液体中の振幅変調原子間力顕微鏡でのサブナノメートル分解能イメージング

Summary

我々は、液体中の振幅変調（タッピングモード）原子間力顕微鏡を用いて、サブナノメートルの解像度の画像を達成するための方法を提示します。この方法は、市販の原子間力顕微鏡で実証されています。私たちは、パラメータの私達の選択の背後にある理論的根拠を説明し、解像度の最適化のための戦略を示唆しています。

Abstract

原子間力顕微鏡(AFM)は、空気中および液体中のサンプルのナノスケールイメージングのための確立された技術となっています。最近の研究では、振幅変調(タッピング)モードで操作すると、液体中の幅広い軟質サンプルと硬質サンプルに対して原子レベルまたは分子レベルの分解能の画像が得られることが示されています。このような状況では、微小振動振幅(SAM-AFM)は、サンプルの表面で溶媒和された液体を利用することにより、分解能を向上させます。この技術は、材料科学、生物学、生物物理学、表面化学など、さまざまな分野で成功裏に適用されていますが、液体で高解像度の画像を取得することは、初心者ユーザーにとって依然として困難です。これは、カンチレバーの選択、サンプル調製、イメージングパラメータの正しい操作など、制御および最適化する変数が多数あることが一因です。ここでは、市販の装置でSAM-AFMを使用して、流体中の硬質および軟質サンプルの高解像度画像を取得するためのプロトコルを紹介します。私たちの目標は、装置とサンプルの洗浄と調製、カンチレバーの選択、イメージングパラメータの最適化など、高解像度の画像を達成するためのステップバイステップの実用的なガイドを提供することです。各ステップでは、すべてのユーザーの特定のシステムへの方法論の適応を促進するための選択の背後にある科学的根拠を説明します。

Introduction

その発明以来、30年前、原子間力顕微鏡^{（AFM）1は、}特に巨視的な表面領域にわたって平均ところ、ナノスケールでサンプルを調査するための選択肢の技術としての地位を確立していることは不可能であり、地域の情報が必要です。典型的なAFM測定では、フレキシブルカンチレバーの偏向は分子の少数カンチレバーの端部に取り付けられultrasharp先端との間の相互作用力を定量化するために使用されます。考え相互作用のタイプ及び時間スケールに応じて、情報の広い範囲は、ソフト生体膜^2,3の粘弾性特性を含む、誘導することができる、単一の化学物質の強さまたは分子結合^4,5の原子論的な詳細表面^6から8、磁気^9、容量^10、サンプルの^11、熱^12,13および化学¹⁴導電特性を ^{15。それは探針と試料との間の特定の力に依存しないため、AFMの成功の一部は、材料16の広い範囲に及び、真空17、ガス11,18または液体19,20などの複数の環境で動作する能力であります。}

しかし、実際には、周囲以外の条件でAFMを動作させるのは、困難で、多くの公開された結果は、静止空気中で得られることができます。追加された困難は、大きな摩擦力を回避することにより、チップと試料の両方を保持するために動的モード（振動先端）でAFMを動作させるために通常必要であるという事実に由来します。より困難なものの、動的な動作は、原則的に分析し、空間分解能の損失なしに、サンプルに関する詳細な情報を提供することができます。多周波測定を^{、23 -} 10年間で、液体の動的AFMのフィールドは、ビデオレートAFM ²¹の出現から、重要な進展が見られました ^{24,25およびインタフェース26で水和構造のサブナノメートルイメージング- 31。 36、ポリマー研究37、電気化学38 - - 40固液界面41特徴付け- 44を液中に浸漬しながら、AFM動作について日常的に生物学および生物物理学32で使用されています。振動カンチレバーの周りの液体の存在はかなりそのダイナミクス45と同様に、先端と試料29,42の間の相互作用を変化させます。適切に使用されるとき、液体は、周囲条件46で達成最高の解像度と比較して、大きさのほぼオーダーの典型的な改善と、撮像解像度26,29を強化するために利用することができます。}

AFMでは、特定の測定のために達成可能な最高の空間分解能は、AFM自体の品質とtの両方の性質に依存します彼は相互作用が^20,47,48をプローブしました。現時点では、ほとんどのハイエンドは、熱限界¹²のそれに近い市販のAFM存在するノイズレベルはそれほど解像度のための決定要因は、通常、チップと試料の相互作用です。これは、効果的に解像度を決定し、この相互作用の空間勾配である：短距離、急速に減衰する相互作用に基づく測定は長距離相互作用が遊んでいるときよりも高い解像度の結果を生成します。彼らは離れて、試料⁴⁹の表面から移動するときに液体のわずか数分子径（一般的に<1 nm）を超える消滅する傾向があるため、液体では、溶媒和力は、撮像解像度を向上させることができます。これらの力は、液体分子と試料の表面との間の相互作用に由来します。表面に強い親和性を有する液体は、より規則およびサンプル^29,42,50との界面におけるバルク液体未満の携帯になる傾向があります。結果として、それはナノスケール-the溶媒和の風景での界面の液体の特性の局所的な変化に非常に敏感な測定をレンダリング、バルク液体⁴²よりも界面の液晶分子を変位させる振動AFMチップのために多くのエネルギーがかかります。

