大コイルドコイル含有タンパク質の結晶化を導くためにウェットとドライラボテクニックを組み合わせます

サマリー

私たちは、大規模なコイルドコイルドメインの特性評価と結晶化を導くための簡単な生化学的および計算的分析を組み込んだフレームワークを記述します。このフレームワークは、球状タンパク質に適合させることも、さまざまなハイスループット技術を組み込むために拡張することもできます。

要約

構造決定のための結晶を得ることは、どのタンパク質にとっても困難で時間のかかる提案です。コイルドコイルタンパク質とドメインは自然界のいたるところに見られますが、その物理的特性と凝集傾向のために、伝統的に結晶化が特に難しいと考えられてきました。ここでは、特定のコイルコイルタンパク質の一連の可能なドメイン境界を特定し、溶液中のこれらのタンパク質の挙動を迅速に特徴付けるように設計された、さまざまな迅速で簡単な手法を利用します。強蛍光タグ(mRuby2)を追加することで、タンパク質の特性評価が簡単かつ簡単になります。標的タンパク質は、通常の照明下で容易に視覚化でき、適切なイメージャーを使用して定量できます。目標は、成功する可能性が低いために結晶化パイプラインから削除できる候補を迅速に特定し、最良の候補により多くの時間を確保し、結晶を生成しないタンパク質に費やす資金を減らすことです。このプロセスは、初期のスクリーニング作業から得られた情報を組み込むために反復することができ、ハイスループットの発現および精製手順に適合させることができ、結晶化のためのロボットスクリーニングによって強化されます。

概要

X線結晶学を介した構造の決意は、現代生物学のあらゆる分野への根本的な貢献をしてきました。生活とどのように彼らは様々な状況下で互いに対話をサポートする巨大分子の原子ビューを提供します。私たちは、病気を引き起こすメカニズムを理解することを可能にし、合理的疾患を治療するための薬を設計する機会を提供します。結晶学は長い高分子構造を決定するための支配的な実験的手法となっており、現在の構造データベース（www.rcsb.org）の89.3パーセントを占めています。この技術は、非常に高解像度のための潜在的な、サイズの広い範囲、比較的容易なデータ収集、および高分子は、溶媒だけでなく、リガンドと相互作用する方法を視覚化する機会を巨大分子を可視化する機能など、多くの利点があります。

組換えタンパク質発現^1,2における数多くの技術の向上にもかかわらず、PURification ^3、及びこれらのシステム^4、結晶過程における単一の最大の障害物を生成するために使用される分子生物学、回折品質結晶を成長させる能力が残ります。これは、大規模なコイルドコイルドメインを含むタンパク質のために特に当てはまるてきました。すべてのアミノ酸の5％ほどが、この非常に共通の構造的特徴⁷作り、コイルドコイル内で^5,6を発見^し 、まだこれらのタンパク質は、多くの場合、より多くの困難を精製し、結晶化さ球状タンパク質よりも^8-10されていると推定されています。これはさらに、コイルドコイルドメインは、多くの場合、したがって、正しく多くの場合、結晶化のために有害である非構造化またはフレキシブル配列の包含を回避することが重要であり、これらのドメインの境界を予測する、より大きなタンパク質のコンテキスト内で見出されるという事実によって悪化します。

ここでは、Webベースの計算を組み合わせた概念フレームワークは、エクスペリと分析を提示構造研究、そしてどのように準備し、結晶化の試行の前に、タンパク質サンプルを特徴づけるためのタンパク質断片（複数可）を選択する方法：ベンチからリットルのデータは、結晶学的プロセスの初期段階を含むを通じてガイドのユーザーを支援します。私たちは、大規模なコイルドコイルドメインを含む二つのタンパク質に我々の分析に焦点を当てる、マッシュルーム（SHRM）とRhoキナーゼ（ロック）。両者がコイルドコイルドメインを含み、生物学的に関連する複合体^11-16を形成すること^が知られているように、これらのタンパク質を選択しました。マッシュルームとRhoキナーゼ（ロック）は、それぞれ構造的に^17-20特徴づけられているそのうちの多くの部分をコイルドコイルの〜200および680残基を含むことが予想されています。ここに記載された方法は、迅速に結晶化やすいであろうコイルドコイル含有タンパク質のフラグメントを同定するための合理化されたワークフローを提供し、しかし、記載された技術は、簡単にほとんどのタンパク質またはタンパク質複合体のために適合さまたは高スループットapproaを組み込むように修正することができますCHESとして利用できます。最後に、これらの方法は、一般的に安価であり、ほぼすべての経験レベルでユーザが実行することができます。

