サル免疫不全ウイルス特異的CD8の分析 +ペプチドMHC-I四量体染色によりアカゲザルにおけるT細胞

サマリー

ここでは、エイズウイルスに対するアカゲザルCD8 ⁺ T細胞を列挙し、特徴づけるための最適化されたプロトコルを提示します。この記事では、HIV免疫学の分野にだけでなく、CD8 ⁺ T細胞応答が疾患の転帰に影響を与えることが知られている生物医学研究の他の分野のみならず便利です。

要約

ペプチド-主要組織適合性複合体クラスI（のpMHC-I）四量体は、CD8 ⁺ T細胞応答を研究するための貴重なツールとなっています。これらの試薬は、直接CD8 ⁺ Tリンパ球の表面上のT細胞受容体に結合するので、蛍光色素標識のpMHC-I四量体は、抗原（Ag）からの正確な検出を可能にする特異的CD8 ⁺ T細胞のin vitro再を必要とせず-刺激。マルチカラーフローサイトメトリーと組み合わせた場合にさらに、のpMHC-I四量体染色は、分化段階、メモリー表現型および活性化状態を含む、Ag特異的CD8 ⁺ T細胞の重要な側面を明らかにすることができます。分析のこれらのタイプは、CD8 ⁺ T細胞は、AIDSへの進行に影響を与える可能性がHIV免疫学の分野において特に有用です。サル免疫不全ウイルス（SIV）とアカゲザルの実験的感染は、エイズウイルスに対する細胞性免疫を研究するための貴重なツールを提供します。その結果、かなりのprogreSSは、この動物モデルにおいてT細胞応答を定義し、特徴付けるてなされたものです。ここでは、のpMHC-I四量体染色によりアカゲザルでSIV特異的CD8 + T細胞を列挙するための最適化されたプロトコルを提示します。私たちのアッセイは、ワクチン接種またはSIV感染によって生成されたSIV特異的CD8 ⁺ T細胞応答を追跡するのに有用である可能性がありますテストごとに2つのpMHC-I四量体+ CD8 ⁺ T細胞集団の同時定量およびメモリ表現型解析が可能になります。生物医学研究における非ヒト霊長類の妥当性を考慮すると、この方法は、複数の疾患の設定におけるCD8 ⁺ T細胞応答を研究するために適用可能です。

概要

それらは、腫瘍免疫監視に関与し、細胞内病原体¹の撲滅に寄与するようにCD8 ⁺ T細胞は、適応免疫系の重要な成分を含みます。簡単に言えば、CD8 ⁺ T細胞は、特異的に、宿主細胞の原形質膜上に存在するI（のpMHC-I）分子をペプチド-主要組織適合性複合体クラスを認識するT細胞受容体（TCR）を発現します。これらのペプチドは、内因的に合成されたタンパク質のタンパク質分解に由来するので、細胞表面のpMHC-I複合体は、細胞内環境にウィンドウを提供します。ウイルス感染時に、例えば、感染した細胞は、CD8 ⁺ T細胞をパトロールによって発現のTCRに対するリガンドとして機能することができるウイルス由来のペプチドを含むMHC-I分子を表示します。ウイルス特異的CD8 ⁺ T細胞は、そののpMHC-Iリガンドを提示する感染細胞を検出した場合には、TCRの関与は、CD8 ⁺ T細胞の活性化とultiをもたらしますmately細胞溶解をターゲットにつながります。 CD8 ⁺ T細胞応答の大きさ、特異性、および表現型を決定し、これらのTCR /のpMHC-Iの相互作用の重要性を考えると、多くの場合、ヒトの疾患についての重要な手がかりを明らかにすることができます。