溶媒和力を利用するために、いくつかの実用的な側面を考慮する必要があります。まず、先端の振動振幅は<一般的に、1 nmの溶媒和力の範囲に匹敵する必要があります。第二に、使用される液体は、試料の表面で明確に定義された溶媒和の景観を形成しなければなりません。肉眼、これは考えサンプルのための「濡れ」の液体を必要とすることと同じです。例えば、水に、疎水性グラファイト^42,51よりも親水性の雲母の分子レベルの分解能を達成することが容易です。最後に、先端部を支持するカンチレバーのバネ定数を適切^52,53選択する必要があります。これらの詐欺で作業する場合ditions、AFMは、界面の分子レベルの画像を提供しないだけでなく、試料表面⁵⁴に関する化学的情報を得るために使用することができ、ローカルサンプル液親和性に関する情報を導出します。

液体中のAFMのための操作の最も一般的なダイナミックモードは、振幅変調（AM、また「タッピングモード '）AFMと周波数変調（FM）AFMです。その振動振幅が連続チップ-試料間距離を再調整するフィードバックループによって一定に保たれつつ、第1ケース⁵⁵には、チップサンプルをラスタ・スキャンします。試料のトポグラフィ画像は、フィードバックループによって適用される補正から得られます。 FM-AFM ^28,41,56には、先端が試料を走査しながら、一定に保持されるカンチレバー/チップの発振周波数です。両方の技術は、液体^36,57で同等の地形分解能を提供します。チップと試料の相互作用の定量化は、よりstraiになる傾向がありますghtforwardと正確なFM-AFMではなく、AM-AFMは、実装が簡単より堅牢で、より柔らかいカンチレバー、容易に変形やデリケートなサンプルを研究するために有用なものを扱うことができます。重要なことは、AM-AFMの一部は歴史的な理由だけでなく、原因、制御することが技術的に容易であるという事実のために、AFMユーザーの間でより広範囲です。

振幅AM-AFMイメージングの間のフィードバックループによって一定に保たれているが、先端振動と駆動振動との間の位相遅れを自由に変更することが許されます。位相遅れはサンプル⁵⁸との界面における先端の振動中に消費するエネルギーに関連している、チップと試料の相互作用についての有用な情報を提供することができます。したがって、位相イメージングは​​地形イメージングに同時に取得することができ、多くの場合、試料表面の不均一性を強調で相補的です。位相イメージングは​​、ジ含む、相互作用の様々なマッピングのために利用されています付着エネルギー^42、粘弾性特性⁵⁸とインターフェース⁴⁴の水和風景の矩形マッピング。

具体的には、液体中に高解像度の画像を得ることにより制御する多数のパラメータ、およびすべての状況で動作する単純な、系統的プロトコルが存在しないため、非自明なままです。画質は、典型的には、他の⁵⁵のうち、カンチレバー形状および弾性、先端化学、振動振幅、およびサンプルの剛性に依存します。 AFM測定は、定義により、また、システムの摂動です。その結果、適切な配慮なしにイメージング変数や環境条件を変更すると、再現性の困難および/または不適当な観察と誤った結果につながることができます。

ここでは、AMPLで動作市販の装置を用いて、溶液中でのハードおよびソフトのサンプルの高解像度の画像を達成するための我々のプロトコルを提示しますitude変調。私たちの目標は、それぞれの場合にイメージングプロセスの基礎となる物理的原理からの私達の選択の根拠を説明する、異なるサンプル以上の解像度に影響を与える可能性が高い主なパラメータを最適化するための実用的な手順を提供することです。我々詳細は、基板洗浄及び準備から、カンチレバー、撮像パラメータの調整と共通の問題のトラブルシューティングの選択にステップ・バイ・ステップのアプローチ、。高解像度のための私達の選択や手続きの背後にある科学的根拠を説明することの方法論を適応させる際に合理的な選択をすることに役立ち、およびイメージング・小説・システムのための出発点となるべき。

このテキストを通して、私たちは、AFMの振幅変調動作モードを参照するためにAMを使用しています。我々は、 設定値のいずれかと、カンチレバーの偏向（接触モード）または振動振幅（AMモード）の間、フィードバックパラメータを一定に維持指します。 AMモードでは、カンチレバーは、外部から駆動されます。いずれかの音響振動によってまたはパルスレーザでは、カンチレバーの基部に焦点を当てました。 駆動振幅は、外部振動信号の強度です。カンチレバーの所定の振動振幅を達成するのに必要な駆動振幅の絶対値は、このような駆動方法（音響、磁気または光熱）、カンチレバーの固定及びパラメータ（剛性、幾何学）およびレーザアラインメントのような多くのパラメータに依存します。駆動振幅の正確な値は、したがって、関連しないが、カンチレバーの適切な（および定量化）の振動振幅を提供するようにそれを各実験に調整されます。駆動カンチレバーは遠く離れたサンプルからであり、その振動のない減衰がチップと試料の相互作用を介して発生していない場合には、その振動振幅は自由振動の振幅と呼ばれています。振動先端が試料表面に近づくと、その振幅が減少し始めます。フィードバックが有効になっている場合は、z軸ピエゾはconstでますantly選択した設定点の振幅をキールするように、その拡張子を再調整定数。目標値は、通常、無料の振幅よりも常に小さいです。自由振幅の上に設定点比 、セットポイントの振幅の比（撮像振幅）を参照するのが一般的です。目標比より小さい、厳しい撮影条件です。