プロトコル

注：概念フレームワークまたはワークフローの図を参考のため、図1に記載されています。計算または配列に基づく予測、タンパク質の発現および精製、生化学的特徴、および結晶化：プロトコルは、4つの段階に分けることができます。図示の実施例は、マッシュルームSD2ドメインおよび/またはマッシュルーム・ロック複合体を分析するが、任意のタンパク質と共に使用することができます。

1.コイルドコイル領域の境界の計算予測を生成するために、Webベースのツールを設立

1. シーケンス同族体の進化的に多様なセットを収集します。
   1. www.uniprot.orgに移動し、上部の検索バーにマッシュルームを入力します。
   2. 次の自分のアクセッション番号のボックスをチェックして、ダウンロードするシーケンスを選択します。スターを有する配列はUNIPROTによってレビューシーケンスを示します。一般的に、より信頼性があります。すべての配列が完全かつ正確であることを保証するために注意してください。
   3. 選択されたのを保存[ダウンロード]ボタンをクリックしてequences。
   4. クラスタル-オメガ^{21（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）}を使用して、マッシュルーム配列の集合を合わせます。マッシュルーム配列とファイルを選択し、「参照」ボタンをクリックし、Submitを押してください。
   5. アライメントが完了したら、「位置調整のファイルをダウンロード」ボタンをクリックします。
   6. （ファイルから| |入力アライメントファイル）Jalviewを使用して、1.1.5で生成された複数の配列アラインメントを開きます。新しい整列ウィンドウ、アイデンティティ（|パーセントアイデンティティカラー）による色の中で。
2. 二次構造の予測、柔軟なまたは無秩序な配列の予測を計算し、目的のタンパク質（複数可）内のコイルドコイル領域を予測しました。
   1. コイルドコイルの予測を計算するために、http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgiに移動します。コピーとシーケンスボックスに列を貼り付けて、[送信]をクリックします。
      注：この分析は、コンプに数時間かかる場合がありますLETE。マッシュルーム配列は非常に大きいので、配列は、ウェブサーバのサイズ制限内に収まるように1,000未満のアミノ酸のブロックに分割される必要があり得ます。 Shrm2を分析する場合には、このセクションでは、コイルドコイル領域を含むことが知られているSHRM SD2ドメインを含むよう千C末端アミノ酸が使用されることが推奨されます。他のタンパク質とのこの分析を繰り返す場合は、可能な場合は、完全長タンパク質配列を使用することをお勧めします。それができない場合は、公知の生化学的または機能的データに基づいてシーケンスを可能な最大の断片を使用するか、または切開。
   2. コイルドコイルの予測を計算するために、http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgiに移動します。コピーとシーケンスボックスに列を貼り付けて、[送信]をクリックします。
3. マッシュルーム・シーケンスの単一の包括的な注釈に1.2.2へのステップ1.1の結果を結合します。
   注：非常また、任意およびすべての関連する私を含めることが奨励されていますこの段階でのタンパク質の機能または精製についての文献や他のソースから収集することができますnformation。
4. この総合的な注釈付き配列を使用して、保護を最大化しようとすると、タンパク質のドメイン境界（または可能な境界のシリーズ）を予測し、無秩序または可撓性配列の量を最小限に抑えながら、構造的特徴を予測しました。既知の場合、得られたタンパク質は、目的の機能特性を保持すべきです。

