鍼治療によりラットとマウスにおけるてんかんElectrocorticograms（ECoGs）の操作とスリープ

サマリー

この論文は、鍼治療、てんかんモデル、およびげっ歯類の睡眠の分析の性能を示しています。鍼治療の手順とツボの特定について説明します。ピロカルピンまたはペンチレンテトラゾール(PTZ)は、てんかんを誘発するために使用されます。睡眠分析には、皮質電図(ECoG)、筋電図(EMG)、脳温度、および自発運動活動の記録が使用されます。

要約

古代中国の文献は、鍼治療がてんかんや不眠症に対する効率的な治療効果を持っていることを文書化しています。しかし、これらの効果の背後にある可能性のあるメカニズムを明らかにする研究はほとんどありません。てんかんと睡眠に対する鍼治療の効果を調査するには、いくつかの問題に対処する必要があります。1つ目は、ヒト、ラット、マウスの間に対応するツボを特定することです。さらに、鍼の挿入の深さ、手動鍼鍼治療における鍼のねじれの程度、および電気鍼治療(EA)の刺激パラメータを決定する必要があります。てんかんと睡眠に対する鍼治療の効果を評価するには、げっ歯類のてんかんの実行可能なモデルが必要です。扁桃体の左中核(CeA)にピロカルピンを投与し、ラットの限局性側頭葉てんかん(TLE)をシミュレートします。ピロカルピンの腹腔内(IP)注射は、ラットに全身性てんかんおよびてんかん重積状態(SE)を誘発します。ペンチレンテトラゾール(PTZ)の5回のIP注射は、各注射の間に1日の間隔を空けて、マウスに自然発症の全身性てんかんを誘発することに成功しました。ラットの睡眠解析には、皮質電図(ECoG)、筋電図(EMG)、脳温度、自発運動活動の記録を使用し、マウスの睡眠解析には、ECoG、筋電図、および自発運動活動の記録を使用します。ECoG電極は前頭葉、頭頂葉、対側後頭皮質に埋め込み、定位手術により大脳皮質の上にサーミスタを埋め込みます。EMG電極は首の筋肉に埋め込まれ、赤外線検出器が自発運動活動を決定します。覚醒、急速眼球運動(REM)睡眠、ノンレム睡眠(NREM)睡眠など、ビジランスステージを分類するための基準は、ECoG、EMG、脳温度、および自発運動活動からの情報に基づいています。詳細な分類基準は本文に記載されています。

概要

てんかんは、再発性発作が患者の寿命全体で発生する一般的な神経疾患です。最もてんかん再発は、抗てんかん薬（抗てんかん薬）によって十分に制御することができます。しかし、てんかん患者の約30％は、難治性てんかん^1を開発^しています。てんかんは、さらに再発を悪化させる可能性睡眠障害を引き起こします。証拠は、てんかんが夜に睡眠を妨害することがありいずれか、または日中の過度の眠気の^2,3を引き起こす可能性があることを示しています。我々の以前の研究はさらにzeitgeber時間（ZT）0、すなわちで発生することてんかんを示し、光の光期間の開始：暗サイクルは、睡眠を減少させます。これは、コルチコトロピン放出ホルモン（CRH）、恒常性因子によって媒介されます。 ZT13（暗期の初め）にてんかん、睡眠を増加させる別の恒常性因子、インターロイキン-1（IL-1）の発現を増強します。概日リズムをスリープてんかんはZT6、の途中で発生した場合に変更されます明期^4,5。一方、睡眠の問題は、さらにてんかん⁶の進行や再発を悪化させます。前述の証拠に基づいて、我々は同時に、てんかんを制御し、てんかん患者における睡眠の混乱を防止するための最適な治療法を明らかにしてみてください。我々は以前正常皮質脳波を（ECOG）てんかん活動とてんかん誘発性睡眠障害を抑制し、電流の一定量をステンレススチール針を通して経穴に送達された10-Hzの刺激周波数でその電気針（EA）に見出さ⁷ 。 100 Hzの刺激周波数を持つEAはさらに、ラット^8,9にてんかん活動と睡眠の中断を劣化させます。この成功した実験では、3つの要因によって決まります。まず、実現可能なてんかん動物モデル;第二に、げっ歯類における睡眠記録および分析のための方法。第三に、鍼治療の正確なパフォーマンスとツボlocatiの精度アドオン。