Protocol

ツールと他の表面の1クリーニング

注：高解像度を目指した場合、汚染の任意の形式は有害な結果を持つことができます。サンプル、基板やAFMチップを操作するために使用されるすべてのツールを徹底的に洗浄されていることを確認する必要があります。以下は、試料ステージ自体を含むサンプル、カンチレバー、またはAFM細胞と接触し得る任意の表面または器具（ 例えば、ピンセット）に適用されます。

1. 再び10分間超純水に続いてイソプロパノール（純度99.7％）、続いて超純水中の楽器（18.2MΩ、<5ppmの有機物）、、、それぞれのバスは、超音波処理します。可能な場合は、ヒュームの吸入を減らすためにヒュームフードの下でイソプロパノールを使用しています。
2. 窒素気流下で乾燥しました。
3. フルイマージョンができない場合（ 例えば、カンチレバーホルダー/エレクトロニクス用）ultrapuに浸し、単層、低リント組織（軽組織ワイパー）で拭いて、物理的に清浄な表面順次、水、イソプロパノール、超純水を再。表面が（通常は15〜30分以内に）空気中で乾燥することができます。

2.基板の準備

注：基板が直接、通常、AFMスキャナおよびサンプルの両方と物理的に接触し、サンプルを支持する固体表面を指します。ほとんどのAFMは、磁気マウントを有し、鋼ディスクを使用することができるが、同一のプロトコルは、例えば、ガラススライドなどの基板に適しています。ここでは、マイカディスクが貼付されている鋼製のディスクを前提としています。この手順の目的は、画像形成に影響を与えることができ、汚染の可能性のある外部ソース限り制限することです。手袋を常に着用する必要があります。

1. バース・超音波処理続いてイソプロパノール超純水（18.2MΩ）の鉄鋼サンプルディスク、そして最後に超純水により再び、10分間それぞれ。
2. 窒素気流下でディスクを乾燥させます。
3. 十分に混合した試薬及び場所〜10で、エポキシ接着剤の少量を調製81;スチールディスク上リットル。
4. 基板に圧力を印加することによって、鋼ディスクに対して基板（白雲母、SiO ₂の結晶、ガラス、 等）を貼り付けます。 （製造元の仕様を参照してください）エポキシは高温で数時間硬化させます。
5. 基板のエッジの周り、何のエポキシが直接空気に露出していないことを確認してください。これは、エポキシ樹脂の過剰量が使用される場合に発生し、汚染源となることができます。
   1. マイカ基板の場合は、顔全体を覆うようにしっかりと、基板上に〜幅2.5cmの粘着テープを押して、スムーズに剥がします。穏やかに粘着テープを使用し、表面に平行に引いて、雲母の皮をむきます。除去された材料は、テープ上に表示されます。マイカが目に鏡面になるまで、このプロセスを2-3回繰り返します。
   2. ガラス/ SiO ₂を、さらに化学的表面改質が必要な場合は、ステップ2.1~2.2の浴超音波処理ルーチンを繰り返します。また、Uを使いますV露光ユニット電力に応じて30〜60分間（18 W UV-C殺菌ランプ））表面上に残されてもよい任意の有機物を熱分解します。この手順は、かなりの粗さを増大させることなく、表面をより親水性にします。

カンチレバー先端の調製

1. 超純水に続いてイソプロパノール浴中のカンチレバーチップ、60分間ずつ浸し。
2. カンチレバー/先端が（ゲルボックスで長期間貯蔵した後など 、）大規模な清掃が必要な場合は、ステップ1の前にアセトン中で30分間浸漬（> 99.5％の純度）を追加（セクションもアドレッシング汚染を参照してください）。ゲルボックスにヒントのストレージは、我々の経験では、非常に急速に^59を発生することができ、汚染の主要な源の一つです。
3. 安定した水和サイト⁶⁰の形成に有利にするためにUV光を簡潔に（<5分）にヒントを公開します。それは、先端またはincに損傷を与えることができるよう、より長い露出オーバー時間を避けますその曲率半径をrease。
4. カンチレバー上に（溶液の性質が調査されたサンプルに依存するが、この場合には、超純水中の塩化ルビジウムの10 mM溶液を使用します）イメージング溶液50μl〜AFMのカンチレバーホルダとピペットにカンチレバーを挿入し、プリウェットそれに先端;試料に接近するとき、これは、気泡の出現を制限します。

AFMセルの4セットアップ

1. 試料ステージ上にサンプルディスクと基板をマウントと撮像液の滴（その最高点で液体で、通常、2〜3ミリメートルの厚さ）を追加します。
2. AFMにカンチレバーホルダーを接続します。
3. カンチレバー/先端と試料上の流体間の毛細管ブリッジを形成するように近接さカンチレバーと試料を持参。

