定量的マイクロ中和アッセイの最適化

マイクロ中和（MN）アッセイは、中和抗体および抗ウイルス活性の定量のためにウイルス学で使用されています。赤血球凝集抑制（HI）アッセイの代替として、MNアッセイは、HI結果^1,2,3の解釈を複雑にする可能性がある受容体結合インフルエンザウイルスでの親和性の変化の影響を受けた非抗原性の影響を克服することができます。最近まで、ほとんどのMNアッセイは、細胞変性効果（CPE）または酵素結合免疫吸着検定法^{（ELISA）4,5}に基づいていました。フォーカスおよびプラーク減少に基づいて、MNアッセイは1990年^6,7,8に開発されました。プラーク減少アッセイは、感染性を定量化するために目に見えるプラークを数えるに依存しています。しかし、視覚的な数は、プラークの大部分は小さく、多くの現在の循環ウイルスの不可視であっても、人間の目によって解決される大きなプラークをカバーします。この不完全なカバレッジは私につながる、審査官の間で実験との間に有意な変化を引き起こす可能性がありますncomparable結果。いくつかのウイルスは、単一の細胞または非常に小さいプラークの不稔感染を示すときにメソッドを使用することも不可能です。

悪いカウント分解能は、画像ベースのプロトコルを導入することによって改善することができます。技術の進歩により、光学顕微鏡および高スループットウェルプレートリーダーは、感染した細胞^9をカウントするための正確な手段を提供することができます。トランス照射顕微鏡下で、特定のマーカーでタグ付けされた感染細胞の細胞下解像度での吸収または蛍光コントラストにより視覚化することができます。サンプルは、コンピュータ画面上で分析することができます。

残念ながら、視野の制限によるもの、百以上のタイル張りの画像は単一のウェルをカバーするために必要とされます。 96ウェルを有するプレートを分析することについて1万画像の撮像及び処理を必要とするであろう。このような骨の折れるプロセスは時間がかかり、高価であり、分解能が得属でありますウイルス感染のルーチン特徴づけのため不要リットル。限られた予算との研究所では、フラットベッドスキャナを中心に構築されたアプローチは、費用対効果の高い、高スループットの代替手段を提供することがあります。

本稿では、ウイルスの多数の抗原特性評価および定量的に抗ウイルス活性及び中和抗体を測定するのに適している改良されたプラーク減少MNアッセイを説明します。アッセイは、いくつかの利点を有する：第一に、それは関係なく、プラークのサイズ、細胞レベルでのウイルス感染を測定することができるイメージングに基づくアッセイです。ウェル内の総感染細胞集団（ICP）をカウントすると、大幅にそれが可能低い感染性を有するウイルスを特徴付けすること、検出感度を増加させます。第二に、より正確な定量的な滴定は、入力ウイルスの量を決定するために、中和の前に導入されます。定量的な入力ウイルスが大幅ヴァリアーを低減します異なる実験や研究室間の結果測定結果を比較しやすくなるとの間る。第三に、中和力価は、定量は、高速かつユーザーフレンドリーな作り、画像を分析することによって直接決定することができます。最後に、プロトコルは、必要な分解能と精度でコスト効果の高い、高スループットの代替を提供します。定量は、フラットベッドスキャナや無料のデータ処理ソフトウェアに基づいています。全体のセットアップは、小さなフットプリントを持っており、ほとんどの実験室で展開可能です。

本論文で提示プロトコルは、ウイルス滴定、滴定の定量、ウイルス中和し、中和定量を含む4つの主要なステップで構成されています。ウイルス力価測定、中和に使用する入力ウイルスの量を決定する準備の実験です。滴定中に、ウイルス濃度の数は、96ウェルプレート中の細胞単層に適用されます。感染した細胞は、その後、セクション2ウイルスDILUで定量化されています入力に対応する中和にウイルスのようなICPが順番にある-85％が適用される20％を生産化 中和プロトコルの部3の力価は、上記のプロトコルが代表的な結果に提示されている続い部4の実験を用いて定量化されています。アッセイは、このような（H1N1）pdm09、A（H3N2）、およびB型ウイルスとして、現在の循環インフルエンザウイルスのほとんどは最後の2年の間に徹底的にテストされています。インフルエンザウイルスの特性評価の結果は、2016年には南半球と2016年から2017年における北半球で使用するためのインフルエンザワクチンに関する勧告を与えたWHO協議会のレポートに含まれていました。

