使用して報酬を求める行動の変化を測定するための簡単な方法キイロショウジョウバエ

サマリー

私たちは、報酬の状態の変化の指標として自主的なエタノール消費を使用して、ミバエ（ キイロショウジョウバエ ）にやりがいとnonrewarding経験を誘導するためのプロトコルについて説明します。

要約

私たちは、報酬の状態の変化のためのプロキシとしてミバエ（ キイロショウジョウバエ ）にエタノール自己投与を測定するためのプロトコルについて説明します。私たちは、ハエの報酬システムを活用自然の報酬に関連した経験を変更し、報酬の状態の変化の指標として自主的なエタノール消費を使用する簡単な方法を示しています。アプローチは、内部状態の経験媒介性変化に役割を果たしニューロンおよび遺伝子を研究するための関連ツールとして機能します。やりがいとnonrewarding経験にハエを露出させ、および薬物報酬を得るために、モチベーションの尺度として自主的なエタノール消費をアッセイ：プロトコルは、2つの別個の部分から構成されます。 2つの部分はそれぞれ、さらに下流のアッセイのための最初のステップとして、または独立した二選択摂食アッセイとして経験の調節を誘導するために独立して使用することができます。プロトコルは、複雑な設定を必要としないため、任意の研究所で適用することができます基本的なフライ培養ツールとyの。

概要

経験に応じて、行動の修正は、動物がその環境¹の変化に彼らの行動を調整することができます。このプロセスの間、動物は、外部環境の変化する条件で、内部の生理的状態を統合し、その後の生存と再生のチャンスを高めるために、別の上で1つのアクションを選択します。報酬システムは、飲食、またはそのような子孫²のための性行動や思いやりなどの長期生存を確保するものとして、即時の生存率を高める行動を補強することにより、個人および種の生存のために必要とされる行動を動機づけるように進化しました。そのような乱用薬物などの人工化合物はまた、天然の報酬^2を仲介共同オプトイン神経経路によって報酬系に影響を与えます。

最後の二十年の間に、果実はキイロショウジョウバエが molecを研究するための有望なモデルとして確立されている飛びますウラルと行動^3,4にエタノールの影響を形成している神経メカニズム。

以前、我々は、薬物報酬^5を得る^ための動機に、ハエにおけるペプチド性ニューロンのサブセット（NPF / NPF受容体（R）ニューロン）などの性的経験としてそのカップル自然の報酬を、同定しました。 NPF式は、両方の性的な経験にし、例えば、エタノール中毒などの薬物の報酬に敏感です。 NPF発現レベルの変化は、高NPFが減少し、低NPFがエタノールを消費する設定を増加させ、エタノール自己投与^5、の変化に変換されます。彼らはまた、減少したエタノール消費により反射され活性化、とペアになって臭いのための強い好みを表示するようNPFニューロンをアクティブにすると、ハエのためにやりがいのあります。さらに重要なことは、NPFニューロンの活性化は、エタノール中毒と臭気キューとの間に正の関連を形成するハエの能力を妨害します。 NPF / Rとの間の因果関係システム、報酬のメモリ、およびエタノール消費は1つが報酬の状態⁵の変化の指標としてエタノール自己投与を使用することができることを示唆しています。

この公報では、報酬の状態でフラ​​イ自然の報酬システムおよびアッセイの変更を活用するための統合的なアプローチを実証します。アプローチは、報酬の状態の変化の推定値としてエタノール自己投与を評価するために、2つの選択肢のキャピラリーフィーダーアッセイ（CAFE）に続いて2つの部分、自然の報酬関連の経験を操作するための訓練プロトコルで構成されています。 CAFEアッセイは、薬物自己投与のための齧歯類試験で使用される2つのボトルの選択アッセイに類似しており、ハエ⁶中毒のような動作の特定の特性を反映することが示されています。

プロトコル

注：実験計画の概要：実験計画は、雄ハエが4日間にわたって3回連続トレーニングセッションにやりがいとnonrewarding経験にさらされている求愛抑制^7-9のための適応プロトコルが含まれています。 4 - D経験フェーズの終了時に、ハエは3のための2つの選択肢の自発的エタノール消費アッセイで試験されています。他の実験（ 表1）の開始前に適時に行われるべきであるプロトコルは、本明細書中に、複数の実験に使用される事前に行うことができるいくつかのいくつかの準備ステップを含んでいます。