5.初期化測定とカンチレバーのキャリブレーション

1. 先端-Eに近い測定レーザー（通常は赤）を合わせますカンチレバーのND。 AFMのモデルに応じて、ソフトウェア制御を介して、またはレーザー位置を手動で調整することによってのいずれかそう。液体中のカンチレバーの熱スペクトルを取得（ 図1A参照）。プロセスは、カンチレバーの主共振（基本固有モード）の周波数を見つけるために、レーザを用いてカンチレバーの熱変動を記録します。最も近代的なAFMでは、これはソフトウェア制御で自動化された手順を介して行われますが、詳細は、AFMからAFMに異なる場合があります。

図1：チューニングとカンチレバーを校正します。 ：基本的な固有モード（赤）の単純な高調波発振器（SHO）フィットとカンチレバーの垂直偏向（黒）の熱雑音スペクトル。ここで、共振が水に18.7 kHzです。最初の三つの曲げ固有モードに対応する最初の3つの共振周波数がhighliあります青い矢印でghted。 B：カンチレバーの逆光てこ感度の校正。 （非変形可能な）硬い表面に押し付けカンチレバーの線形偏向はボルトで測定された撓み及びナノメートルの対応する値との間の変換係数（InvOLS）を測定するために使用されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2. 硬い基板（ 例えば 、マイカ、ガラス）上のカンチレバーとの距離曲線対たわみを記録した （ 図1Bのように）線形偏向領域における曲線の傾きが団結⁶¹であることを課すことでたわみを校正^{- 63。}
   注：このプロセスは、（ボルトで）光検出器で測定したたわみとの間の変換係数を見つけ、（ナノメートル単位）カンチレバーの本当のたわみ - 自演逆光てこ感度（InvOLS）としてWN。キャリブレーションは、先端部が破損する恐れがありますので、すべての測定が完了した後、それを実施することをお勧めします。キャリブレーションの前に真の振幅の推定値（典型的には> 90％正確な）を取得する前の実験中に同じタイプの別のカンチレバーについて導出InvOLS値を使用します。
3. カンチレバーのバネ定数を得るために^{、66 -}単純な調和振動子モデル⁶⁴と熱的にスペクトルの共振ピークを合わせます。この手順では、ほとんどのAFMソフトウェアで自動化され、通常は問題になっているモデルの専門知識を必要としません。
4. チューンカンチレバー。外部から駆動時にその公称共振周波数に近い周波数の範囲にわたって（ 例えば、音響や光熱励起による）カンチレバーの振幅応答を探します。わずかに左に、このスペクトルにおいて最大の近くに駆動周波数を設定します。カンチレバーはacouある場合stically駆動、多くの偽の最大値は、チューニングするとき表示されることがあります。
   1. できるだけ近く（とのエンベロープ内）AFMを制御するソフトウェアの種類とバージョンに依存してもよいAFMが、仕様の制御ソフトウェアを使用することにより、熱スペクトルで同定された共鳴共振ピークを選択します。

6.アプローチと試料の初期チェック

1. 自由振動の振幅が約5nmとなるように、駆動振幅を設定します。これは通常、ほとんどのAFM上の0.2から0.8 Vに対応（場合にInvOLSが校正されていません）。自由振幅の〜80％に振幅設定値を調整します。
2. 比較的高いフィードバックゲインを設定します（絶対値はAFMによって異なります）が、不安定性やリンギングが発生しないことを確認してください。
3. （〜1 Hzから10 nmのそれぞれに、 例えば ）小さな値に初期スキャン速度、スキャンサイズを設定します。これは、いくつかのフィードバックパラメータが不十分に調整されている場合に、チップを保持するのに役立ちます長い距離にわたってスキャンを回避することによって。スキャンサイズはその後スキャン条件が適切で現れる場合に大きな値（ 例えば、100 nm）に増加させることができます。
4. アプローチする前に（これは光学的に行われなければならないいくつかのケースでは）表面のおおよその高さを決定します。
5. AFM制御ソフトウェアを用いて表面に先端のアプローチを開始します。このプロセスの細部を使用AFMやソフトウェアのモデルによって異なります。
   1. ソフトカンチレバーを使用した場合のアプローチに問題がある場合、接触モードでのアプローチを行います。この場合、ゲインはAMモードの場合よりも低いことを確認し、チップを保持するために（光検出器にレーザーを中心とした後、0.1〜0.2 V）比較的低い値に設定値を設定します。
   2. 先端がわずかに目標値（AMモードでの接触モードまたは減少の増加）を変化させることにより画像を開始せずに表面に到達したかどうかを評価します。先端が表面にある場合は、トンへの影響彼は、Zピエゾの延長は無視すべきです。 Z-ピエゾのライブの動きは、通常、ほとんどのAFMの制御ソフトウェアにグラフで表示されます。セットポイントの変化は、ピエゾの目に見える動きをトリガした場合、これは、偽の係合を示します。後者の場合には、わずかに高い（接触）または下（AM）の設定値を使用して、現在の先端位置からのアプローチを再起動してください。
6. 先端が表面に到達すると、（通常は単に「停止」を押して）、Zピエゾを撤回し、カンチレバーを再調整（ステップ5.4を繰り返します。）;共振周波数は、おそらくチップと試料の相互作用に起因する低い値にシフトしています。
7. （このチップ - 試料の距離で）、新たに調整された自由振幅の〜80％にセットポイントを変更します。
8. カンチレバーをエンゲージし、撮像パラメータが適切であることを確認するために、AMモードで表面の10×10 nmの²スキャンを行っています。
   1. トレース（左から右へスキャン）と帰（左に右スキャンする）ことを確認してくださいプロファイルは重ねます。さらに、設定値を減少させ、ゲインを大きくしてみてくださいない場合。
   2. 画像にノイズになるとゲインを下げてください。
9. 1×1μmの^2×5μmの^2〜5 - -大規模で操作を繰り返したサンプルのスキャンは、これが可能である提供。ソフトまたは生物学的サンプルでは、​​これは先端の汚染をもたらす可能性があります。