焦点てんかんと一般化てんかん：てんかんは、2つの主要なタイプに分類されています。私たちは、焦点側頭葉てんかん（TLE）、全般てんかん、てんかん重積状態（SE）、および自発性全般てんかんの再発に興味を持っています。したがって、別の操作は、実験に適したてんかんモデルを作成するために適用されます。焦点TLEを確立するには、ピロカルピンの低用量は、扁桃体（CEA）の左中央の核内に投与されます。このモデルを検証するために、6 ECOG電極は正面（F1＆F2）、頭頂部（P1＆P2）、および後頭部（O1＆O2）、左右両半球でローブに移植し、他の二つの基準電極（R1＆されていますR2）が両半球における小脳の上に配置されています。追加のマイクロインジェクションガイドカニューレを外科的に左CEA（; ML、4.2ミリメートル、DV、ブレグマを基準に7.8ミリメートルAP、ブレグマから2.8ミリメートル）に移植されます。座標は、PaxinosとWから適応されていますラットアトラス¹⁰ atson。焦点TLEが正常に誘導されている場合は、左のCEAの近くにある左頭頂皮質上の電極（P1）からのみ記録、他のECOGの電極から記録されていない重要なてんかん様ECoGsで、支配的なてんかん様ECoGsを取得する必要があります。ラットへの腹腔内ピロカルピンの（IP）注射が一般化てんかんやSEを誘発するが、これは致命的なことができます。各注入の間に1日間隔でペンチレンテトラゾール（PTZ）の五IP注射は、正常マウスでは、自発全般てんかんを誘発し、また、マウスの生存を確認してください。二線ECOG電極がECOG信号を受信すると自発的に再発性てんかんを確認するために、マウスにおける前頭葉および頭頂葉皮質に注入されます。

睡眠ポリグラフ（PSG）は、睡眠中に起こる生理的変化を記録するための包括的な方法であり、それは客観的、非急速眼球運動（NREM）とrの異なる段階に睡眠を分類することができますAPIDの眼球運動（REM）睡眠。 PSGは、脳波（脳波、EEG）、眼球運動（電図、EOG）、骨格筋トーン（電、EMG）、心拍リズム（心電図、ECG）、および血中酸素濃度と呼吸パラメータを含む身体機能のパラメータを、記録します。ラットでは、我々は覚醒、ノンレム睡眠、レム睡眠に警戒状態を分類するECoGs、筋電図、皮質温度、および自発運動を記録します。マウスでの睡眠分析はECoGs、筋電図、および自発運動の結果を用いて行われます。ラットを外科的に前頭葉、頭頂葉、および定位手術による対側小脳皮質で3 ECOGスクリュー電極を移植されています。警戒状態（覚醒、ノンレム睡眠、レム睡眠）の買収後の決意はECoGs、EMG、脳の温度、および自発運動から取得したパラメータに従って実施されます。ラットとマウスの両方で、動物の行動を分類するための詳細な基準は、トンで説明されています彼は、プロトコル。

ラットとマウスの両方が手動鍼やEAを実行する前に、正常に定位手術中に投与麻酔薬の半分の投与量であるzoletilの低用量（25mgの/キログラム）、で麻酔する必要があります。この投与量は、動物は、注射後30〜35分をウェイクアップすることができます。手動鍼またはEAのいずれかが30分の一定時間で、暗期の開始時に行われ、各動物は、連続的に2〜3日間処理されます。刺激EA電流は、ツボに挿入されたステンレス製の針を介して特定のツボに配信されます。刺激電流は、二相性方形パルス列であり、これは、パルス持続時間は150ミリ秒であり、刺激強度を1 mAです。ドライニードル手動鍼治療のために使用される場合、ツボに挿入された針は、10回ごとに5分ひくれます。マニュアル鍼やEAの難しい部分はげっ歯類でツボをローカライズすることです。 LOCラットやマウスでのツボのationがヒトにおける解剖学的位置に似ています。例えば、二国間Fengchiのツボは、ヒト¹¹での解剖学的位置に似ている両耳の間に、3ミリメートル離れて首に後部正中線から位置しています。さらに、皮膚上の低インピーダンスでツボをさらに確認することができます。シャム鍼または偽EA操作は、鍼やEAの実験のために必要です。シャム鍼または偽EAは、腋窩¹²近くに、近いツボに位置する非経穴で実行されなければなりません。