1990年代初頭までは、Ag特異的CD8 ⁺ T細胞の定量化は、技術的に厳しい限界希釈アッセイ^（LDA）2,3に依存していました。だけでなく、LDAが完了するまでに数日必要でしたが、それはまた、増殖能力を欠いていた細胞を検出することができませんでした。その結果、LDAは非常に免疫反応に関与する抗原銀（Ag）特異的CD8 ⁺ T細胞を実際の頻度を過小評価しました。 ELISPOTおよび細胞内サイトカイン染色アッセイの開発は非常に細胞性免疫を測定する能力を改善したが、これらの方法は依然としてAg特異的T細胞^4を定量するためのインビトロ刺激を必要としました。それは1996年アルトマン、デイビス、および高専までではなかったですeaguesはのpMHC-I四量体技術⁵の開発を報告し、その画期的な記事を掲載しました。この技術の成功に重要なことにより、フローサイトメトリーアッセイの洗浄ステップ中に脱落のpMHC-I四量体の可能性を低減する、TCR /のpMHC-Iとの相互作用の半減期延長のpMHC-I分子の多量体でした。上記アッセイ上のpMHC-I四量体の主な利点は、正確に、インビトロ再刺激を必要とすることなく、直接ex vivoでのAg特異的CD8 ⁺ T細胞を検出する能力です。また、マルチカラーフローサイトメトリーでのpMHC-I四量体染色の組み合わせは、分化段階、メモリー表現型、およびAg特異的CD8 ⁺ T細胞^2-4の活性化状態の詳細な分析を可能にしました。 ^6染色多量のpMHC-IによりCD8 ⁺ T細胞レパートリーを特徴付けるための最近の技術の進歩を考慮して、アプリケーションの幅FORこの方法論は引き続き拡大する可能性があります。

生物医学研究におけるいくつかの領域は、HIV免疫学⁷のフィールドよりのpMHC-I四量体染色からより多くの恩恵を受けています。 CD8 ⁺ T細胞は、時間的アルトマン、デイビス、と同僚^8,9によって公開時点によってHIVウイルス血症の初期制御に関連付けられていたが、その後の年のpMHC-I四量体の使用が大幅に我々の理解を拡大しましたHIV特異的CD8 ⁺ T細胞応答。例えば、のpMHC-I四量体染色は、ほとんどのHIV感染者^10月12日におけるウイルス特異的CD8 ⁺ T細胞応答の強固な大きさを確認助けました。この方法はまた、HIVおよび抗レトロウイルス療法、「エリート制御」として知られる現象の非存在下でのウイルス複製の自発的なコントロールに関連付けられたMHC-I分子によって制限SIV特異的CD8 ⁺ T細胞応答の特徴付けを容易に ^{13-15。また、のpMHC-I四量体は、制御されていない慢性感染におけるHIV特異的CD8 + T細胞の機能不全の表現型に可逆経路としてプログラム死1（PD-1）/ PDリガンド1（PD-L1）軸の確立に尽力しました16,17。まとめると、これらの研究は、AIDSウイルスに対してCD8 + T細胞応答をモニターするためのpMHC-I四量体の有用性を強調する。}

アカゲザル（ アカゲザル ）の実験SIV感染は、HIV / AIDS ^18,19に対する免疫介入を評価するための最良の動物モデルのまま。過去25年間で、実質的な進歩がMHC-I対立遺伝子の発見およびペプチド結合モチーフ^13,20-27の定義を含め、このサル種におけるSIV特異的CD8 ⁺ T細胞の同定および特徴付けになされたもので。その結果、のpMHC-I四量体は、SIV特異的CD8 ⁺ T細胞の分析のために開発されていますこの動物モデル²⁸における応答。 MAMU-A1はMAMU-A1は*、001 * 002：：、01 MAMU-B * 008：これらの試薬のほとんどは、4アカゲザルMHC-I対立遺伝子の遺伝子産物で作られている01、およびMAMU-B * 017：01。注目すべきは、アカゲザルは、MHC-C遺伝子座^29を発現^しません 。本実験で使用したのpMHC-I四量体の大部分はエモリー大学のNIH四量体コア施設で生産されました。それにもかかわらず、免疫優性のGag CM9エピトープに結合MAMU-A1 * 001四量体を含む、これらの試薬のいくつかは、唯一のライセンス契約のために商業的供給源から得ることができます。上記の4つのアカゲザルの対立遺伝子のpMHC-I四量体を使用して、我々は、ワクチン接種またはプライマリSIV感染^30,31によって誘導された21 SIVエピトープ（ 表1）の合計に対して、CD8 ⁺ T細胞を正常に列挙している（マーチンらら 、未発表の観察）。

現在の原稿が提供しますアカゲザルにおけるSIV特異的CD8 ⁺ T細胞の頻度および記憶表現型を決定するためのpMHC-I四量体染色プロトコルを最適化しました。 TCRの内在化を減少させ、それによってのpMHC-I四量体染色^32を改善するために、アッセイは、タンパク質キナーゼ阻害剤（ここでは、ダサチニブが使用されるPKI）で待機30分のインキュベーションで始まります。 01四量体：後述するようにMAMU-B * 017を使用している場合、この治療は、特に有用です。蛍光標識のpMHC-I四量体およびモノクローナル抗体（mAb）で細胞を標識する方法の説明も提供されます。このプロトコルはまた、細胞溶解関連分子のグランザイムB（GZM B）の細胞内検出のための細胞透過のステップを含みます。 CD3に対するmAbは、このTCRシグナル伝達分子の検出を向上させるだけでなく、この工程で添加されます。参考として、この染色パネルに用いられる全ての蛍光色素が記載されています。