7.高分解能イメージング

1. 機能を可視化するのに適した値にスキャンサイズを減らす（ 例えば 、100×100 nmのタンパク質結晶のための²または雲母や方解石のための20×20 nmの^2）。
2. 自動的にZ-ピエゾので、表面から先端を後退させるフィードバックループのための十分なカンチレバーの駆動振幅を減らします。カンチレバーが表面から離れている間、カンチレバーの振幅〜1-2 NM（ピーク・ツー・ピーク）となるように、駆動振幅を調整します。
3. AFM制御ソフトウェアを使用して、プログレZ-ピエゾが表面に向かって再び拡張し、元の画像が回復されるまで、異常に一度にセットポイントmVの数十を減らします。 75パーセントと新自由振幅の95％の間で設定値の振幅を保管してください。
4. AFM制御ソフトウェアを使用してゲインを再調整してください。高い利得が大きなノイズを導入することなく、より低い振幅で使用することができます。
   1. 無料の振幅、設定値の最適な組み合わせを決定し、高解像度のために獲得するように、ステップ7.2から7.4を繰り返します。最適条件は、サンプル（溶媒和の風景や液体の濡れ性）だけでなく、カンチレバー（バネ定数、剛性）に依存します。
   2. 撮影条件を最適化するために、振幅の異なる組み合わせを探索します。再び自由振幅^42を増加^させる必要があるかもしれません。このような場合には、第一のより高い値に設定値を調整し、ドライブ（振幅を減少させるために使用されるよりも、すなわち 、逆の手順）を増加させます。
   3. setpoiをキープ0.5 20nmの範囲の振幅のnt - 1.5 nmの（ピーク・トゥ・ピーク）設定値の比率では、（典型的には0.75から0.95）0.7以上に保ちます。 2 N / mの - 親溶媒インターフェイスの場合、0.5のバネ定数とカンチレバーを使用しています。これは、チップが表面に当たることなく、界面の液体の大部分を除去するのに十分です。経験則は式が提案されています。参照²⁹の4。

Results

前のセクションで説明したプロトコルは、正常molecular-または原子レベルの画像を達成するために、いくつかの市販のAFMを用いて適用されています。すべての画像は手順7.1から7.4ステップ以下、個々に調整0.5 nmから1.5 nmの作業振幅で得られました。結果は、ソフト（ 図2）と硬い（ 図3）試料の広い範囲を得ることができました。それぞれの場合において、関心の特徴が強調されています。技術の大きな利点の一つの小さな振動振幅と高設定点は、脂質の脆弱な自己アセンブリを可能にする、サンプルの先端によって加えられる力を最小限に抑えることである（ 図2A）、タンパク質（ 図2BおよびD）、および両親媒性分子（ 図2C）は 、溶液中の損傷を与えることなく撮像することにします。そのような鉱物硬い結晶性物質（ 図3A、B、D）とすべての場合において、それが効果的に記述されたプロトコルを用いて画像形成される界面の液体であるため、表面（ 図3C）に吸着させ、単一の金属イオンは、アプローチを使用して画像化することができます。溶媒和力は、 図2および図 3に示すサンプルに匹敵する：すべてのサンプルは、（より一般的に図2C、3B、3Dの場合は「親溶媒」）イメージングソリューションに関して親水性です。一貫して、同程度の剛性を有するカンチレバー（0.3 - 0.8 N / m）をすべての場合に使用しました。サンプルチップの両方が液体分子を画像化することができる明確に定義された溶媒和構造を形成することを確実にするために親溶媒であるべきです。これは必ずしも十分条件ではありませんが、ほとんどの場合、比較的少量の液体分子のために、サンプルの対称性を模倣する方法で、液体再構造そのもの。高解像度のメインドライバは、吸着した溶媒分子の親和性の局所的変動であります（ 図2A、3A、3Cの場合はオングストロームスケール）表面のため。技術は、溶媒構造が表面を横切って大幅に変化する材料にしたがって最適です。