正常にてんかんおよびてんかん誘発性睡眠の中断に鍼やEAの効果を調べるために、以下の要因は、所定の位置になければなりません：実行可能なてんかん動物モデル、てんかん様ECoGsとてんかんの再発の正確な分析、警戒状態を分類する方法げっ歯類での鍼治療やEAの、そして正確なパフォーマンス。

プロトコル

すべての実験プロトコルは、国立台湾大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。

注入ECOG電極、EMG電極、脳サーミスタ、および注射ガイドカニューレ1.定位手術

1. （ - 350グラム、6〜8週齢のSprague-Dawleyラット250）ラットについて
   1. 50mg / kgのzoletilでIP注射によってラットを麻酔。後足をつまん後応答の欠如を観察することによって、麻酔の適切な深さを確認してください。眼軟膏を適用し、毛皮を剃る、およびポビドンヨード溶液および75％エタノールで皮膚を殺菌します。感染を防ぐために抗生物質（ペニシリンG）を注入します。
   2. 手術のためにメス、ハサミ、止血剤、ガーゼ、および焼灼マシンを準備します。オートクレーブし、75％エタノールにより焼灼することにより、外科的ギアとガーゼを滅菌します。
   3. 外耳道に耳のバーを配置し、定位にラットをマウントします。
   4. 使い方メスは、尾側に移動し、両耳間の線に沿って頭蓋骨に約2 cmの正中切開を行います。頭蓋骨を露出させ、メスを用いて頭蓋骨を介して組織を除去するために止血剤で皮膚フラップをクリップ。
   5. 回転工具と頭蓋骨にドリル8つの穴（F1、F2、P1、P2、O1、O2、R1、及びR2）、直径がそれぞれ約0.7ミリメートル、。前頭葉、頭頂葉、後頭葉と左と右半球の両方で小脳のネジ8 ECOG電極。これらの電極は、焦点てんかんの検出のために使用されます。
      1. 記録電極のために、次の座標を使用します。正面（F1とF2）：ブレグマと正中線から2.5ミリメートルにする2.0ミリメートルの前部、頭頂（P1およびP2）：-2.0ミリメートルブレグマ前方および正中線から3.0ミリメートル、および後頭部（O1及びO2）：ブレグマ-5.5ミリメートルの前方および正中線から3.0ミリメートル。
      2. 小脳（-11.0ミリメートルブレグマ前方およびmidliから4.0ミリメートルの上に二つの基準電極（R1とR2）を配置ね）。
   6. ラットの別々のグループ、ドリル3つの穴で、ステップ1.1.5.1で説明したのと同じ座標を持つ皮質の右前頭（F2）と頭頂葉（P2）の上に2つのネジEEG電極を配置します。動物を粉砕し、信号アーチファクトを低減するのに役立つ、左小脳（R1）、上に第3 EEG電極を配置します。これらの電極は、一般的なてんかんを確認し、警戒段階を分析するために使用されます。
   7. 首の皮膚や筋肉を分離し、首の筋肉内に2 EMG電極を挿入します。
   8. ラットで頭蓋骨に別の穴を開け、左CEAへのマイクロインジェクションガイドカニューレを配置する（DV、ブレグマを基準に7.8ミリメートルAP、ブレグマから2.8ミリメートル; ML、4.2ミリメートル）。座標は、Paxinosとワトソンラットアトラス¹⁰から適応されています。
   9. 頭蓋骨に（直径1.6mmの）大きな穴をドリルとMONIに、後に接合される頭頂葉皮質の表面に較正された30-kVのサーミスタを挿入ラットにおける皮質の温度をTOR。
   10. それが発生したときに出血を止めるためにガーゼや焼灼を使用してください。
   11. ルートは台座にECOG電極とEMG電極からのリード線を絶縁し、テザーにサーミスタを接続します。台座をセメントや歯科用アクリルで頭蓋骨にカニューレを導きます。
   12. 感染を防ぐためにポリスポリン（バシトラシン亜鉛/硫酸ポリミキシンB）で局所的に切開を扱います。手術後1週間のために水の動物イブプロフェンおよびペニシリンGの両方を与えます。
2. （ - 48 gであり、6〜8週齢のC57BL / Cマウス20）マウスについて
   1. 50mg / kgのzoletilでIP注射によってマウスを麻酔し、後足をつまん後応答の欠如を観察することによって、麻酔の適切な深さを確認します。眼軟膏を適用します。毛皮を剃毛した後、ポビドンヨード溶液および75％エタノールで皮膚を殺菌します。感染を防ぐために抗生物質（ペニシリンG）を注入します。
   2. 外耳道に耳のバーを配置し、定位にマウスをマウントします。
   3. メスを用いて、尾側に移動し、両耳間の線に沿って頭蓋骨上の近似1.5 cmの正中切開を行います。頭蓋骨を露出させ、メスで頭蓋骨を介して組織を除去するために止血剤で皮膚フラップをクリップ。
   4. 手術用ハサミで頭骨の2つの穴を突くと右前頭葉（F2：2.0ブレグマへミリメートルと正中線へ1.5）上の2つのワイヤECOG電極を配置し、左頭頂葉（P1：-3.0ブレグマするミリメートル-2.5正中線にミリメートル）。
   5. 首の皮膚や筋肉を分離し、首の筋肉内に2 EMG電極を挿入します。
   6. 雌端子へと2.54 mmのコネクタに電線ECOG電極とEMG電極から絶縁されたリード線を接続し、歯科用アクリルで頭蓋骨にセメント。
   7. 感染を防ぐためにポリスポリン（バシトラシン亜鉛/硫酸ポリミキシンB）で局所的に切開を扱います。 1おしっこのために水に動物の両方イブプロフェンおよびペニシリンGを与えます手術後にKです。
3. すべての動物は、実験の開始に先立って7日間回復することができます。
4. 暗（L：D）：12時間サイクル（40 Wリズム12で制御された温度は、23±1℃に維持され、光は、単離された部屋の中で個々の記録ケージ内の別々の家ラットまたはマウス、 X 4チューブ照明）。食料と水を自由に提供します。
5. 録音を開始するために、手術後1週間アンプにテザーを介してECOG、EMG、およびサーミスタを接続します。