第1節で同定されたドメインの境界2. ExpressとPurifyのタンパク質

注：このセクションの目的は、第1節で生成された架空のドメイン境界をスクリーニングするために迅速かつ簡単に定量化可能な一連のアッセイを使用することです。

1. 標準的な分子生物学技術を使用して、彼の₁₀ -mRuby2-XH2プラスミド内のフレームにおける所望のコード配列を有する発現プラスミドを生成し（ベクターマップAについては、 図3を参照してくださいND詳細）。
2. 18-24時間室温で自己誘導培地¹にBL21（DE3） 大腸菌または他の適当な発現株を用いて、各発現プラスミドのためのテスト発現レベル。
   1. このような、ここ（https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial 1などの細胞に付属または堅牢な形質転換プロトコルを使用して説明書には、次のBL21（DE3）に発現プラスミドと同様に、空のプラスミド対照を変換-変換/）。
   2. たての形質転換プレートから、単一コロニーを選択し、/ mlカナマイシン34μgので溶原性ブロス（LB）培地中で一晩、37℃で5ミリリットルをスターター文化を育てます。
   3. 次の日、文化をペレット化し、新鮮なLBのでペレットを洗浄
   4. 34 / mlのカナマイシンを自動誘導培地50mlにスターター培養物を追加します。文化は、室温または37℃のいずれかで飽和状態に成長することを可能にします。一般的に、18から24時間〜のために成長します。
   5. ペレット細胞sおよび無期限精製前に-80℃で得られた細胞ペレットを凍結します。
   6. 最も効率的に所望の融合タンパク質を産生する株を決定するために、各発現株及びSDS-PAGEによる空ベクター対照からの全細胞抽出物の比較。彼₁₀ -mRuby2-マッシュルームSD2融合タンパク質を、約50分間、又は染料前線がゲル²²の底部に達するまで、180 Vで10％SDS-PAGEゲルを実行します。
   7. 各株²³内の総細胞タンパク質を可視化するクマシーブルー染色ゲル。
3. 成功しmRuby2融合タンパク質を発現し、各株に初期アフィニティークロマトグラフィー工程を実行します。一般的に、タンパク質は、4℃で精製などの改変された条件の恩恵を受けるない限り、精製は、室温で2.3.2-2.3.7手順を実行します。
   1. ステップ2.2.5からの細胞ペレットを解凍します。
   2. 溶解緩衝液（10％グリセロール、500mMのNaCl、40 1.5mlの各細胞ペレットを再懸濁mMイミダゾール、20 mMトリスpH8.0の、1mMのβ-メルカプトエタノール）。適切なプロテアーゼ阻害剤を溶解バッファーを補います。
   3. 10mg / mlのリゾチームの30μlを添加して、室温で20分間インキュベートします。楽器のための指示に従って超音波処理は、使用されています。
   4. 不溶性物質または非溶解細胞をペレットに14,000×gで30分間テーブルトップ遠心機で1.5ミリリットルチューブと遠心分離機に移します。 SDS-PAGEを経由して、その後の分析のために上清とペレットの両方を保存します。
   5. Ni-NTAビーズを100μlで可溶性画分をインキュベート、ニッケルアフィニティー精製を行います。ビーズを混合するために、数回転倒、5〜10分間可溶性溶解液でビーズをインキュベートします。
   6. ビーズをペレット化し、卓上遠心機で30秒間800×gで遠心分離します。非特異的な汚染物質をオフにきれいにする溶解緩衝液でペレット3-5回洗浄することにより、これを従ってください。
   7. 1を補充した溶解緩衝液でビーズからルビー融合タンパク質を溶出Mイミダゾール。
   8. 上記の「間に合わせ」精製に彼-mRuby2-マッシュルームタンパク質の挙動を比較するためにSDS-PAGEを使用してください。

3.有利な特性を持つものを同定するためにタンパク質サンプルを特徴づけます

1. ルビー融合タンパク質の濃度を測定し、その後、ネイティブPAGEゲル²⁴上に融合タンパク質の1-5μgのをロードすることによって試料の均一性を評価するために、280nmで分光光度計セットを使用します。 175 Vで140分間、4℃で10％ネイティブPAGEゲルを実行します。
   1. 画像mRubyタグ化融合は、このアッセイで移行どこ観察、蛍光を可視化するために装備イメージャーを使用して、ネイティブPAGE。
      注：このタンパク質はおそらく集約されるよう十分でスタックしている融合タンパク質を観察するように注意してください。蛍光イメージャーが利用できない場合、1は、多くの場合、視覚化することができますとRubyの画像に濃縮サンプルはブラックライトの下またはUVライトボックスを有するタンパク質をタグ付けされています。
2. 安定的に折り畳まれたドメインを同定するための限定分解を実行します。 0.025％ズブチリシンAの5μlを持つミリリットル〜1ミリグラム/でのRuby-SHRM SD2融合の95μLをインキュベート
   1. 各時点での反応からの10μLを除去し、0、0.5、2、5、15、60、及び120分の時点で反応をサンプリングし、15％アクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEを介して反応の進行を視覚化します。
   2. ステップ2.2.7のようにクマシーブルーで染色し、プロテアーゼ耐性種を識別することができるかどうかを評価します。
3. 溶液中のこれらのタンパク質の全体的な動作を総合的に評価の中に部分的に精製されたmRuby2-マッシュルーム融合タンパク質の精製効率、ネイティブPAGEでの動作、および限られたタンパク質分解からのデータを統合します。
   1. 適切な機能的アッセイが利用可能である場合（オプション）、この時点での活動をチェックします。