図2：水溶液中でAM-AFMによって撮像されたソフトのインターフェイス。 ：ゲル相におけるジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）脂質二重層は、150mMのKClの中で画像化しました。六角形にパックされた脂質頭部基は、水和における部位特異的な変化を示す局所的なコントラストとともに、地形や位相の両方で識別可能です。 B：150mMの塩化カリウム、10mMトリス、pH7.4中に結像好塩菌のsalinarumの紫膜。いくつかのバクテリオロドプシンタンパク質トリマーが強調表示されます。相が原因タンパク質上のローカル水和サイトへの地形とは異なるコントラストを示します。個々のタンパク質トリマー （破線）を作製することができます。 C：色素増感太陽電池中のTiO ₂ナノ粒子の表面に吸着された両親媒性色素（Z907）分子。画像は、エチル - イソプロピルスルホンで取得しました。スポンジ状の外観は、吸着色素分子によって生成されます。 D：B.アンアクアポリン四量体と同じバッファで撮像されたネイティブのウシレンズ膜におけるアクアポリンの結晶が強調表示されます。サブ構造は、ヘリックス間のループに対応する位相は、タンパク質の近くに異常な水の挙動に起因する著しく異なるコントラストを示している地形に表示されます。画像は、参考文献^36（B）、参考文献^38（C）及びREF ^67（D）から適合されています。スケールバーは5nmの（A）、10nmの（B）、（C）3ナノメートル、15ナノメートル（D）カラースケール600、それぞれ200午後及び15°（A）の高さと位相の変化を示しています午後4°（B）、2.5 nmおよび2.5°（C）、及び1.6 nmおよび9.5°（D）。ロード/ 54924 / 54924fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：流体溶液中のハードのサンプルの代表AM-AFM像。 A：方解石結晶[ 平衡化した超純水の溶液に結像]表面。 B：ジメチルスルホキシド（DMSO）で得られた画像形成されたチタン酸ストロンチウム。高解像度を水に不可能でした。 C：3 mMのRbClをで撮像された白雲母-単一の吸着のRb ^+イオンは両方の相と高さのスキャンにおける雲母の格子サイトに表示されます。 D：DMSO中に撮像された中で炭化ケイ素。予想結晶構成は、画像Bに示されており、D.画像は、参考文献^68（A）から参考文献^42（BおよびD）に適合されていますそして、ref ^44（C）。スケールバーは3ナノメートル（A、B、D）および5nmの（C）です。カラースケールは、それぞれ250午後と14°（A）、600午後及び5.5°（B）、800午後と15°（C）、および500午後と3.5°（D）の高さと位相の変化を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

イメージング液とカンチレバー剛性が適切に選択されたと仮定すると、成功した高解像度を達成するための最も重要なステップは、撮像振幅の調整であり、システムの全体的な清浄度を調べました。

界面液体領域（典型的には2nm未満）の厚さに匹敵する振幅は、界面の溶媒⁴²の特性で主に変化をプローブします。振動振幅が大きすぎる場合には、振動チップは、カンチレバーの運動の安定性を排除し、そして必然的に解像度の低下をもたらす関係なく、撮影条件²⁹のサンプルを打つ長距離、非線形力場^52を横断します。別に解像度の損失から、高調波は、先端運動に表示されるように開始し、システムが^55をモデル化するために、より複雑になります。あるいは、撮像振幅が小さすぎるOである場合インタフェースのNLY一部（界面の液体、典型的には、特定の層）をプローブして、安定した画像形成のみ堅いカンチレバーを用いて達成することができるリスクが良好な信号対雑音比のために（>水⁵³ 10 N / m）を、大規模な高さの変動の上に柔らかい試料に損傷を与えます。硬いカンチレバーの必要性は小さい振幅で作業する場合、測定された信号は、チップと試料の間の長距離相互作用が依然として存在しているが、大部分は一定であり、影響しないことが、より重要になることができ、熱雑音を克服することです得られた画像中の高解像度のコントラスト。

それは、高分解能AFMになると、撮像環境の清浄度は最も重要です。システム内の望ましくない化合物は、イメージングおよび力分光法の両方を妨害することができます。撮影する場合（ⅰ）汚染物質（直接見る：実験に影響を与える傾向がある汚染の2つの主なカテゴリがあります。 図4A）に対して対比される水マイカ界面でのような高度に理想化されたシステムで発生する傾向があります。チップとサンプルを変更する前に、それが効果的に繰り返しサンプルに対してハード先端を押すと、大きな偏向に分光曲線を取得する価値があります。これは通常、新しいチップに損傷を与えるだろうが、時折汚い先端を清掃またはイメージングに適した安定した水和サイトを誘導することができます。このヒントは、しかし、必然的に平滑化され、従って、イメージングが改善される場合でも、フラットサンプルのためにのみ適しています。堅いサンプルを超える疑いがある汚染の場合には、上記のやや破壊的な手順を実行する前に、カンチレバーの第二の固有モードで画像に試す価値はあるかもしれ。これは、単にSWが必要です第二の固有モードへの駆動周波数をかゆみと振幅/設定値を（以下のトラブルシューティングの説明を参照）再調整。第二の固有モードで作動し、いかなる弱く吸着した汚染物質が撮影しながら先端によって押しのけすることができるかなりカンチレバー増加の有効剛性。この戦略は、きれいなサンプルとチップの必要性を置き換えるが、チップ/サンプルが明らかに理想的ではないときに良好な画像を取得するために、いくつかのさらなる手段を提供していますされません。

