微生物光遺伝学アプリケーションのための自動照明、培養、およびサンプリングシステムの設計と実装

Summary

我々は、倒立顕微鏡を用いて流出液中の微生物、定期的に画像を細胞の培養物を照明する光遺伝学システムを使用するための連続的な培養装置を設計しました。照明の動的応答は、数日間にわたって測定することができるように培養、サンプリング、画像化、および画像解析は完全に自動化されています。

Abstract

光遺伝学システムは、細胞プロセスを変更するために特定の波長の光に反応して立体構造を変更遺伝的にコードされたタンパク質を利用します。光遺伝学システムのプログラムされた照明および刺激を組み込んだシステムを培養し、測定が必要です。我々が構築した光のプログラムされた用量で微生物細胞を照射し、自動的に取得し、流出液中の細胞の画像を分析するために、連続培養装置を使用するためのプロトコルを提示します。ケモスタット、この装置の動作は、増殖速度と細胞環境を厳密に制御することを可能にします。連続的な細胞培養の流出物は定期的にサンプリングし、細胞をマルチチャンネル顕微鏡によって画像化されます。蛍光強度および培養流出物から採取した細胞の細胞形態の動的応答が複数日にわたって測定されるように培養、サンプリング、画像化、および画像解析は完全に自動化されていますユーザーの入力なし。我々は、動的に転写を活性化する光遺伝学系で操作サッカロマイセス・セレビシエの株においてタンパク質産生を誘導することによって、この培養装置の有用性を実証します。

Introduction

光遺伝学システムは、遺伝子発現^{、1、2、3、4、5}タンパク質の局在化^、6タンパク質活性^、6、7、8タンパク質結合^{、8、9、10、}およびタンパク質分解を含む細胞プロセスの成長のリストを制御するために光を使用します。プログラムされた光刺激と制御された環境で細胞を培養するため、および生物学的に関連するタイムスケールの上にそれらの応答を測定するための¹¹の方法は、細胞生物学、バイオテクノロジーの研究のためにこれらのツールの可能性を利用することが必要です。我々の方法は、AE、よく混合した一定の細胞増殖速度を維持するためにchemostasisを利用します評....

Protocol

図1：連続培養装置。この略図は、それを培養するために使用されたときに装置を組み立てすべきかを示し照明、及び微生物の光学的特性を測定します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：プロトコルの概要。斜線領域での手順は、プロトコルが使用されるたびに繰り返さなければなりません。閉ループ制御³⁴可能であるが、このプロトコルで実装されていません。

1.サー....

Results

この装置は、CRY2 / CIB1タンパク質対³⁰に基づいて、誘導光遺伝学転写系を介して青色光に応答して、黄色蛍光タンパク質（YFP）を発現するS.セレビシエの培養物を刺激するために使用しました。細胞は0.2±0.008の平均希釈率でリン酸限定培地でchemostatically成長させました。リン酸塩の制限は、一般に、成長速度を制御するためにS.セレビシエケモスタット実験で使用され、リン酸制限の効果は十分に特徴付けられています。 ^{31、32は 、}連続的に希釈された培養容器³³の流出物は、倒立顕微鏡でマイクロ流体デバイスにサンプリングしました。 図8に示すように、画像が自動的に分析されました。個々の細胞は、バックグラウンドを差し引いた位相コントラスト画像とそのYFPのco.......