注：以下のプロトコルのためのバイオセーフティーレベル（BSL）は潜在的なパンデミックインフルエンザウイルスの季節性インフルエンザウイルスとBSL 3+のためのBSL 2です。ウイルス滴定ウイルス対照（VC）のウイルス濃度を決定するために中和実験の前に必要とされます。

1.ウイルス滴定

注：ウイルスの数と重複の数に応じて、ウェルプレートは、以下の柔軟性で設定することができます：（1）ウイルスの希釈は行または列（ 図1）のいずれかに沿って配置することができます。各ウイルスには、個別の行/列を占有する必要があります。 （2）ウイルス希釈増分は柔軟性があるが、それは左上隅に最高ウイルス濃度で開始する必要があります。 （3）複製の数に制限はありません。

注：マディンDarbyイヌ腎臓（MDCK）およびMDCK-SIAT1（SIAT）細胞は、博士M. Matrosovich、マールブルグ、GERによって提供されました¹⁰多くの。 SIAT細胞を安定的にヒトCMP-N-アセチルノイでトランスフェクションしたMDCK細胞である：シアル酸（SA）の発現増強のためのβガラクトシドα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ遺伝子α2-6Galで終わるオリゴ糖。

1. 96ウェルプレートにMDCK細胞またはMDCK-SIAT細胞⁸十分なアリコート（200μL/ウェル）。コンフルエンスに到達するために2または3日間、5％CO _2、37℃で細胞をインキュベートします。 10％熱不活化ウシ胎児血清（FCS）及び抗生物質（100U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン）を補充したDMEM中で細胞を増殖。 5％CO ₂及び1mg / mlのG418硫酸と、37℃でSIAT細胞をインキュベートします。
   注：希釈係数を経験し、使用する細胞株に依存しています。細胞単層は、ウイルス接種の時に（ すなわち、無細胞壁またはMDCK細胞用の外形線およびMDCK-SIAT1細胞のための密集したレイアウト）コンフルエントでなければなりません。希釈液としては、例えば、基づきますMDCKまたはMDCK-SIAT1細胞のコンフルエントなフラスコのサブカルチャーを表1に示します。
2. ウェルあたりウイルス増殖培地（VGM）200μlで細胞を3回洗浄。 30分間、70％EtOHで多層プレートウォッシャーを殺菌し、その後洗浄する前に滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）またはVGMでそれをすすいでください。
3. VGMを吸引し、直ちに各ウェルにVGMの50μlを添加します。
4. （テストウイルスとの重複数に応じて、または少ない）6滅菌チューブのそれぞれにVGMの900μLを加えます。 、第1のチューブへのウイルスの100μLをピペットでよく混ぜ、およびシリアルに希釈し、各希釈の間にヒントを変更します。滴定する各ウイルスについて、この手順を繰り返します。
   注：これは、10 ^-6に10 ^-1のウイルス希釈液を与えます。
5. 9の重複ウェル（列9と図1の10）に、最高希釈（ 図1の1×10 ^-5）から始まる、各ウイルス希釈液50μLを追加6ウェルプレート。
6. ウイルスが細胞に感染することを可能にするために2〜3時間、37℃でプレートを置きます。
   注：2〜3時間のインキュベーションは、接種物中のウイルスが単層に到達するのに十分な時間を持っていることを保証する必要があります。
7. オーバーレイを準備します（10ミリリットル/プレート）
   注：オーバーレイは（材料リストを参照してください）2×DMEM、トリプシン（2 / mlの最終濃度）の5ミリリットル、1mg / mlのストックを20μl、およびセルロースコットンリンターの5ミリリットルで構成されています。
8. 接種物を取り除きます。
9. オーバーレイ（各ウェルに200μl）を追加します。邪魔されずに、37℃で一晩インキュベートします。
   注：ウイルス出芽後の約4時間行われるので、プレートは、この時間の後に乱されないことが重要です。
