細胞分裂と拡張の動解析：成長とサンプリング発達ゾーンの細胞基礎での定量化トウモロコシ葉

Summary

細胞の分裂と増殖を定量化することは、全植物の成長を理解するために非常に重要です。ここでは、トウモロコシの葉の成長速度を決定する細胞パラメータを計算するためのプロトコルを提示し、発生段階特異的なサンプリング戦略を指示することにより、これらのデータを分子成長調節メカニズムを調査するために使用することを強調します。

Abstract

成長分析は、対照的な遺伝子型と環境条件の影響を調査するために植物科学でよく使用されます。これらの解析の細胞的側面は、成長が細胞分裂と細胞の伸長によって駆動されるため、非常に重要です。キネマティック解析は、これら2つのプロセスを定量化する方法論を表しています。さらに、この手法は専門外の研究室でも簡単に使用できます。ここでは、単子葉トウモロコシ(Zea mays)の葉で運動学的分析を実行するためのプロトコルを示します。(1)細胞分裂および増殖パラメータの定量化、および(2)発生ゾーンの位置の決定の2つの側面が提示されます。これは、サンプリング設計の基礎として役立つ可能性があり、および/または、葉の成長ゾーンにおける高い空間分解能での生化学的および分子測定のデータ解釈に役立つ可能性があります。トウモロコシの葉の成長ゾーンは、定常状態の成長中に収穫されます。個々の葉は、DAPI染色による分裂組織長の決定とDIC顕微鏡による細胞長プロファイルに使用されます。このプロトコルは、定常状態の成長中に収穫された単子葉植物の葉に適しており、成長ゾーンは少なくとも数センチメートルに及びます。植物の成長制御の理解を深めるためには、成長と分子研究に関するデータを組み合わせなければなりません。したがって、運動学的解析の重要な利点は、分子レベルでの変化を細胞発生の明確に定義された段階に関連付けることができることです。さらに、特定の発達段階のより焦点を絞ったサンプリングが可能になるため、予算や時間が限られている場合に便利です。

Introduction

成長の分析は、一般的に環境要因への遺伝子型決定の成長の違いおよび/または表現型の応答を記述するために、植物の科学者によって使用されている一連のツールに依存します。彼らは、サイズと重量植物全体または器官の測定と成長の基礎となるメカニズムを探求する成長率の計算を含みます。臓器成長は細胞分裂および細胞レベルで膨張することによって決定されます。そのため、成長中のこれらの2つの方法の定量化を含めて、全体の臓器の成長¹の違いを理解する鍵と分析しています。これにより、非専門の研究所によって使用することが比較的容易である細胞の成長パラメータを決定するための適切な方法を有することが重要です。

キネマティック解析はすでに臓器成長モデル²の開発のための強力なフレームワークを提供するアプローチとして確立されています。技術は線形システム用に最適化されました、このようなシロイヌナズナの根と単子葉植物の葉などが、また、このような双子葉葉³のような非線形システムのため。今日では、この方法はますますどの遺伝子、ホルモン、発達研究するために使用され、環境要因が、様々な器官（ 表1）に細胞分裂および増殖に影響を与えます。制限は、植物材料のより高い量を必要とする技術（ 例えば、代謝産物のための器官の大きさ及び空間的構成によって課すことができるが、また、それはまた、その基礎となる生化学分子、および生理学的規則（ 表2）に細胞プロセスをリンクするためのフレームワークを提供します測定、プロテオミクス、 など ）。

例えば、トウモロコシ（ トウモロコシ ）の葉、単子葉葉は、順次成熟に到達するために分裂組織と伸びゾーンを通過し、細胞が先端に向かって葉の基部から移動する線形システムを表しますゾーン。これは、成長⁴の空間パターンの定量的研究のための理想的なモデルシステムになります。また、トウモロコシの葉は、大きな成長ゾーン（数センチメートル^5に及ぶ分裂組織と伸びゾーン）を持っているし、他の組織レベルでの研究の可能性を提供します。これは、分子技術、生理学的測定、および細胞生物学のアプローチ（ 表2）の範囲で運動学的分析により定量化し、細胞分裂と拡張を制御する（推定）調節機構の調査を可能にします。

ここでは、単子葉植物の葉に運動学的解析を行うためのプロトコルを提供します。まず、葉軸に沿った位置とどのように運動学的パラメータを計算するの関数として細胞分裂と細胞伸長の両方の適切な分析を行う方法について説明します。第二に、我々はまた、このサンプリングの設計のための基礎として使用することができる方法を示します。高解像度のサンプリングAN：ここでは、2例を議論しますdはそれぞれ、改善されたデータの解釈と時間/お金の節約を可能にする、サンプリングを集中しました。