1.準備手順

1. 毛細管フィーダシステムの準備
   1. 27 G針を熱し、バイアル（ 図1）に沿って小さな穴を穿刺するために使用します。
   2. カミソリの刃を使用して半分（横）にバイアルのプラグをカット。プラグの表面上のマーク4点、squarを作成しますE形は、毛細管ホルダーに位置決めします。プラグ（ 図1b）を介して4つの穴を作るために18 G針を使用してください。
   3. 彼らはしっかりとアダプタとして機能し、5μLのガラスキャピラリーを、保持することができるように、マイクロピペットをカットするためにカミソリの刃を使用してください。
   4. 準備されたプラグに4キャピラリアダプタを挿入します。
   5. プラグ上の2エタノールと2 nonethanol含有毛細血管の位置をマークします。
      注：すべてのバイアル間で一貫性の毛細血管の2種類のポジションを維持することが推奨されています。大きな穴がバイアルからハエの脱出を可能にするように、穴の大きさに注意してください。プラグを切断すると、ハエがで絡まことができますいくつかの小さな、緩い繊維を作成するように加えて、バイアルに挿入されたときに下向き側として（通常はカット側の反対側）プラグの滑らかな側面を使用することをお勧めします。
   6. 毛管フィーダシステム（CAFE）のために使用されるバイアルおよびアダプターを多数準備ステップ2.3で説明した実験。
2. 小さなガラス食品バイアルの準備
   1. 日ハエ（ステップ1.4）を収集する前に、マイクロチューブのラックに200ガラスバイアルを手配。溶融物は、マイクロ波を用い（コーンミール糖蜜レシピに従って、 材料の表を参照）食べ物を飛びます。ガラスバイアル（バイアル壁の上に食べ物を汚すしないようにしてください）に、フライ食品の2ミリリットルを注ぎます。食品の硬化をしてみましょう、とラップでバイアルをカバーしています。
      注：食品を含有するガラスバイアルを数週間4℃で保持することができます。
   2. ハエ収集の日には、冷蔵庫から出しバイアルを取り、彼らはハエを収容するためにそれらを使用する前に、RTに到達させます。
      注：食品のバイアルは数週間古い場合は、ハエが食品とガラスとの間の亀裂に捕捉することができるよう食品は、まだ無傷でバイアルから切り離されていないことを確認してください。
3. 毛細管フィーダーアッセイ用のストック食品のソリューションを作ります
   1. 事前にするにはストック食品溶液（5％スクロースおよび5％酵母エキス）を削減する、酵母エキス5.88 gの蒸留水100mL中のスクロース5.88グラム溶解します。
      注：原液を汚染に非常に傾向があります。したがって、それをオートクレーブすることが推奨（121℃、30分、および乾燥サイクルなし）、アリコート作業850μLにアリコートは、さらなる使用まで4℃で保存されます。ストック溶液中の成分の濃度は5.88％であり、単に、ステップ2.3において、使用前に15％エタノールまたは水（既成食品液850μLに150μL）を加えた後、5％の最終濃度に到達します。
4. 実験的なハエの収集
   1. CO ₂パッドを使用して200ナイーブ男性のハエを収集します。
      注意：実験的な質問に関連する任意の研究室株を使用してください。 250ハエが容易に羽化ピック相におけるハエの5瓶から採取することができます。ハエを収集する場合、列に細心の注意を払います最近eclosedいる択ハエ（バージン-探しハエ：自分の腹部に胎便スポットと明るいハエ）。実験に使用される前に4日齢 - 実験ハエは3に食べ物や高齢者を含む小さなガラスバイアルに単独で維持されるべきです。
   2. バイアルを閉じるには、ソフトのプラグを使用してください。
      注：経験フェーズ中に内外へのバイアルのメスを挿入するために、口の吸引を使用しているときと同じソフトプラグは、トレーニングフェーズのために非常に有用であろう。
5. トレーナーのハエの収集
   注：すべての収集されたハエは、25℃及び70％相対湿度（RH）で12時間/ 12時間の明/暗インキュベータ中に保持されるべきです。 12時間/ 12時間の明/暗サイクル便利開始時間に変更することができます。
   1. ヴァージン女性トレーナーのハエ
      1. 500処女の女性トレーナーがWT株や処女受容雌として使用するためのvirginatorストックから飛ぶ収集します。レギュラーサイズの食品バイアル当たり25のグループで女性のハエを維持し、すべての実験でそれらを使用する前に、4日齢 - 3歳にしてOW。
   2. 交配女性トレーナーのハエ
      1. 訓練段階（ステップ1.6.1）の前に交配を受けるWT株やvirginatorストックから300処女雌ハエを収集します。
         注：女性ハエは、通常のサイズの食品バイアルあたり10人の女性のグループに保管し、3歳されている - 実験に使用される前に4日齢。
   3. 男性ハエは交尾した雌トレーナーのハエを生成するために使用されます
      1. 150雄のハエ（必ずしも処女）を収集します。
         注：ハエは、通常のサイズの食品バイアルあたり15人の男性のグループに保管し、3歳されている - 処女雌は交尾トレーナー雌を作成するために飛ぶと対にされる前の旧4日間。
6. 交配女性トレーナーのハエの生成
   1. 15男性が女性コンタに1人の男性を含むバイアルを反転することによりハエと交配メスを生成するにはトレーナーとして使用されるように飛ぶ、10処女雌のペアグループが飛びます訓練段階（ステップ^2.1）10前に18時間-バイアル16をining。
      注：これは、通常のトレーニングセッションの前に夜場所を取る必要があります。 1.5：男性の間の1の比率は、すべての女性が交配されることを保証する女性のハエに飛びます。
   2. 実験の日に、口の吸引器を使用して、バイアルから男性を吸引することにより、男性から交配した雌を分離します。各訓練日の開始前にこの権利を実行します。