10. 井戸からオーバーレイを吸引します。
11. PBS A（200μL/ウェル）で氷冷4％パラホルムアルデヒドを追加します。 30分間または20分間、室温で4°Cでそれらを配置します。
    注：PBS Aは10、外出先での自然なpHのリン酸緩衝食塩水であります塩化ナトリウム、塩化カリウム0.25gの、のNa ₂ HPO _{4、KH 2} PO ₄ 0.25 gを1.437 gの蒸留水1L（材料リストを参照）、F。
    注：パラホルムアルデヒドを吸入したときに有害であると飲み込むと火傷を引き起こす可能性があります。そこ発がん性の限定的な証拠でもあり、それが皮膚に接触した後、感作を引き起こすことがあります。
12. パラホルムアルデヒドを吸引除去し、PBS Aで二回プレートを洗浄し（200μL/ウェル）。
13. 将来の使用のために4℃でPBS Aでプレートを保管し、または以下の手順で行います。
14. 透過化バッファー（100μl/ウェル）を追加します。室温で30分間それを残します。
15. PBS Aで二回プレートを洗浄し（200μL/ウェル）。
16. ウェルあたり、：（ELISAバッファーで千1）第一抗体を50μl、インフルエンザA型に対するマウスモノクローナル抗体を追加します。振とうしながら、1時間（または4℃で一晩）、室温で静置します。
17. 洗浄緩衝液（0.05％のTween 80 PBS A、V / V）でのp100μlの中で3回洗浄よくえー。洗浄の間に5分間室温でインキュベート。代わりに、ウェル当たり300μlのを使用してインキュベーションすることなく、それを3回洗浄します。
18. ウェルあたり、：二次抗体50μlを、ヤギ抗マウスIgG（H + L）HRPコンジュゲート（ELISAバッファー1,000 1）を加えます。振とうしながら、1時間室温でインキュベートします。
19. ステップ1.17で説明したように、それを3回洗浄します。
20. 基板（50μL/ウェル）を追加します。 30分間、または青色の発色がはっきりと見えるまで室温で静置します。
21. 反応を停止させるために、洗浄の間に2 -3分間、室温でインキュベートし、ウェル当たりの蒸留水200μlでプレートを2回洗浄します。
22. （ 例えば、アルミホイルで包ん）プレートを空気乾燥し、暗所に保管してください。

2.滴定定量

1. 図2aに示すように、フラットベッドスキャナの走査領域内にウェルプレートを置きます。にL字型の位置の制限を使用します最適かつ繰り返しイメージングの場所を確保します。
   注：これは、1回のスキャンで画像2ウェルプレートに可能です。
2. 画像をスキャンします。
   注：設定を表2に示します。
3. 必要なウイルス濃度（ 図3）を計算するための「ウェルプレートリーダー」ソフトウェアを実行します。
   1. 画像をロードするために「ロードイメージ」ボタンをクリックします。サンプリングのしきい値を調整する「グローバルしきい値」タブのヒストグラムで赤いバーをスライドさせます。画像への影響を調べるために、「更新」ボタンをクリックします。
   2. 「計算中和/滴定」ボックスにチェックを入れ。 ICPを定量化するための「サンプリング」ボタンをクリックします。プロンプトが表示されたら、サンプリング結果を保存するために「保存」ボタンをクリックします。
      注：「計算中和/滴定」ボックスがチェックされている場合はサンプリング処理した後、「中和＆滴定計算」と呼ばれる新しいウィンドウが自動的に表示されます。
   3. 負荷または入力ウェルプレート定義マップ。 "：最適なウイルス集団（％）滴定」の閾値（ 例えば、30％）を示します。滴定の結果を計算するために「滴定プロセス」タブを選択します。滴定の結果を確認します。滴定の結果を保存するために「保存して閉じる」ボタンをクリックします。
      注：ソフトウェアの詳細命令について補足S1を参照してください。特注ソフトウェアのコピーは、要求に応じて入手可能です。
      注：一般的に、各ウェル¹¹内の50％（20から85パーセント）全細胞のICPの周りにプラーク減少アッセイ利回りのための最高のウイルス希釈。