動の表1.概要は、細胞分裂と様々な臓器の拡大を定量化するための方法を分析します。

器官	参照
単子葉植物の葉	16、20、21、22
根の先端	2、23、24、25、26、27、28、29
双子葉植物の葉	21、30、31
頂端分裂組織を撃ちます	32

動の表1.概要は、細胞分裂と様々な臓器の拡大を定量化するための方法を分析します。

分子レベルでそれらの調節に運動学的分析によって定量化細胞プロセスの間に、表2のリンク。様々な種及び臓器における生化学的および分子アッセイからの結果に細胞プロセスの定量化を結ぶ様々な研究への参照。キシログルカンendotransglucosylase（XET）、マロンジアルデヒド（MDA）、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）。 この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Protocol

注：運動学的分析のための以下のプロトコールは、定常状態の成長中の葉にのみ有効です。これは、数日間⁶の期間中に安定した葉の伸び率とセル長と葉の拡大の空間パターンを意味します。

1.植物の成長と葉の伸び率の測定（LER）

1. 定常状態の成長の葉や関心の発達段階を選択してください。
   注：同一の軸上に連続した葉に類似の空間パターンを意味し、定常状態の成長および繰り返し成長の差があります。苗の成長の初期段階では、連続した葉は、通常、成長ゾーン⁷の大型化にますます速くによる成長します。少数の高い葉の位置が同様の成長パターン^8を持つことができ^ますが、これは調査中での処理によって影響を受ける可能性がある過渡的な段階です。行及びTRとを比較することが重要ですそれは異なる時間で開発することができるにもかかわらず、厳密に同じ葉位にeatments。でも一定の伸び率で、成長率プロファイルは、必ずしも異なる発生段階で同じではありません。したがって、典型的には、出芽後の日数によって定義された同じ発達段階⁸で葉を分析することが重要です。
2. 単子葉植物で葉の成長の完全な運動学的分析を実行するには、成長の部屋で制御された条件下で各治療と遺伝子型のため、少なくとも15植物を育てます。
3. 当時関心の葉は、（周囲の葉の渦巻きから出現）が表示され、葉が完全に展開されるまで（ 図1I）定規で毎日葉の長さの測定を開始します。葉長、葉の先端に土壌レベルからの長さを意味します。これは、その成長を変えるかもしれないので、破損したり、葉を傷つけないように注意してください。

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図1：トウモロコシの葉の運動学的分析の概略関心の葉は、葉の伸長率（LER）を計算するために3日間連続定規で測定されます。その後、葉を収穫し、三センチセグメントが分裂組織のサイズを決意するために使用されます。これは、DAPI染色後の最も遠位の有糸分裂の図をベースまでの長さを測定することによって行われます。 （A）増殖性有糸分裂像の実施例、（B）造形有糸分裂像。ミッド静脈の反対側の葉の基部から最初の11センチセル長測定のための1001年センチのセグメントを切断するために使用されています。これらの測定は、成熟細胞の長さ（L _マット ）および分裂組織（ リットル_DIV）を残して、細胞の長さを決定するように機能するセルの長さのプロファイルを作成するための基礎を提供します。ザLの_DIV およびL _マーは、分裂組織（N _マー ）中の細胞の数を計算するために使用されるM> LER 及びL _マットは 、細胞産生率（P）を計算するために使用されます。次に、PおよびN _マーは、細胞周期の継続時間（T _c）がの逆数の平均細胞分裂速度（D）を計算するために使用されます。同じ色の矢印は、これらの矢印で次のパラメータを計算するために使用されるパラメータを示します。スケールバー=40μmの。ローマ数字は、プロトコルに記載された特定の実験手順を参照するために使用されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2.収穫