Discussion

私たちは心の中で柔軟にこの装置を設計しました。使用されるすべてのコードはフリーでオープンソースです。セグメント細胞へのデフォルトの画像解析処理が簡単で、すぐに実行されます。カスタム解析は、フィジーグラフィック・ユーザ・インタフェースを代表画像を解析BeanShellのスクリプトに入力を変換し、その後、スクリプトを呼び出すためのプラグインを設定する際に、ユーザ入力を記録することによって実現することができます。それが呼び出されると、このスクリプトは、バックグラウンドを差し引いた画像の最新のセットにファイルパスを含む「画像」と呼ばれる文字列配列を送信されます。実験が突然終了した場合、それらが失われないように、それらが収集される画像やデータが保存されます。青色LEDアレイは、我々の光遺伝学系を誘導するために選択されたが、それは、異なる色のLEDに置き換えることができます。それは簡単にPCB上の追加のMOSFETスイッチとリレースイッチ用のマイクロコントローラ上だけでなく、スルーホール利用可能な追加の入力ピンと出力ピンがあります。このシステムのために、より複雑な目的のために適合されます。例えば、LEDに電力を供給し、培養容器に縛り付け光センサーか.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
広範なラボマニュアル	GitHub	NA	更新される広範なラボマニュアルは、「光遺伝学的ケモスタットファイル」GitHub リポジトリ (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files)。これには、代表的な結果を生成するために使用されるマイクロ流体モールドの説明も含まれます。
Fritzing Design Viewer	Fritzing	NA	fzzタイプの回路基板デザインを表示および編集するための無料のオープンソースソフトウェアは、「http://fritzing.org/download/」
Arduino Uno R3 (Atmega328 - 組み立て済み)	Adafruit	50	必要です。
Arduino Stackable Header Kit	SparkFun Electronics	10007	PCBをマイクロコントローラに接続するためのメスピンヘッダ。 1個必要です。
調整可能な30W 110Vはんだごて - XY-258 110V	Adafruit	180	PCBへの電気接続用。 1個必要です。
はんだごてスタンド	Adafruit	150	基板への電気接続用。 1個必要です。
ミニはんだスプール - 60/40 鉛ロジンコアはんだ 0.031インチ直径 - 100g	Adafruit	145	PCBへの電気接続を行います。
0.1 μFコンデンサ	SparkFun Electronics	COM-08375	PCBの電圧を安定させます。
10 μFコンデンサ	スパークファンエレクトロニクス	COM-00523	基板内の電圧を安定させます。
MAX7219CNG LEDマトリックス/桁ディスプレイドライバ - MAX7219	Maxim	MAX7219CNG	LEDドライバ 1個必要
8ピンICソケット	Mouser Electronics	575-144308	16が必要です。これらは、LEDマトリックスの上の培養容器を支えるために、互いに積み重
24ピンICソケット	Mouser Electronics	535-24-3518-10	オプション。これを使用して、MAXIM 7219CNGドライバをPCBに可逆的に取り付けます。
デジタルマルチメータ	Adafruit	2034	電子機器のトラブルシューティング用。 1 必須。
ブレークアウェイヘッダー - 40ピンオス(ロングセンタリング、PTH、0.1インチ)	SparkFun Electronics	PRT-12693	LEDマトリックスをプリント回路基板に接続するためのオスピンヘッダーです。端部はワイヤーカッターでトリミングできます。1セット必要です。
フラッシュダイアゴナルワイヤーカッター	Adafruit	152	長いピンヘッダーのトリミングと電源ケーブルの切断用。1個必要です。
プレミアムメス/メスジャンパーワイヤー - 40 x 12インチ(300mm)	ブレッド	793	ワイヤーリボン。オスピンヘッダーで端から端まで接続して長くすることができます。1 必須です。
ハーフサイズのブレッドボード	Adafruit	64	LEDマトリックスがこれに接続し、培養容器がその上に置かれます。