4.コイルドコイルSD2の高品質結晶を生成マッシュルームからドメイン

注：タンパク質は異なる温度、通常は4℃で精製恩恵を受けるない限り、セクション4.1内のすべてのステップは室温で実施されています。

1. 発現および精製能力の目安として50ミリリットルの増殖を使用して、完全に精製されたサンプルの5-20 mgの達成を目標にmRuby2-マッシュルームSD2の大規模な表現を行います。典型的には、培養2 Lは、適切な出発材料を提供します。 10分間、8000×gでの遠心分離による成長細胞をペレット化した後。
   1. 溶解のためにリゾチームを用いた場合、凍結細胞ペレットのグラム当たりの溶解〜2 mlで使用し、前のように、溶解緩衝液中の2 Lの成長からペレットを再懸濁します。代わりに、ホモジナイザーやフレンチプレスを使用している場合、ペレットの〜8ミリリットル/ gで再懸濁します。 30分30,000×gで遠心分離によって細胞破片をペレット化。
   2. バッチは、Ni-NTA樹脂10mlのを使用して4.1.1からの可溶性画分に結合します。適切な重力カラムに注ぎます未結合タンパク質は切ることができます。
   3. 洗浄は、1 MのNaClを補充した溶解緩衝液で洗浄した溶解緩衝液40mlで3~5回樹脂。
   4. 80 mMイミダゾールを補充した溶解緩衝液40mlで洗浄樹脂。
   5. 1 Mイミダゾールに補充溶解緩衝液40mlでのRuby-マッシュルーム融合タンパク質を溶出します。手動で4〜10ミリリットル画分に溶出したタンパク質を分画。
   6. 10％SDS-PAGEを用いてのRuby-マッシュルーム融合タンパク質を含む画分を確認してください。
   7. 適切な画分を透析6-8 kDaのMWCO透析チューブを用いて、15mMのイミダゾール、20mMトリスpH8.0の、1mMのβ-ME、8％グリセロール、250mMの塩化ナトリウム、に（典型的には2-4分画）。融合タンパク質のあらゆる25-50 mgのためのTEVプロテアーゼ1mgを追加します。ゆっくりと攪拌しながら室温で一晩透析。
   8. 反復ニッケルアフィニティー精製は、4.1.2ステップ。 4.1.6へ。彼の₁₀ -mRuby2がバインドされたままになりますしながら、マッシュルームSD2ドメインは現在、非結合画分に残るべきです樹脂および溶出画分に記載されています。クマシーブルーでこの使用して、12％SDS-PAGE染色を確認してください。
   9. 8％グリセロール、100mMのNaCl、5mMのβ-メルカプトエタノール緩衝液を一晩20 mMトリスpHを8.0にマッシュルームSD2ドメインを含有する画分を透析します。
   10. FPLCを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー^25を実行し、0.1〜1.0 MのNaClからのNaCl勾配で溶出します。 12％SDS-PAGEを用いて分画を分析します。
   11. スピンコンセントレーター（研究されているタンパク質に応じて、10キロダルトン以上のMWCO）を使用して、ミリリットル/〜0 mgまでのピーク画分を濃縮し、次いでサイズ排除クロマトグラフィー^26を実行^し 、12％SDS-PAGEを介してピーク画分を分析します。
   12. プールのピーク画分および20 mMトリスpH8.0の、50mMのNaCl、2％グリセロール、1mMのβ-ME、および結晶化する前に10mg / mlに濃縮するに透析します。
       オプション：このステップの間の濃度で5μlのサンプルを除去する1、2、5、および10mg / mlのサンプルを濃縮する過程。このステップの間にサンプルの振る舞いを見て、各サンプルのネイティブPAGEローディング2-5μLを実行します。
2. 結晶化試験のための最適なタンパク質濃度を同定するために12の条件の小さな配列をスクリーニング。これらの状態の組成は、 図7に記載されています。
   1. 蒸気拡散法、ピペッティングを使用して結晶化試験を行い、24ウェルシッティングドロップ結晶化トレイを使用して、最初はうまく溶液1μlとカバースリップ上のタンパク質試料の1μLを含ん滴が続く別々のウェルへの12の条件のそれぞれの500μlの。この技術の詳細については^27を参照^してください。
   2. 迅速に明確なテープでトレイを密封し、振動の自由で適当な温度制御された環境にトレイを移動します。使用温度は変えることができるが、4°C、16°C、および20°Cは非常に一般的です。
   3. 次の3日間にわたりトレイの低下を調べ100X倍率までの顕微鏡を使用してAYS。 3日間の期間の終了時に、降水（クリア）、光沈殿、豪雨（茶色）、または結晶を含有しないように、各ドロップをスコア。適切なタンパク質濃度はせいぜい6重い沈殿が含まれている必要があります。
   4. 4.2で同定されたタンパク質濃度を用いて、市販の結晶化スクリーンの広い範囲をスクリーニング。また、液滴の誤差を最小限に抑えながら液体処理または結晶化ロボットの使用が大幅にこのプロセスをスピードアップします。これは、ユーザーが単一のサンプルでより多くの条件をスクリーニングすることができ、同様にはるかに少ないタンパク質を必要とします。
   5. 系統的に以前のように24ウェルスクリーニングトレイを用いた結晶化ドロップ内の各変数を変化させることにより、広い画面から特定の初期条件を改善します。