図4：高分解能イメージングを阻害白雲母を撮影するときに観察汚染の例。 ：マイカは5 mMのRbClをで撮像された-何の汚染粒子が表示されていません。 B：汚染は名目上、超純水を撮像しながら、全体で数十nmのオーダーの凝集体の形をとります。 C：contamiによって形成された自己集合構造自然の中でおそらく両親媒性NAntの粒子。イメージングは​​再び名目上は、超純水で行いました。 D：マイカの原子レベルで平坦な表面からの偏差を示すA、BおよびCの破線に対応する垂直方向オフセットのセクション。 A、B及びC中のスケールバーは300nmで対応します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ケース（ii）は、より一般的なサブナノメートルの機能は、単に関係なく、撮影条件を、解決することができないイライラ事実によって主に特徴づけられます。この種の状況の署名は、いくつかの矛盾を示す傾向にある力分光測定では通常表示されます。これらは、かなり一般的なS字状の形状⁴²から外れる距離曲線対再現性に乏しい曲線と振幅を含むことができます。イオン性または他の汚染物質は、ディスある場合流体全体に均質編、彼らは地形イメージングに表示されない場合がありますが、通常のチップと試料の相互作用^29を維持し、高解像度の^70を得るため^に重要であるサンプル⁶⁹の水和構造を破壊する可能性があります。また、特にソフト、生物学的実験では、試料上の汚染物質の直接的な影響があってもよいです。不可能なサブナノメートルレベルの解像度をレンダリングする^{、73 -}例えば、ウェル（洗浄手順から）のアルコールの存在がゲル相の脂質二重層^71を流動化することができることが知られています。高解像度が可能でない場合、注意は、第1の撮像溶液と接触する任意の装置に特に焦点を当て、洗浄工程中に注意すべきです。完全に硬化していない場合、このようなエポキシ樹脂としても表向きは安定な化合物は、ある程度の流体に溶媒和することができます。

AM-AFMによる高分解能イメージングが要求している、忍耐を必要とし、可能な限り最高の撮影条件に到達する前に、多くの場合、いくつかの試験。小さな実験的な問題は、簡単に高解像度とトラブルシューティングスキルが不可欠である防ぐために十分に重要になることができます。以下、私たちは私たちが提案された解決策で発生する最も一般的な問題のいくつかをリストアップ。

カンチレバーのチューニング

ほとんどの市販のAFMカンチレバーを駆動するための音響励起を使用します。ステップ5.4に記載されているような場合には、その共振周波数付近で、カンチレバーのチューニング多くの場合、空気中の動作のために十分な性能を提供します。液体環境では、液体は、カンチレバーチップホルダーとしてAFMの異なる機械部品間のいくつかの結合を誘導する傾向があります。これは、多くの場合、一般に「ピークの森」として記載されている多くの鋭いピークと谷を示すカンチレバーの周波数スペクトルによって示され、カンチレバーの見かけ上の共振に影響を与えることができます。その結果、カレを見つけることがしばしば困難ですCTの駆動周波数。これらのピークは、ガス環境内に存在するが、によりカンチレバーの品質係数の高い値に、共振の振幅は^、74,75かなり大きいです。液体では、カンチレバーを駆動するために、適切なピークを選択することは容易ではないとすることができ、試行錯誤を必要とすることができます。実際には、共振周波数の周りの「ピークの森」での振幅の最も急な変動による周波数ピークは通常、必ずしも正確に共鳴上、多くの場合、高分解能イメージングを取得するのに十分な駆動周波数を提供しているにもかかわらず、最善の策です。

画像の歪み

イメージングドリフトは、多くの場合、高解像度を求めている問題で、画像が歪んだ（一般的に引き伸ばさ）に見えるのです。その起源は、スキャナ/ AFMが平衡動作温度に達していないため、またはサンプル液体の一部が急激に蒸発しているので（ 例えば 、画像化アルコールのいずれかで、一般的に熱であります ）。すべての場合において、ドリフトが熱平衡に無視できるようになります。可能な場合は、サンプルの温度を固定するために有用です。それ以外の場合は、実験を行う前に、数時間のブランクサンプル（低速走査速度で大型スキャン）をスキャンするためにAFMを残す価値があります。蒸発が問題ではない場合は、この手順は最良の第一の面から先端に短い距離（ 例えば 、20μm）を撤回するように注意しながら、手順の手順6の後に行われます。時折、ドリフトがあっても大規模な熱化後に残ります。これは通常、カンチレバーまたはそのチップの一部は、撮影しながら、このような薄いフィルムのような柔らかい粘着性の試料上またはチップ/カンチレバー/チップが適切に配置されていない場合に発生する可能性が何かをサンプルをドラッグしていることを示しています。 1カンチレバー/先端よりもホストより多くのチップでは、しばしば使用されていないカンチレバーを壊すのではなく、それらが表面上にドラッグしてみましょうすると便利です。