1. 関心（ 例えば、出芽後三日目）の発達段階では、少なくとも5つの代表的なPを選択運動学的分析を実施する上でバッチからlants。最後の葉の長さを決定するために、ステップ1.3で説明したように、植物の残りの部分を測定続けます。
2. 植物の地上部分をカットします。無傷の分裂部分を維持するために、（ 図1II）の根にできるだけ近いを切りました。
3. 外側の葉から出発して、静かにそれらを一つずつをアンロールすることにより、関心の葉までのすべての葉を削除します。必要に応じて、葉を分離するためにベースからいくつかの余分なミリメートルを削除します。また興味深いの葉（ 図1iii）で囲まれた頂点と小さな葉を取り除きます。
4. 中間静脈の一方の側にベースから出発し、3センチセグメントを切断し、3を充填した1.5 mlの試験管に保存：1（V：V）無水エタノール：酢酸溶液（注意：手袋を着用する）に数ヶ月に24時間のアップのために4℃（ 図1iv）。このセグメントは、後に分裂組織の長さを決定するために使用されます。
5. から静脈の反対側は、ベースから11センチメートルセグメントをカットし（ 図1 V）および顔料（ 図1のvi）を除去するために、少なくとも6時間、4℃で無水エタノールを充填した15mlチューブに入れてください。
   注：その後、（説明を参照）セル長プロファイルを決定するためにのみ最初の10センチ使用しています。
6. 少なくとも24時間（ 図1vi）、4℃での洗浄の別のラウンドのために無水エタノールを更新。
7. 最後に、純粋な乳酸と無水エタノールに置き換えて（注意：手袋を着用）クリーニングと保管のために4℃で24時間、またはさらに使用する（ 図1vi）まで。

3.分裂組織の長さの測定

1. 50 mMの塩化ナトリウム（NaCl）、5mMのエチレンジアミン四酢酸を含有するリンス緩衝液を調製する（EDTA;注意：手袋を着用）および10mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸（TRIS-HClを、pHが7）。
2. セクション2.4から3センチメートルセグメントを取るので、20分（ 図1vii）用のバッファでそれをのk。
3. 待っている間、氷上、暗所でそれを維持する、を1μg/ mlの4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）染色溶液を調製するためにすすぎバッファを使用。
4. DAPI染色溶液中で2~5分間分裂組織セグメントを配置することによって核を染色します。氷の上で、暗い（ 図1vii）で働いています。
5. すぐに顕微鏡ガラス上のセグメントをマウントし、カバーガラスで覆うことにより、蛍光シグナルを確認してください。基礎となる細胞層はいけないしながら、表皮細胞は、蛍光を示すべきです。
6. 染色が十分でない場合、いくつかの余分な分間DAPI染色溶液中にバックセグメントを入れます。
7. 染色を停止するには、カバーガラスと顕微鏡スライドとカバーにバッファをすすぐのドロップセグメントをマウントします。
8. 約1,000表皮の可視化を可能にする、20X倍率でのUV蛍光を備えた顕微鏡を使用してくださいアル細胞を一度に。セグメント全体でスクロールして、増殖性有糸分裂像（中期、後期、終期、および細胞質分裂）を探し、途上気孔（ 図1viii）の造形細胞分裂を回避する^9。最も遠位の有糸分裂の数字が配置されている場所を定義します。
9. 葉のベースと最も遠位の表皮の有糸分裂の数字の間の距離を測定することによって、分裂組織の長さを決定します。画像フレームの全長を測定するために、画像解析ソフトウェア（ 例えば、ImageJの）を使用します。
   1. （葉の根元から最も遠位の有糸分裂の図のように）完全な分裂組織の長さをカバーするフレームの数をカウントし、完全な分裂組織長（ 図1ix）を得るために、1フレームの長さによって、この数を乗算します。

4.セル長プロフィール

1. 乳酸（ステップ2.5）に格納されているセグメントを取り、ベンチに慎重に置きます。セグメントのウィットをカット1センチメートル各（ 図1×）の10セグメントにおけるヘクタールメス。
2. 乳酸の小滴に顕微鏡スライド上の連続した葉切片をマウントします。一貫向軸または背軸面を上のいずれかに直面することを確認します。原理的には、特定の側には優先順位がありません。
3. 葉の基部から始まって、セグメントを分析するために微分干渉コントラスト（DIC）光学系を備えた顕微鏡を使用してください。一貫して同じ細胞型を選択するために画像解析ソフトウェアを用いて気孔ファイルに直接隣接したファイル内の少なくとも20の反復の表皮細胞の長さを測定します。
   1. セグメント（セグメントで十分あたり4箇所）のそれぞれに沿って等間隔の位置でこれを行い、そして葉（ 図1xi）を通じて、各測定のための対応する位置を書き留めてください。
4. 局所多項式平滑pを用いて、葉軸に沿って各ミリにおける平均セル長を決定しますrocedure、R-スクリプト（;補足ファイル1 図1xii）に実装されています。
   注：R-スクリプトはスムージングの増加に伴う一連のデータを提供します。必要な平滑化の量は、ある程度任意であり、理想的にはちょうど地元のノイズを除去するが、全体的な曲線に影響を及ぼさないはずです。一つの実験内の全てのサンプルについてスムージングの同じ量を使用してください。
5. 植物間の各位置でのセル長を平均葉の軸に沿った細胞の長さプロファイルを作成するための標準誤差を計算します。

