得したデータを書き込むことなく測定を終了します。
      8. 、実験を終了し、反応容器の上部にコックをオフにすることによって、反応容器からマシンを切断し、酸トラップと反応容器間のチューブを切断する（ 図1を参照）。今NOAアナライザを停止 - を押して「クリア」、「分析」に行き、「スタンバイ」と「確認」スタンバイ状態にマシンを置きます。定期的に使用した場合、器具は、数週間待機モードのままにすることができます。酸素の供給をオフにします。次いで、反応室、切断の還元溶液を洗い流し、ガラス反応容器からヘリウムタンクを閉じて反応容器を洗浄終了。
    2. 標準およびサンプル注入
      1. よく洗浄したハミルトンシリンジを用いて反応混合物に1μM硝酸溶液50μlを注入します。ピークの良好な分離を達成するために注射間2分 - 少なくとも1のを待ちます。各データポイントに重複を取得するために50μlの注入を繰り返します。各注入後に脱イオン水で注射器を洗浄します。
      2. 標準曲線のためのデータの完全なセットを取得するには、100の重複注射、1μM亜硝酸溶液を150μlの（亜硝酸塩や硝酸塩の高濃度が予想される場合、追加の200μlを必要とするかもしれません）に進みます。それぞれのケースでは、信号がベースラインに戻って低下するまで待つように世話をしてから1獲得 - 2マイルをピークの良好な分離を達成するために、ベースラインのn個。
        注：亜硝酸塩標準実験中の任意の時点で測定することができます。また、機器の機能の独立したチェックとして機能するようにしかし、データ測定の前に、標準曲線を取得することが好ましいです。
        データが収集される場合、試料の量が十分に顕著なピークをもたらすはずで注入しました。しかし、光電子増倍管が唯一〜800 mVの最大線形であるため、ピークのいずれも〜700 mVでより高くてはならないことを心に留めておくべきです。これは、量注入されたサンプルの減少又は脱イオン水で試料を希釈することによってのいずれかで達成することができます。各点は、二重に、少なくとも測定されるべきです。

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結果

図2は、基準および5の異なるサンプルから収集代表的な結果を示しています。この図に示すように、光電子増倍管電圧が上昇するが、亜硝酸塩含有溶液（標準またはサンプル）を溶液に還元中に注入された直後にベースライン値に戻る注入で一度全て亜硝酸存在（注射時間は赤い曲線の下の矢印で示されています）溶液を還元しました。また、正確な量の測定は、再現性の高いデータを得るために必要である。この図から明らかです。私たちは、注入量を測定するために、精密ハミルトンシリンジを使用することをお勧めします。 I 3（またはアスコルビン酸またはのVCl 3）溶液の容量を減少させるの損失が誤差の別の一般的な供給源です。ピークのベースラインの幅がかなり広く開始時原則として、反応チャンバ内の溶液を減らすこと変更されなければなりません。ピークの幅は、NOへのガスの流れに依存します反応室（ 図1上のRCとしてマーク）、それは少し別の設定1つの実験ごとに異なります。私たちは、通常の幅は亜硝酸測定用および硝酸...

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ディスカッション

プロトコル内の重要なステップ

オリジナルサンプルを調製希釈又は他の方法で治療するために使用される（水を含む）全ての溶液のアリコートを保存する必要があり、可能な亜硝酸または（より頻繁に）硝酸塩汚染を確認しました。私たちは、最も汚染が水から来て、多くの化学物質はまた、内因性の硝酸決意を妨害するいくつかのロットでの硝酸塩汚染のかなりの量が含まれているサンプル（特にフェリシアン）を治療するために使用されることがわかりました。我々は、通常の実験でそれらを使用する前に、したがって、我々は、亜硝酸塩と硝酸塩汚染物質のために私たちの化学物質のすべてをチェックしてください。

サンプルは、治療中にかなりの希釈液に数回受ける可能性がありますので、すべてのサンプルの操作は、最終濃度の計算のために文書化する必要があります。ほとんどのミスは、プロトコルのこの部分で作られています。

亜硝酸塩の測定、への迅速な転送のためのサンプルを取り扱う場合ソリューションを保存亜硝酸塩は、亜硝酸塩と反応して硝酸にそれを酸化ヘ...

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開示事項

博士アランシェクターは、心血管疾患の治療のための亜硝酸塩の使用のために国立衛生研究所に発行されたいくつかの特許上の共同発明者として記載されています。彼は、NIHの臨床開発のためにこれらの特許のライセンスが、ありませんその他の報酬に基づくロイヤルティを受け取ります。

謝辞

著者らは、血液中の亜硝酸塩の測定のための亜硝酸塩保存液の使用の開発に博士A. DejamとMMペルティエの重要な貢献を承諾します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
フェリシアン化カリウム;K3Fe(CN)6Sigma702587
NEM;N-エチルマレイミドSigma4260
NP-40; 4-ノニルフェニル-ポリエチレングリコールSigma74385
スルファニルアミド;として SigmaS9251
HClSigmaH1758
酢酸、氷河SigmaA9967
アスコルビン酸 シグマA7506
ヨウ化カリウム;KISigma60399
ヨウ素;I2Sigma207772光感受性、有毒
な亜硝酸ナトリウム;NaNO2Sigma563218
塩化バナジウム(III);VCl3Sigma208272ligt sensitive, toxic
GentleMacMiltenyi
Sievers NOA 280iGE
CLD 88Y エコフィジックス 

参考文献

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