ミニチュア8x8青色LEDマトリックス	Adafruit956		光源。主波長は470nm(青)です。1 必須です。同じベンダーの代替ミニチュアLEDマトリックスは、624 nm(赤)、588 nm(黄)、525 nm(緑)、572 nm(黄緑)、および白の主波長で利用できます。
積み重ね可能なヘッダー-3ピン	SparkFun Electronics	13875	8が必要です。
抵抗器キット - 1/4W (合計 500)	SparkFun Electronics	10969	電子機器用。1 個必要です。
IRL520N MOSFET	International Rectifier	IRL520N	DC電流を制御するための電圧調整スイッチ。 4個必要。
フックアップ ワイヤ - アソートメント (ソリッド コア、22 AWG)	SparkFun Electronics	PRT 11367	電子機器用ワイヤ。1 個必要です。
5V 2A (2000mA) スイッチング電源 - UL規格	Adafruit	276	加熱パッドとArduino用の電源。
12 VDC 1000mA 安定化スイッチング電源アダプタ - UL 認定	Adafruit	798	蠕動ポンプ用。2 個必要。
電気加熱パッド - 10cm x 5cm	Adafruit	1481	バイオリアクターの加熱用。 1個必要です。
低流量可変流量蠕動ポンプ	フィッシャー・サイエンティフィック	13-876-1	揚水媒体用。 1個必要
中流量可変流量蠕動ポンプ	フィッシャー・サイエンティフィック	13-876-2	培養用ポンピング用。 1個必要。
9 VDC 1000mA安定化スイッチング電源アダプタ - UL認定	のAdafruit	63	電源用。注文1.
高温防水DS18B20 デジタル温度センサー + バイオ	Adafruit	642	温度計を追加 1個必要です。
Micromanager	Micromanager	NA	https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release」で入手可能な無料のオープンソース顕微鏡制御ソフトウェア
FIJI	ImageJ	NA	「http://fiji.sc/」で入手可能な無料のオープンソース画像解析ソフトウェア
Arduino 統合開発環境	Arduino	NA	無料のオープンソースIDEは「https://www.arduino.cc/en/Main/Software」で入手できますカスタム
コード		GitHubNA	カスタムマイクロコントローラーコードと「BioreactorController」プラグインは「光遺伝学的ケモスタットファイル」GitHub リポジトリ (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files)。
USB ケーブル A to B - 6 フィート	SparkFun Electronics	CAB-00512	マイコンへのデータのダウンロードに使用。 1 個必要です。
bioreactorTimecourse_example.csv	GitHub	NA	CSVファイルからLEDマトリクスの値を読み込むメリットは、画像解析結果に基づいてプラグインからプログラムを呼び出して値を更新し、その値をマイコンに再読み込みすることでフィードバック制御が可能になることです。「光遺伝学的ケモスタットファイル」GitHub リポジトリ (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files)。
Tota-frost gels(拡散紙)	B&Hバンド	&H # LOFSFTL MFR # T1-72	LEDマトリクス用。1が必要。
キッティングシート Crosslink 1/4x12x24in	Grainger, inc	20JL37	培養容器の囲い用のブラックフォーム。 4個必要です。
標準フォトダイオードパワーセンサ、Si、200 - 1100 nm、50 mW	Thorlabs	S120VC	光強度の測定用。 1個必要です。
ラベリングテープ	Fisher Scientific	159015N	緩い部品のラベリングと固定用。1個必要です。
コンパクトパワー&エネルギーメーターコンソール、デジタル4インチLCD	Thorlabs	PM100D	光強度の測定用。 1個必要です。
100mL GL45ハイブリダイゼーションガラス瓶	ベルコガラス株式会社	(7910-40150)	バイオリアクター容器 1隻必要です。