2.実験手順

1. 経験の位相を設定します
   1. インキュベーターの光フェーズの開始にできるだけ近い実験を開始します。行動チャンバー内（処女と交配両方）トレーナー女性を配置します。
      注：これは、動作チャンバ内の実験、または静かで25℃、60に設定されている任意の人里離れた環境を実行することをお勧めします - 65％RHを。 50％以上の湿度を保つことは求愛と交尾行動するので、非常に重要ですSは湿度に敏感であることが知られているフェロモン感知、に依存します。
2. やりがいとnonrewarding経験に男性のハエを公開します
   1. ラックの縁に沿ってバイアルを配置する、微量ラック上の単一のオスのハエを含有するガラスバイアルを配置します。
      注：この構成は、実験者が簡単にラックからバイアルを取らずに交尾を受けるハエのペアを観察することができます。
   2. やりがいとnonrewarding交配の経験を受けて、男性用に別のラック（ すなわち拒否され、交配）に飛ぶ（ステップ2.2.1で説明したように）単一の男性を含む100ガラスバイアルの2群準備します。
   3. 吸引トレーナー雌と雄のハエを含む各バイアルに追加します。 1時間のタイマーを設定します。拒否されたグループから開始し、各バイアルに交配メスを追加します。その後、交配する男性に移動し、各バイアルに処女雌を追加します。
   4. 密接に嵌合出会いを見ます処女雌との相互作用雄が1時間以内と以前に交配した雌との相互作用雄が交尾しないことを正常にかみ合うことを確認します。 1時間かけて拒否されたコホートを監視するには、15分間の第二のタイマを設定し、男性を15分ごとに監視します。
   5. 最初のトレーニングセッションの終了により交配を終了しなかった交配集団から拒絶嵌合するように管理さコホート、男性から男性を放電してください。
   6. 定期的なフライ食品のバイアルに、以前に交配女性トレーナーを吸引することにより、最初のトレーニングセッションを終了し、次のコンディショニングセッションのために保管してください。優しく交配男性グループからメスを吸引することによって、この手順に従ってください。
   7. ハエは1時間休憩しましょう。
   8. 二回2.2.7 - を繰り返して、2.2.3を繰り返します。
   9. さらに3日間毎日2.2.8 - 手順2.2.3でトレーニングセッションを繰り返します。
3. 録音消費（CAFE）
   1. 最後conditioninの終わりにグラムセッション（四日）、キャピラリーフィーダーバイアルに単一の男性とのグループにそれらを吸引します。ハエを挿入しながらキャピラリフィーダーバイアルをカバーするために、ソフトプラグを使用し、すべてのハエが挿入された後既製キャピラリー給電プラグをすぐに交換してください。条件ごとに劣ら8以上のバイアルを作成するバイアルに、実験群のそれぞれから8ハエ、 - グループ6。
   2. 静かにプラグの上部に水5mLを添加することにより、プラグを濡らします。バイアルに流出を避けるために、水を添加しながら注意してください。各バイアルに同量の水を追加します。
      注：この手順は、毛細血管からの蒸発を減らすために行われます。したがって、実験の残りのために毎日繰り返されます。相対湿度に応じて、次の日は、プラグに追加するより少ない水を必要とし得ます。
   3. 15％の最終濃度を作成する在庫食品アリコートにエタノールまたは水を加えることによって、2つの別個の食品溶液を調製します。