フォーカルTLEてんかん、SE、および自然発症再発てんかんの2設立

1. ラットについて
   1. マイクロインジェクションポンプを用いて射出ガイドカニューレを介して左CEAにピロカルピンの0.5μL（2.4ミリグラム/μL）を管理します。注入速度は、焦点TLEを誘導することが0.2μL/分に設定されるべきです。
   2. IPは、一般的なエピを誘導するためにピロカルピンの300ミリグラム/キログラムを注入します再発SEとlepsy。
2. マウスについて
   1. IPは、一日おきに特定のZT点でPTZ（0.035ミリグラム/グラムマウス体重）を管理します。 5つの連続した注射は、自発的かつ反復的に全般てんかんの発症の原因となります。
3. ラットとマウスの両方について
   1. 5000によってECOG信号を増幅し、0.1と40 Hzの間のアナログ帯域をフィルタリングします。
   2. 128 Hzのサンプリングレートでデジタル信号にアナログECoGs信号を変換するA / D変換ボードを使用してください。
   3. 視覚的スコアリングのためのソフトウェアを使用し、発症やてんかんの持続時間を分析します。持続時間を表すために時間スケールを測定します。
   4. 2 mVのより大きな振幅を有するてんかんスパイクの出現によって以上30秒¹³の持続時間とECOGのてんかんを定義します。

警戒状態の3分類

1. ラットについて
   1. 記録の12秒エピソード内ECoGs、EMG、脳の温度、および歩行から取得したパラメータを使用して、警戒状態を決定します。記録を開始するために、手術後1週間アンプにテザーを介してECOG、EMG、およびサーミスタを接続します。 3.1.7 - 手順3.1.5に従って、カスタムメイドのソフトウェアを使用して状態をスコア。
   2. 、赤外線モーション検出器を使用して、自発運動活性を測定信号ごとに1秒を統合し、信号を記憶。
   3. 皮質の温度を測定し、信号を記憶。
   4. 私たちの以前に定義された基準¹⁴に従って、警戒状態を分類します。
   5. 次の特性を利用して覚醒をスコア：（ - 4.0 Hzの0.5）、およびより低いシータパワー、高周波数スペクトルを持つ小振幅ECoGs、高いデルタパワー（6.0から9.0 Hz）を、支配的な運動活性;高EMG活性;徐々に皮質の温度を上昇させます。
   6. followinを使用して、ノンレム睡眠のスコアグラム特性：大振幅のデルタ波優勢ECoGsは、皮質の温度、無運動活性を減少させ、EMG活動の減少となりました。
   7. 次の特性を使用して、スコアレム睡眠：ボディけいれんで急増皮質温度、最小限のEMG活動、および低運動活性、支配的なシータ周波数でECoGsの振幅を減少させました。
2. マウスについて
   1. サーミスタから記録されない皮質温度が存在しない以外は、ラットで行ったように、マウスに警戒状態の分類を繰り返します。