プロトコル

この原稿で利用末梢血単核細胞（PBMC）のサンプルは、ウィスコンシン国立霊長類研究センターに収容インドのアカゲザルから得ました。これらの動物は、ウィスコンシン大学院動物実験委員会³³の大学によって承認されたプロトコルの下ウェザーレポートに従って世話しました。すべての動物の手順は、麻酔下で実施し、すべての努力は、潜在的な苦痛を最小限にするために行われました。

1. PKI治療

注：これはオプションですが、MAMU-B * 017に推奨：01四量体。 結果と考察セクションを参照してください。

1. 1.6×10 ⁷細胞/ mlの濃度で、R10培地中で再懸濁PBMC。
2. サイトメトリーチューブ対応するフローにこの細胞懸濁液の50μlのを追加します。各チューブにPKIの100 nMの溶液50μlを追加します。
3. 各チューブをボルテックス。 37℃で30分間インキュベートします。このの終わりまでにステップは、各チューブは、8.0×10 ⁵ PBMCおよびPKIの50 nMのを含む100μlの細胞懸濁液を持っている必要があります。
4. pMHC-I四量体染色工程に進みます。

蛍光色素で標識されたのpMHC-I四量体2.染色

1. pMHC-Iテトラマーマスターミックスを準備する前に、4℃で少なくとも15分間、20,000×gで遠心分離器のpMHC-I四量体チューブを。このステップの目的は、バックグラウンド染色を増加させることができるのpMHC-I四量体溶液中のタンパク質凝集体をペレット化することです。遠心分離工程が行われると、タンパク質凝集体が蓄積してきたであろう、チューブの底からピペッティングを避けます。
2. すべての実験のチューブを染色するのに十分なのpMHC-I四量体のマスターミックスを調製します。エラーをピペッティングするためのアカウントにこのマスターミックスの総体積の15％の過剰を準備します。
3. 染色バッファー（ 例えば 、ブリリアントステインバッファー）中の希釈のpMHC-I四量体のpMHC-Iテトラマーマスターミックス25μlをADDEになるように、各テストにD。
   1. テストごとに2つのpMHC-I四量体でラベルPBMC。ブリリアントバイオレット（BV）421にアロフィコシアニン（APC）およびその他に結合1。
4. 100μlの最終体積でチューブサイトメトリー対応するフローに8.0×10 ⁵ PBMCを追加します。細胞は上述のPKI処理を行った場合は、既にこの段階で、100μl中に再懸濁されるべきです。
5. サイトメトリーチューブ対応するフローへのpMHC-Iテトラマーマスターミックス25μlのを追加します。このステップの終わりまでに、各チューブ内の最終容量は125μlであるべきです。
6. 細胞懸濁液を均質化するために各チューブをボルテックス。
7. 45分間室温で暗所でインキュベートします。この45分間のインキュベーションの間に表面染色mAbのカクテルを準備します。