結果

本システムで利用するワークフローを示す図で、図1に示されており、三つの主要な段階を含みます。配列のコンピューター分析は、関心のコイルドコイルタンパク質のドメイン境界についての仮説を開発するために利用されます。 Shrm2 SD2ドメインの注釈付きの分析の例を図2に示されています。この図では、目標はマッシュルームがSD2と呼ばれる細胞骨格レギュレータのC末端に保存されたドメインのための可能なドメインの境界を同定することでした。この分析から架空のドメイン境界の三つの異なるセットは、結晶化のための最良の候補として終わったC末端付近全体の保存SD2または最小限のフラグメントにまたがるコイルドコイル断片を含む生成されたました。配列解析から同定候補者は、その後すぐにmRuby2でタンパク質融合を使用して、小規模でテストされている（ 図3）FO効率的な解析をrの。代表小規模（培養の50ミリリットル）2彼の₁₀ -mRuby2タグ付きタンパク質の精製は

ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、ユーザーが自分の結晶化を促進するために大規模なコイルドコイルタンパク質内ドメインの境界を識別するのに役立つように設計されています。プロトコルは、潜在的なドメイン境界の系列を生成する計算予測と他のソースからのデータの様々な全体的な組み込みに依存しています。これらは、迅速かつ安価であり、さらにこれらの初期の仮説を絞り込むために使用されている生化学的実験のセットが続いています。このアプローチを使用して、ユーザーはすぐに望ましくない潜在的なタンパク質断片を排除し、より良い候補者にもっと注意を集中することにより、結晶を得るの見通しを向上させることができました。

多くの重要なステップは、架空のドメイン境界の初期セットの開発など結晶の製造のためのような重要などれもが、しかし、この技術の中にはありません。このステップでは、情報OBとしてだけでなく、計算の様々なアプローチを取り入れときに利用可能な文献や機能データからtained。ケアは、予測のいずれかに定量化可能な信頼値を取り付ける場所には方法が現在存在しないように、単一の「最良の」ソリューションに至るまで、すぐに磨くた...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BL21(DE3) ロゼッタ	エムドミリポア	70954-3
BL21(DE3) スター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	C601003
BL21(DE3) コドンプラス	アジレントテクノロジー	ズ 230245
リゾチーム	スペクトラムケミカル Mfg Corp	L3008-5GM
Ni-NTA樹脂	Life Technologies	25216
SubtilisinA	Spectrum Chemical Mfg Corp	S1211-10ML
24 well Cryschem Plate	Hampton research	HR3-160
INTELLI-PLATE  96:	Art Robbins Instruments	102-0001-03
PEG 3350	Hampton research	HR2-591
PEG 8000	Hampton research	HR2-515
PEG 400	Hampton research	HR2-603
PEG 4000	Hampton research	HR2-605
pcDNA3.1-Clover-mRuby2	Addgene	49089
オーバーナイトエクスプレス自動誘導システム1	EMD Millipore	71300
Lysogenyブロス	パウダーThermoFisher Scientific	12795027