   4. capillを埋めるために、2食のソリューションと牡羊座、5μLを作成する液状食品は、実験用フィルムストリップに低下し、それが5μLマークに達するまで溶液が毛管を充填することを可能にします。 5μLブラックマークラインの近くにある毛細血管の明確な終わりを使用してください。
      注： - 一緒に8キャピラリアダプタおよび毛細血管を保持するためにインサートとして使用し、一度に複数のキャピラリーを満たすためには、6を接続することが可能です。
   5. ブラックマークで正確に食品のソリューションを配置するためにパラフィンストリップ上にそっと毛細血管をタップします。鉱物油の小滴に各キャピラリーの端部を浸漬することによってキャピラリーをシール。このステップでは、食品・ソリューションの潜在的な蒸発を最小限に抑えることができます。
   6. 毛細血管の露出した側面がかろうじてバイアルの内部（プラグ表面から1mm以下）から覗くまで2エタノール含有毛細血管を挿入し、プラグインの4アダプター/ホルダーを通して毛細血管を含む2 nonethanol。
      注意：ぬれたプラグに近い毛細血管の開口部を維持するの蒸発を低減し、ハエが通常のプラグの上に座ると餌にさらさキャピラリーに降りるように、食品に簡単にアクセスできます。
   7. 実験的なハエが含まれているバイアルに加えて、ハエのないモックバイアルを準備します。このコントロールは、自然蒸発を評価するのに役立ちます。
      注：違いは変数蒸発し、消費データを誤解につながることができますように、プラグに比べキャピラリー開口部の比較的同等の位置を維持するようにしてください。実験中に十分な湿度を維持し、湿ったプラグから湿度が低く、大規模な距離として、ぬれたプラグにできるだけ近い毛細血管の開口部を配置制御されていない蒸発の両方の結果をすることができます。
   8. 定規を使用して、mm単位のブラックマーク線に対して毛細血管のそれぞれの液体の相対的な位置を記録し、これらの値を書き留めます。
      注：解決策は、黒リットルに正確に配置されている場合INEは、値はゼロに等しくなければならない、それは上または下である場合、それは、それぞれ、正または負の値であるべきです。液体の初期レベルは、最終的なO / N消費値の基準点を設定します。
   9. 24時間バックインキュベーターでバイアルを設定します。実験全体を通して一定の時間で毛細血管を交換してください。
   10. バイアルからそっと毛細血管を外し、黒のマーキング線に対して液体のレベルを測定します。
   11. モックバイアル内の液体レベルを慎重に確認してください。
       注：レベルが2mm以上を落とした場合は、蒸発が高く、消費レベルが信頼できないことを示しています。
   12. 2.3.10 - 手順2.3.3に示すように、2mLの水で軽く栓を減衰し、毛細血管の新しいセットを挿入します。 24時間バックインキュベーターでバイアルを設定します。
4. 決定の好み
   1. 私から最終レベルを減算することにより、各キャピラリの総消費量を計算します出発点でnitialレベル。
   2. 同じ食品（エタノール含有毛細血管から別途すなわち nonethanol毛細血管）との両方の毛細血管の値を結合します。
   3. エタノール含有毛細血管から消費量から非エタノール毛細血管から消費量を減算することにより、エタノールの嗜好を計算し、同じバイアルのすべての毛細血管からの総消費量の値によって値を割ます。
   4. 同じ実験群のすべてのバイアルの好みのインデックスを平均します。
      