3.表面染色

1. すべての実験のチューブを染色するのに十分なmAbのマスターミックスを調製します。アカウントにこのマスターミックスの総体積の15％超過を準備ピペット操作エラーの。
2. 50μlのは、テストごとに追加されるように、染色バッファーでマスターミックスの音量を調節します。
3. 適切な非CD8 ⁺ T細胞の排除およびメモリサブセットの描写のために、使用は、表面染色マスターミックスの次の分子に対して向けられたモノクローナル抗体の量を滴定しました。
   注：CD14 BV 510、CD16 BV 510、CD20 BV 510、CD8αBV 785、CD28 PE Cy7の、およびCCR7 FITC：各モノクローナル抗体に結合させた蛍光色素は、参考資料としてご提供するものです。 CD14、CD16、およびCD20に対するmAbは、それらが「ダンプ」ゲートに含まれることになるので、同じ蛍光色素（ すなわち、BV 510）に結合されていることに注意してください。
4. [ すなわち、アミン反応性染料（ARD）]表面染色マスターミックスに死細胞を識別するための固定可能な染料を含めます。 ARD試薬は、「ダンプ」ゲートに使用されるものと同様の発光スペクトルと蛍光色素に結合していることを確認します。この場合、ARDアクアを使用します。
5. 50μlのを追加します。染色マスターミックスチューブサイトメトリー対応するフローを3.1〜3.4にします。このステップの終わりまでに、各チューブ内の最終容量は175μlであるべきです。
6. 各チューブをボルテックス。 25分間室温で暗所でインキュベートします。
7. 洗浄緩衝液（PBSウシ血清アルブミン、0.1％を含有する溶液0.45グラム/ LのNaN _3）で細胞を洗浄します。
   注意：アジ化ナトリウムは有毒物質です。でも、微量への暴露は、症状を引き起こす可能性があります。これらの実験は行われている教育機関での環境・健康・安全（EHS）オフィスで指定されたガイドラインに従って、この物質を取り扱います。
8. 5分間、510×gで遠心分離管。慎重に個別の廃棄物容器に上清をデカントします。ペレットを乱さないようにしてください。
   注意：それは洗浄緩衝液中でアジ化ナトリウムの存在と反応し、有毒ガス³⁴の形成をもたらすことができるように漂白剤を含むリザーバーに洗浄緩衝液上清をデカントしないでください。 C言語これらの実験は、アジ化ナトリウムを処分する方法のガイドラインのために行われている教育機関でEHSオフィスをontact。
9. デカントした後、各チューブ内に保持残った液体中の細胞をボルテックス。

4.細胞固定

1. 細胞を固定するために、すべてのチューブに2％パラホルムアルデヒド（PFA）の溶液250μLを加えます。
   注意：PFAは有毒物質です。でも、微量への暴露は、症状を引き起こす可能性があります。これらの実験は行われている教育機関でEHSオフィスで指定されたガイドラインに従って、この物質を取り扱います。
   1. 2％PFA液を細胞に等張性でなければならないので、この溶液を調製し、PBSを使用しています。 2％PFA溶液を100ミリリットルの複数の実験のために十分です。十分にすぐに細胞凝集体の形成を防止するために、2％PFAを添加した後、全てのチューブをボルテックス。
2. 20分間4℃で暗所でインキュベートします。
3. Wステップ3.7から3.9を繰り返して灰細胞。このステップが完了すると、細胞は24〜48時間、4℃で暗所に保存することができます。透過処理の段階に進む前に、徹底的にチューブをボルテックス。

細胞の5.透過処理

1. 透過化緩衝液500μlを追加します。ボルテックスすべてのチューブ。
2. 10分間室温で暗所でインキュベートします。
3. ステップ3.7から3.9を繰り返して細胞を洗浄。

6.細胞内染色

1. すべての実験のチューブを染色するのに十分なmAbのマスターミックスを調製します。
2. 細胞内のmAbマスターミックス50μlのは、テストごとに追加されるように、PBSまたは染色バッファーで音量を調整します。
3. CD3およびGZM B.に対して向けられたmAbの滴定量を用いて6.1および6.2に記載されたmAbのマスターミックスを調製します
   注：のpMHC-I四量体によってTCR結合は、四量体+ CD3 ⁺ CD8の検出を妨害することができますCD3内在^、+になることができますT細胞を、抗CD3 mAbで表面染色マスターミックスに追加された場合。細胞を透過性にした後、これを回避するために、この段階では、抗CD3モノクローナル抗体を加える、つまり、。 CD3 PerCPをCy5.5標識とGZM B PE：各mAbに結合させた蛍光色素は、参考として記載されています。
4. 対応するチューブにモノクローナル抗体カクテルの50μlのを追加します。 30分間室温で暗所でインキュベートします。
5. ステップ3.7から3.9を繰り返して細胞を洗浄。チューブは、フローサイトメーターで取得する準備ができています。

結果

ここで説明するプロトコルは、MAMU-A1 * 001 +アカゲザルにおけるワクチン誘導性のGag CM9特異的CD8 ⁺ T細胞応答の大きさ及びメモリ表現型を決定するために使用されています。この分析のために、APC結合MAMU-A1 * 001 /ギャグCM9四量体は、8色フローサイトメトリー染色のパネルに使用しました。 図1Aは、 - Fは、各テスト中に存在する両方の四量体に適用されるべきデータを分析するために使用されるゲーティング戦略を示しています。 pMHC-I四量体+ CD8 ⁺ T細胞集団がよく、最小限の背景（ 図1FおよびG）で分離されていることに注意してください。 ;、過渡的なメモリ（T _EM1; CD28 + CCR7-）、およびエフェクター中央メモリ（CD28 + CCR7 + T _CM）：アカゲザルにおけるメモリ...