3.ウイルス中和

注：中和アッセイのために必要なプレートの数を計算します。各プレートは、1つのウイルスと抗血清の数を収容することができます。

注：抗血清の数と重複の数に応じて、ウェルプレートを目で設定することができますE以下の柔軟性：（1）血清希釈は、行または列（ 図4）のいずれかに沿って配置することができます。各血清は、別々の行または列を占めるべきです。 （2）血清希釈の増分は柔軟性があるが、それはプレートの左上隅に最高血清中濃度で開始する必要があります。 （3）重複数は、抗血清の数のバランスをとります。より多くの重複が実験的変動を平滑化するのに役立ちます。 （4）VCの数とセル制御（CC）の重複数は柔軟性があり、彼らはまた、独立した行または列にする必要があります。 VCの複製の数は、抗血清のそれよりも有意に大きいことが予想されます。

1. 事前に2または3日間、ステップ1.1から1.3のように、細胞単層を準備します。
2. プレートの各ウェルにVGM50μlのを追加します。
3. それぞれ、VCおよびCCの列11と12を使用してください。コラムの最初の行（A）に一時20受容体破壊酵素（RDE）処理の血清50μlのアリコートを追加ナノ秒1-10。
   注：各ウイルスと血清の組み合わせについて、アッセイは二重に行われるので、一方のプレートは、例えば、1つのウイルスは、5つの抗血清に対して試験含んでいてもよいです。
4. H（列図4の1月10日）を行ごとにAから50μLを移すと行H.から50μLを破棄することにより、2倍の段階希釈を行います
5. CC欄（ 図4の列12）の各ウェルに希釈液の50μlのを追加します。
6. CCカラム（列1-11、行図4のAH）を除いて、プレートの各ウェルにウイルスの50μLを加えます。
7. 2-3時間、37℃でそれをインキュベートします。接種物を取り除きます。各ウェルにオーバーレイ（200μl）を追加します。邪魔されずに、37℃で一晩静置します。修正し、ウイルス滴定（1.11から1.22ステップ）の場合と同様に、プレートを染色します。

4.中和定量

1. Figuに示すように、フラットベッドスキャナの走査領域内にウェルプレートを置き図2a再。最適かつ繰り返しイメージングの場所を確保するために、L字型の位置の制限を使用してください。
   注：これは、1回のスキャンで画像2ウェルプレートに可能です。
2. ステップ2.2で説明したように、プレートをスキャンします。
3. 必要なウイルス力価（ 図3、ステップ2.3）を計算するために、「ウェルプレートリーダー」ソフトウェアを実行します。
   1. 画像をロードするために「ロードイメージ」ボタンをクリックします。サンプリングのしきい値を調整する「グローバルしきい値」で赤いバーをスライドさせます。影響を調べるために、「更新」ボタンをクリックします。
   2. 「計算中和/滴定」ボックスにチェックを入れ。 ICPを定量化するための「サンプリング」ボタンをクリックします。プロンプトが表示されたら、サンプリング結果を保存するために「保存」ボタンをクリックします。
      注：「計算中和/滴定」ボックスがチェックされている場合はサンプリング処理した後、「中和＆滴定計算」と呼ばれる新しいウィンドウが自動的に表示されます。
   3. よく-pの負荷または入力後半マップ。で、閾値（ 例えば、50％）を示す「中和：感染控除（％）。」
   4. 力価を計算するために、「中和プロセス」を選択します。力価を確認し、中和結果を保存するために「保存して閉じる」ボタンをクリックします。
      注：中和はVCに対して事前に定義されたICPの減少（例えば、50％や80％など）（ 図4の11列の平均）との血清の最高希釈の逆数として報告されています。 50％ICP減少は代表的な結果で使用されました。