      注：Nonethanol 1（NE1）、Nonethanol 2（NE2）、エタノール1（E1）、エタノール2（E2）、総nonethanol（合計NE）= NE1 + NE2、総エタノール（合計E）は、E1 + E2を=、総合計消費（合計）=合計NE +合計E、およびエタノール選好指数（PI）

結果

FPreviously、Devineni ら。ショウジョウバエは、エタノール含有食品を摂取するための選択肢が与えられたとき、彼らは食糧^6を含むnonethanolオーバーエタノール含有食品に対する強い好みを表示することを示しました。ここに示したトレーニングプロトコルを受けていないナイーブ男性のハエの生来のエタノール嗜好を分析するときに我々が得たいくつかの代表的な結果です。

ナイーブカントンS男性のハエは4日齢まで熟成させ、羽化時に集め、4日間（ 図2）の過程でエタノールを消費する彼らの生得的な好みについてアッセイしました。展示にnonethanol食品の上に15％エタノール食品を消費するための堅牢な嗜好（ 図2）ハエエタノールとnonethanol含有溶液のショーから消費量を分析します。

ディスカッション

ここでは、Devineniらによって説明された以前の研究に基づいて、報酬を求める行動の変化を測定するための統合アプローチの詳細を示します。⁶ および Shohat-Ophir et al 5.プロトコルの最初のセクションでは、経験入力としてさまざまな種類の性的相互作用を使用し、2 番目のセクションでは、2 つの選択摂食アッセイを使用して、エタノールの消費の好みに対する経験の影響を評価します。

Devineniらによって示されているように 。⁶、ハエにおけるエタノール自己投与は堅牢な行動であり、最初は低くて可変的な好みによって特徴付けられ、時間の経過とともに増加し、より一貫性が増します。発達する好みは、ハエがエタノールの薬理学的効果をその位置に関連付けることを学ぶプロセスを反映している可能性がありますが、その不快な味⁶ およびエタノール蒸気への最初の曝露中に発生することが知られている嫌悪反応¹¹。エタノール含有毛細管の位置...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ポリスチレン 25 x 95 mm バイアル	FlyStuff	32-109
狭いプラスチックバイアル flugs	FlyStuff	42-102
使い捨て滅菌針 18 G および 27 G	任意の会社		1.20 X 38 mm (18 G x 1 1/2") 、0.40 X 13 mm (27 G x 1/2 インチ)
10 x 75 mm ホウケイ酸ガラス 使い捨て培養チューブ	キンブルチェイス	73500-1075
校正済みピペット 5 μL	VWR	53432-706	は、5μを含むように白で色分けされています。L
ミネラルオイル	シグマ・アルドリッチ	M5904
ショ糖、分子生物学グレード	CALBIOCHEM	573113
微生物学のための酵母抽出物粉末	、任意の会社
エタノール	Sigma-Aldrich	32221
標準ピペットチップ(マイクロピペット)	ThermScientific	T114R-Q	容量:0.1-20 μL (ウルトラマイクロ)
IDENTI-PLUGS (フォームチューブプラグ)	Jaece	L800-A	は開口部に適合 6 - 13 mm
IDENTI-PLUGS (フォームチューブプラグ)	Jaece	L800-D	は開口部に適合 35 - 45 mm
バージネーターフライストック	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター	#24638
ナローバイアル、トレイパック(PS)	ジェネシーサイエンティフィックコーポレーション	#32-109BR
ショウジョウバエメディアレシピと方法	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター	http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm
プロピオン酸	シグマアルドリッチ	P5561
	Sigma-Aldrich
Methl 4-ヒドロキシ安息香酸	Sigma-Aldrich	H3647
寒天は	、任意の会社
コーンミール	、お
ばあちゃんの糖蜜	B&で取得することができます。G Foods、Inc
インスタントドライイースト	、任意の企業が