6ポート組立	ベルコグラス社	カスタム	バイオリアクター容器用。チューブ仕様:.125インチOD x .055インチID.ポートA:キャップスラッグの上とチューブの底までの長さ1.0インチ。ポートB、C、E、F:キャップスラッグより上1.0インチ、下33mmの長さ。ポートD:キャップスラッグから1.0インチの長さ、65 mm 下に長い。1 必須です。直径45mmのポリプロピレン製オープントップスクリューキャップと、キャップと容器の間の密閉性を確保するための白色シリコンガスケットが付属します。
スコッチマジックテープ3105、3/4 x 300インチ、	3つのAmazon	B0009F3P3U	クリアスコッチテープのパック。これは、他の多くのベンダーから入手できます。これは、培養容器のマーキングを覆うため、およびPDMSチャネルを備えたカバーガラスをアルミニウム支持フレームに固定するために使用されます。
1/16 "ID x 3/16 "OD x 1/16 "壁タイゴンサニタリーシリコーンチューブ	米国プラスチック株式会社	57288	チューブ ~25' 必要。
Cole-Parmer Twistit ホワイトラバーストッパー、サイズ 10	Cole-Parmer	EW-62992-32	メディアフラスコストッパーと排水フラスコストッパー 2 個必要です。
2L 実験用フラスコ	Pyrex	4980	メディアフラスコと廃液フラスコ 2個必要です。
デイピンチコック	フィッシャーサイエンティフィック	5867	ピンチチューブ用
交換用チューブアセンブリ 1/16インチ ID	トレーサブル 製品	3372	チューブのセットが付属していますが、数週間使用すると摩耗します。
交換用チューブアセンブリ 1/50インチ ID	トレーサブル 製品	3371	ペリスタルティックポンプにはチューブのセットが付属していますが、数週間使用すると摩耗します。
ロックリング付きオスルアー x 1/16" ホースバーブ、ナイロン、25/個入り	コールパーマー	EW-45505-00	コネクター。~10ルアーが必要です。
ロックリング付きオスルアー x 1/8インチホースバーブ、ナイロン、25個入り	コールパーマー	EW-45505-04	コネクター。5個必要、チューブで埋めるためのゴム栓穴ごとに1つずつ。
メス ルアー x 1/16" ホース バーブ アダプター、ナイロン、25 個	Cole-Parmer	EW-45502-00	コネクタ。必要なルアーは ~10 個です。
メスルアー×3/16インチホースバーブアダプター	コールパー	マーEW-45502-08	コネクター ~10ルアーが必要。
コールパーマールアーアクセサリー、メスルアーキャップ、ナイロン、25個入り	コールパーマー	SC-45502-28
コールパーマールアーアクセサリー、オス型ルアーロックプラグ、ナイロン、25個入り	コールパーマー	EW-45505-56
マイクロボアPTFEチューブ、0.022インチID x 0.042インチ外径、100フィート/ロール	コールパー	マーEW-06417-21	チューブ。
Masterflex プラチナ硬化シリコンチューブ、L/S 13、25 フィート	Cole-Parmer	EW-96410-13	チューブ、~25' が必要です。
3/16 "ID x 1/4 "OD x 1/32 "壁タイゴンサニタリーシリコーンチューブ	米国プラスチック株式会社	57293	チューブ ~1' 必要。
真空フィルター	フィッシャー・サイエンティフィック	イ974107	無菌濾材用のNalgene真空フィルター。
Aquel Oxy-Boost 200	Rena Aquatic Supply	AP200	デュアルダイアフラム流量調整式エアポンプ 曝気および混合用。 1個必要です。
0.2 μmポアシリンジフィルター	コーニングインターナショナル	431229	これにより、水槽ポンプからの空気が装置を汚染しないようにします。
Slygard 184 シリコーンエラストマーキット	ダウコーニング	Slygard 184	マイクロ流体デバイス用。 1個必要です。
アメリカの安全かみそり GEM サイエンティフィック シングルエッジカミソリの刃	フィッシャーサイエンティフィ	17989000	チューブとPDMSの切断用。
Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID	Sigma-Aldrich	WHAWB100028 ALDRICH	マイクロ流体デバイスのパンチング入口/出口用 1個必要です。
顕微鏡カバーガラス 22x60-1.5	Fisher Scientific	12-544-G	マイクロ流体デバイス用。 1個必要です。
正方形の窓を持つ長方形のアルミニウムフレーム	カスタム	カスタム	マイクロ流体チャネルをサポートします。外形寸法:3インチx 1.25インチ 内側の寸法(切り抜き部分):7/8インチx 7/8インチ 厚さ:~1/32インチ