ラットにおけるマニュアル鍼とEAの4パフォーマンス

1. ラットは、EAのプロトコルのために麻酔されます。
2. 解剖学によってツボを見つけて、ツボに低い皮膚インピーダンスを確認します。低皮膚インピーダンスを検出したときに光が点滅しています。注：Fengchiのツボは、3ミリメートル離れた後方正中線から位置していること首に、両耳をトゥイーン。
3. 2ミリメートルの深さでツボにステンレス製の針を挿入します。
4. 挿入された針を10回5分ごとにけいれん。
5. 機能的電気刺激装置を使用して、針を通してツボに1ミリアンペアの強さで（150マイクロ秒の持続時間ごと）、二相パルス列を提供します。
6. コントロールとして偽鍼や偽のEAを実行します。

結果

異なるてんかんタイプのニーズを満たすために、異なるラットおよびマウスモデルがあります。焦点TLEを誘導するために、ピロカルピンの0.5μL（2.4ミリグラム/μL）を左CEAに投与されます。優勢なてんかん様ECoGsは左半球（ 図1A：B）の頭頂葉にECOG電極から取得され、希少てんかん活動は、ECOG電極（ 図1Aの残りの部分からピックアップされています 、C、D、E 、およびf）ピロカルピンを投与した場合。てんかん様ECoGsは、主にピロカルピン投与の直後に記録されています。これらの結果は^、8から採用されています。これらの結果は、CEAに低用量ピロカルピンの直接注入後のラットにおける焦点TLEの成功誘導を示しています。

ディスカッション

実現可能なてんかん動物モデルを選択すると、各実験の目的のために不可欠です。私たちの目標の一つは、てんかん抑制に対するEAの影響を明らかにすることです。 EAは、てんかんに治療効果を示すことができるし、古代中国の文献に記載されている代替医療です。しかし、それを証明する科学的証拠の欠如があります。てんかんに対するEAの効果を決定するために、我々は主に軽度の焦点てんかん上ではなく、重度の全身発作またはSEでEAの影響に焦点を当てました。我々の以前の研究では、低周波数（10ヘルツ）と高周波（100 Hz）でEAピロカルピン誘発性の焦点TLEと焦点TLE-誘発睡眠の中断^7-上の二国間Fengchiのツボの効果を実証するために、ラットにおける焦点TLEモデルを使用しました^9。我々の結果は、100-HzのEAが焦点TLEとTLE誘発性睡眠障害の両方を悪化させるのに対し、二国間Fengchiのツボの10-HzのEAは、焦点TLEと睡眠の中断を抑制することを示唆しています。別の例では、TでありますO特に全身発作やSE、難治性てんかんに対する脳深部刺激の効果を示します。我々は、高域と低強度の電流で視床（ANT）の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
<強い>薬
ゾレチル	ビルバック		50mg / kgのi.p.
ピロカルピン	Sigma-Aldrich	P6503	300 mg/kg i.p.; 1.2 mg マイクロインジェクション
PTZ	Sigma-Aldrich	P6500	0.035 mg/マウス
ポリスポリン	ファイザー
Surgery
ECoG 電極	プラスチック	ラット用 E363/20	スクリュー電極
台座	プラスチック 1	MS363
カニューレ	プラスチック	1 C315G/spc
サーミスタ	オメガエンジニアリング	44008
歯科用アクリル	テンプロン
定位固定装置	ストールティング		硬膜アーム
録音機器
ECoGアンプ	Colbourn Instruments	V75-01
A/Dボード	National Instruments	NI PCI-6033E
赤外線ベースのモーションディテクター	Biobserve GmbH	カスタムメイド
ICELUS	G-System
AxoScope 10 ソフトウェア	分子デバイス
<強力>鍼治療のニーズ
ステンレス針	上海陽龍医療記事有限公司	32ゲージ×1インチ
機能 電気刺激装置	I.T.O., Japan	Trio 300
AcuPen	Lhasa OMS	Pointer Excel II