ディスカッション

この手順のメリットの議論におけるいくつかのステップは、彼らが最適な結果をもたらすために重要であるとして。生物試料の品質が任意のフローサイトメトリーアッセイ³⁸の成功の強力な予測因子であるので、まず、すべてのケアは、細胞が染色手順の間に実行可能な及び懸濁液中であることを保証するために注意しなければなりません。凍結保存したサンプルで作業するとき、彼らは凝集しやすいであり、典型的に死んだ細胞のより高い数字を含むので、これは特に関連します。これらのケースでは、前のpMHC-I四量体標識操作に70μmのセルストレーナーを介して細胞懸濁液を渡すと、実質的な結果を改善する可能性があります。第二に、アッセイで使用される蛍光色素の適切な補償は、複数のパラメータが同じ実験で評価されている場合は特に、正確なデータ分析のために重要です。この点で、新鮮な単一色補正コントロールは、すべてののpMHC-I四量体のために準備することをお勧めしますアッセイをtaining。私たちは、その広い抗Ig反応性と、彼らは正と負の集団の明確な二峰性の分布を得ているという事実の補償ビーズの使用を好みます。これらのビーズは、MHC-I分子に結合しないので、抗体は...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダサチニブ	Axon medchem	Axon 1392	DMSOに再懸濁し、すぐに-20°Cで保管する必要があります。C
RPMI w / Glutamax	gibco / Life Technologies	61870-036	4°Cで保管する必要があります。C
熱不活性化FBS	gibco / Life Technologies	10082-147	4°Cで保管する必要があります。C
ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB	ロンザ	17-745E	4°Cで保存する必要があります。C
DMSO、無水	ライフテクノロジー	ズD12345	で保存してください。
5 ml丸底ポリプロピレンチューブ	VWR	60819-728
色素共役pMHC-IテトラマーNIH	テトラマーコアまたはMBL、Inc.		使用前に、4°Cで20,000 x gで15分間遠心分離機に保管および維持する必要があります。凍結しないでください。
蛍光色素標識mAbs	さまざまな企業が		nbsp; 4°Cで保管および保守する必要があります。凍結しないでください。
生きる/死ぬ フィックス可能なアクア 死んだ Cell Stain Kit	Life Technologies	l34957	20°Cで保存する必要があります。使用前のDMSOのl。
Brilliant Stain Buffer	BD Biosciences	563794	nbsp; 4 °Cで保管する必要があります。C
リン酸塩緩衝生理食塩水	VWR	97064-158	で保存
アルブミン牛	VWR	700011-230	4 > で保存する必要があります。C
アジ化ナトリウム	VWR	97064-646	室温で保管してください。有毒物質。漂白剤と混ぜないでください。
漂白剤	VWR	89501-620	腐食性化学物質、アジ化ナトリウムと混合することはできません。パラ
ホルムアルデヒド	電子顕微鏡科学	15714-S	、腐食性、毒性のある試薬の取り扱いに注意してください。取り扱いには注意が必要
ポリソルベート 20 (Tween-20)	Alfa Aesar	L15029	室温で保存
透過化溶液 2	BDバイオサイエンス	340973	毒性および腐食性試薬。お手入れのハンドル
Sarsdet チューブ 1.5 ml スクリュートップ	VWR	72.692.005
2.0 ml DNA/RNA 低結合チューブ	エッペンドルフ	22431048	滅菌マイクロチューブの使用が推奨されます
ボルテックスミキサー			の裁量に
バイオセーフティキャビネット			の裁量に
ミリQインターグラル水浄化システム	EMDミリポア	ZRXQ010WW	分子生物学グレードの水 任意のプロバイダーから
遠心分離	科学者
遠心分離	科学者
4 °;C 冷蔵庫			の裁量により
BD LSR II	BD Biosciences		フローサイトメーターには、使用する染色パネルと互換性のあるレーザーとフィルターが含まれている必要があります。
脱イオン水
アルミホイル	VWR SCIENTIFIC INC.	89068-738
インキュベーター			37°Cを維持できなければなりません。C 内部温度
FACS Diva ソフトウェア	BD Biosciences
Flowjo ソフトウェアバージョン 9.6	Flowjo		FACS Diva ソフトウェアによって生成された FCS ファイルの分析に使用
Micropippette tips