機構パラメータの5.計算（補足ファイル2を参照してください）

1. （ステップ1.3と同様に、例えば、24時間、）は、2つの連続する時点間葉の長さの変化を取得し、時間間隔で割ることにより、LERを計算します。
2. 細胞が成熟したCEの95％に達する、ベースからの位置の遠位に対応する成長ゾーン（Lの_GZ）の長さを計算します平滑化セル長プロファイル上のLL長。
   1. その位置（ 図2）は、次の平滑セル長分布の各位置のすべてのセルの長さの平均の95％を取ります。
   2. 各位置で計算された95％の細胞の長さを有する平滑細胞長（ステップ4.4）を比較します。 （;補足データ2を図2を参照）、葉の基部から開始し、成長ゾーンは、実際のセルの長さは、次のセルの長さの95％に等しい位置で終了します。

図2：成長ゾーンの終了を決定する分裂組織：赤い星で示す位置で、実際のセルサイズは、95％（赤点線）よりも小さい全てのセルの平均セルサイズのこの位置以下の（赤色の固体ライン）。成長ゾーン（Lの_GZの終わり;、abで示されていますLUEスター）は、この位置以下のすべてのセルの平均セルサイズ（青の実線）の95％（点線青線）は、実際のセルサイズに等しい位置しています。分割領域（D）、延伸ゾーン（E）、および成熟領域（M）。破線の矢印は、地元の大きさや葉の先端までの基礎の位置から移動した葉の先端部全体の平均サイズの95％の間の収束を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

3. 成長ゾーン（Lの_GZ）の長さと分裂組織の大きさ（;ステップ3で決定したLの_マー ）との差として伸長領域（L _エル ）の長さを計算します。
4. 成熟したゾーン内の平均セル長として成熟細胞の長さ（L _{マット）を}計算_します 。
5. 取得するには、l _マットによってLERを割り細胞産生速度（P）。
6. Nの_GZとN _マーとの差である伸長領域（N _エル ）のセルの数を計算します。分裂組織（N _マー ）での細胞の数は、分裂組織に対応する間隔で位置する細胞の累積数に等しいです。成長ゾーン（Nの_GZ）中の細胞の数は、成長ゾーンに対応する間隔で位置する細胞の累積数に等しいです。
7. P / Nの_マーとして平均細胞分裂速度（D）を計算します 。細胞周期の継続時間（T _c）は 、LN（2）/ Dに等しいです。
8. PでN _エルを分割_することにより伸長領域（T _エル ）で時間を計算します。分割ゾーン内の時間は、ログ_{2（N マー} ）* T _cを等しくなります。分裂組織を離れる細胞の長さ（L _divの ）分裂組織の終わりに平滑化セル長プロファイルからセル長に等しいです。
9. LN（ リットル_マット ）-ln（ リットル_divの ）] / T _エル ：平均以下の式を用いて細胞増殖率（R _エル）を計算_します 。

Results

ここで、我々は彼らの葉の成長の面ではよく水やり植物（対照、54％土壌水分量、（SWC））と乾燥ストレス条件に付し植物（干ばつ、34％SWC）間の比較を示します。すべての植物は、制御された条件（16時間の日/ 8時間の夜、25℃/ 18℃の昼/夜^{、300-400μEm-2}秒^-1光合成有効放射（PAR）の下で成長チャンバー中で増殖させた。干ばつ正しいSWCに達した後、さらに維持したまで。予備研究では、それは五葉が、このストレス条件で出現し、開発した最初の1であることが規定された水を源泉徴収することによって確立された。したがって、それはの葉に選ばれました干ばつストレスを受けた植物の関心。最終的な葉の長さ（LL）が低いLER（ 表3）によるものであっただけでなく、水やり植物の一つ、40％より低かった。リーの細胞の基礎を理解するためにF成長応答、我々は運動学的分析を行いました。全体として、葉の伸長率は、伸長ゾーン（ 図3）で決定された分...