上記の手順に従って、我々は最近の抗原性の特性評価実験からいくつかの結果を提示します。滴定の設定はそれぞれの希釈のための二重重複で、8つの入力のウイルスを検査するために設計されました。ウイルス希釈液をウイルス間のばらつきをカバーするために、1.0×10 -1および1.0×1.0 -6の間で試験しました。テストウイルスは、A /カメルーン/ 15V-2015分の3538、を含むH3N2亜型、からのものであったA /ウラジオストク/ / 2015 36、A /モスクワ/、A /トムスク/ 10/2015 /、A /モスクワ/ 2015分の101 103 / 2015、A /モスクワ/ 100/2015、A /モスクワ/ 133/2015、およびA /ブラチスラバ/ 2015分の437。滴定の結果は図5に示されています。 図5dは、ウイルス希釈の増加に伴ってのICPの減少を示しています。曲線はウェル12内の全ての細胞に感染をもたらした同じウイルスのICP類に対して標準化した（ICP飽和と定義されます）。 ICPがhiで飽和状態に達しなかった場合ghestウイルス濃度、対応する重複からのICP平均が（ 図5dにA /モスクワ/ 2015分の103）の代わりに使用しました。 ICP飽和の30％を生成したウイルス希釈物を中和するための入力ウイルス希釈液（ 表3）として選択しました。

中和は、各プレート上の二重重複で、5抗血清に対して一つの入力ウイルスに感染していることを目的としました。示した参照ウイルスは、H3N2 A /ストックホルム/ 2015分の63です。 5抗血清は、A / HK 14分の4801卵のF12 / 15、A / HK 14分の7295 MDCK F02 / 15、A /南アフリカR2665 / 15 SIATのF50 / 15、A /スイス13分の9715923 SIAT NIBFのF18 / 15、ですおよびA /オランダ14分の525 SIATのF23 / 15。中和の結果を図6に示されています。 図6dは、血清希釈の増加による感染の進行状況が表示されます。縦軸の正規化された陽性集団は、平均ICPに対して、対応する抗血清応答からのICPの比率を表し、参照ウイルス12の。未感染細胞対照からのバックグラウンドICPは、正規化の際に差し引かれました。中和力価は、50％のICP減少（ 表4）に対応する血清希釈の逆数として決定しました。線形補間は、2つの隣接血清希釈の間に入る力価を推定しました。

図1： ウイルス滴定実験におけるウェルプレートのセットアップの例。テストウイルスは別々の行（HへA）に割り当てられています。列は異なるウイルス希釈物（1〜12）のために設計されています。 2列は、各ウイルス希釈重複として使用しました。スケールバー= 10ミリメートル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：「 ウェルプレートリーダー「定量ソフトウェアのデスクトップ図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5：滴定実験の結果。 （a）は、ウェルプレートのセットアップが、（b）はウェルプレートの画像を走査し、（c）のイラストウイルス希釈物に対して正規化されたウイルス感染細胞集団色符号化され、定量化、ウイルス感染細胞集団、及び（d）の。 30％のICPを閾値として使用しました。 （D）中のエラーバーはサンプルの重複（±1 SD）からの標準偏差（SD）です。 （b）および（c）におけるスケールバーは10mmでを=。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6： 中和実験の結果。 （a）は、ウェルプレートのセットアップ、（b）は走査ウェルプレートの画像、（c）の定量、ウイルス感染した細胞集団の図、および（d）血清希釈に対する正規化されたウイルス感染細胞集団。入力のviRUS（VC）は/ストックホルム/ 2015分の63です。 50％のICPは、力価を計算しました。 （D）中のエラーバーはサンプルの重複（±1 SD）からの標準偏差（SD）です。 （b）および（c）におけるスケールバーは10mmでを=。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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表1：MDCKまたはMDCK-SIAT1細胞のコンフルエントなフラスコのサブカルチャーに典型的な希釈液。

表2：フラットベッドスキャナの典型的なセットアップ。

表3：30％、ICPの母集団から算出したウイルス希釈液。

表4：抗血清に対するA /ストックホルムの50％ICP / 2015分の63で力価。

著者らは開示するものは何もない。