Discussion

トウモロコシの葉の完全な運動学的分析は葉の成長の細胞基盤の決意を可能にし、効率的なサンプリング戦略を設計することができます。プロトコルは比較的簡単ですが、いくつかの注意が次の重要なステップで推奨されている：分裂組織の長さの決意（ステップ3）が完了を必要とするため、（1）分裂組織に損傷を与えることなく、若い、同封の葉（ステップ2.3）を取り外すことが重要です分裂組織が存在することが可能です。いくつかの練習は、事前に必要になることがあります。 （2）分裂長決意は、有糸分裂像の解釈に基づいています。したがって、我々は一つの実験内で、同じ人がエグゼキュータによるバラツキを低減するためにこれらの測定を行うことをお勧めします。わずか10センチメートルは、実際のセルの長さの測定のために使用しても、セルの長さの測定（ステップ2.5）のためのセグメントを採取する際に、セグメントの縁がないがないため、（3）、11センチメートル含めることが重要ですtは常に完全にエタノールおよび/または乳酸に水没します。したがって、この余分センチは成長ゾーンの最初の10センチメートルのクリアを確実にします。 （4）最後に、正しいことを確認するために、すべての機構パラメータの結...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ポット	Any	Any	私たちは以下の対策でポットを使用しますが、治療/研究によって異なる場合があります:底の直径:11 cm、開口部の直径:15 cm、高さ:12 cm。鉢ごとに1つのトウモロコシを育てます。
植栽基質	Any	Any	鉢植え用培地(Jiffy、オランダ)を使用していますが、処理/研究によっては他の基質を使用することもできます。
定規	Any	Any 植物の	最終的な葉の長さを測定するには、少なくとも1.5メートルをカバーする延長定規が必要です。
シード	NAシードは		ブリーダーから注文できます。
メス	Any	Any	メスは、葉の収穫時に目的の葉を周囲の葉から切り離すために使用され、収穫直後に細胞の長さと分裂組織の長さを測定するための適切なサンプルを切断するために使用されます。
15mLファルコンチューブ	任意		15mLファルコンチューブは、無水エタノールと乳酸によるサンプルクリア時の細胞長測定に使用されるサンプルの保管に使用されます。
エッペンドルフチューブ	Any	Any	エッペンドルフチューブは、分裂組織の長さ測定に使用されるサンプルをエタノール:酢酸3:1(v:v)溶液で保存するために使用されます。
手袋		Any	ラテックス手袋は、腐食性試薬から保護します。
酢酸	任意の		注意:金属に対して腐食性、カテゴリー1 皮膚腐食、カテゴリー1A、1B、1C深刻な眼の損傷、カテゴリー1;可燃性液体、カテゴリー1,2,3
無水エタノール	任意		注意: 皮膚接触(刺激性)、眼接触(刺激性)、吸入の場合に危険です。皮膚に接触した場合(透過器)、摂取の場合にはわずかに危険です
乳酸 >98%	どれでも		注意:金属に対して腐食性、カテゴリー1皮膚腐食、カテゴリー1A、1B、1C深刻な眼障害、カテゴリー1
ナトリウム(NaCl)	のいずれか	エ
チレンジアミン四酢酸(EDTA)	どれでも	いずれか	注意:急性毒性(経口、経皮、吸入)、カテゴリー4皮膚刺激性、カテゴリー2眼刺激性、カテゴリー2皮膚感作性、カテゴリー1特定の標的臓器毒性–単回暴露、カテゴリー3
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(Tris-HCl)	任意		この物質は刺激物となる可能性があるため、目や皮膚との接触は避けてください。粉塵の吸入は気道に刺激を与える可能性があります。
4′,6-ジアミジン-2′-フェニルインドール二塩酸塩(DAPI)	DNA		用の任意の細胞透過性蛍光マイナー溝結合プローブ。皮膚の炎症を引き起こします。アレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性があります。呼吸器への刺激を引き起こす可能性があります。
氷	任意の	NA	DAPI溶液は氷上に保管する必要があります。
蛍光顕微鏡	AxioScope A1、ZeissのAxiocam ICm1、		顕微鏡は、分裂組織の長さを決定するために使用できます。
微細スライド	任意の
カバーガラス	任意の
ピンセット	は、		収穫直後に転がされたトウモロコシの葉を広げるために必要であり、細胞の長さと分裂組織の長さの測定のための適切なサンプルを切断するために必要です。
NA	画像解析ソフトウェア	Axiovision(リリース4.8)	ソフトウェアは、http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html でダウンロードできます。ImageJ(https://imagej.nih.gov/ij/)などの他のソフトウェアも使用できます。
DIC	AxioScope A1を搭載した顕微鏡、ツァイスのAxiocam ICm1など		微分干渉コントラスト(DIC)を搭載した顕微鏡は、細胞長の測定に使用できます。
R統計解析ソフトウェア	R Foundation for Statistical Computing	NA	オープンソース。https://www.r-project.org/
Rスクリプト	NA	NA	Kern Smoothパッケージ(Wand MP、Jones MC)のカーネルスムージング関数locpolyを使用しています。カーネルスムージング:Chapman&Hall/CRC (1995))。このスクリプトは、対応する著者に問い合わせることで、MacおよびWindowsで使用できます。