イオン強度

ntent ">イメージングは​​、界面液体によって支配されているので、時々水に帯電した表面の高分解能イメージングのためのいくつかの塩を追加すると便利です。塩の役割は2つある。第一に、それはの水和の風景を変更します表面は、多くの場合、コントラストを向上させる吸着、上に結像。第二に、それは（雲母上例えば、）先端と試料との間の画面強い静電相互作用をするのに役立ちます。一般的に、より大きなイオン例えば、カリウム、ルビジウム、セシウムが、それらの特定の水和特性に優れた画像を許可します^76、彼らは多くの場合、ユニークな水和状態⁷⁷で主に吸着するという事実。

バートカンチレバー/先端

それは、（上述の症状を参照）カンチレバーが汚染源であることが疑われる場合、それは最初に光学顕微鏡下で検査されるべきです。ゲルボックスに保存されている場合は、カンチレバーが表示されることがゲルポリマーまたはシリコンオイル⁵⁹の痕跡を拾うことができます、極端な場合には、暗いスポットとして、カンチレバーの背面にある（ 図5（a）のように）。カンチレバーの光熱振動は、同様のスポットを誘導することができるが、それらはレーザ駆動によってカンチレバーコーティングの劣化/過熱に起因するものです。汚染は、カンチレバーにランダムに表示される傾向にあります。超純水で、その後、イソプロパノールで洗浄し、（12時間）が長くカンチレバーから望ましくない粒子を除去することができます。

図5：新しいカンチレバーとの比較や長時間のハード面に広く使用され、ゲルボックスに残されている同一1。 ：トップ;クリーニングされた新品のカンチレバーの光学像（手順を参照してください）。ボトム;光学像は、ゲルボックスから見える汚染（青い矢印）の外観を実証します。 B：カンチレバーのそれぞれの熱スペクトルの比較。古いカンチレバーの第1の共振ピークの広がり（緑色の矢印）がクリアされると、いくつかの高次モードが強化されている（青い矢印）。スペクトルは垂直オフセットと明瞭にするために対数スケールで提示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

必要なサブナノメートルの解像度を低解像度に許容される画像にもかかわらず、達成されない場合には、AFMチップは、化学的に、そのストレージ環境中に変更となっている可能性があります。これは、チップ⁶⁰上の親水性表面基の生成を助ける120秒間紫外線酸化剤にカンチレバーチップの曝露によって治療することができます。ケアは、先端の形状とUV出力に応じて変えることができる必要が正確な時間として、しかし取られるべきである、と過剰露出先端と低解像度の鈍化をもたらす可能性があります。

熱雑音

高解像度イメージングは、力と距離の変化に大きな感度が必要です（通常、サブ-PN力をサブオングストロームは^78を距離）。より柔らかいカンチレバーは、その固有のブラウン運動（熱振動）によるカンチレバーの熱機械的な動きが問題になる可能性があります。第一近似では、剛性kのカンチレバーでは、より小さいフィーチャを測定することは不可能です で、k _Bはボルツマン定数、Tは温度であり、熱雑音の振幅。具体的には、より高い共振周波数を有するカンチレバーを使用すると、より大きな周波数範囲で騒音を拡散し、測定帯域幅⁷⁹内の全体のノイズレベルを低下させます。

高い固有モードイメージング

時々その第二の固有モードでカンチレバーを動作させるのに有用であることができます増加有効剛性による（汚染の説明を参照してください）。実際に、これはその第二の固有モードにカンチレバー駆動することによって簡単に行われる（より高い周波数で第2の共振ピークを、 図1Aを参照）。カンチレバーをチューニングする場合、代わりに単に主共振の第二の固有モードを選択して、5.4に進みます。カンチレバーは、第2の固有モードで駆動されたときにInvOLSは異なるであろうことに注意してください。一般的に長方形のカンチレバーのためのステップ5.2で測定InvOLSの〜1月3日。

技術の主な制限は、試料の表面に安定した溶媒和の風景を必要とすることです。サンプルは、サンプル自体の大幅な変形を引き起こすことなく、界面の液体を乱す可能にするのに十分に堅牢でなければなりません。これは非常に柔らかく、不安定なサンプルなど大きな生体分子に挑戦することができます。さらに、小振幅AFMのpについての機械的な情報を得ることができない、ここで説明したようにサンプルのroperties、カンチレバー先端が界面流体にその時間の大半を費やしているよう。このため、このような定量的ナノメカニカルマッピング⁸⁰のような他の方法を使用するか、カンチレバー運動の高調波を利用することが有益であり得ます。 ^83、同時に地形やサンプル^25,81の剛性を提供することができます^{- - （}低品質因子で）流体に^29,81を撮像する場合、より高いハーモニカは、一般的に強化されている⁸⁴が、それらは一般的に高解像度に有害です。すべての走査型プローブ顕微鏡技術に固有の他の制限は、特に、ここではまだ結果は必然的に測定チップに関する情報が含まれているという事実有効です。小振幅の使用は、大規模な高さ変動を有するサンプルのための理想的ではありません。高さの変動は、撮像振幅よりも大きい場合、フィードバックループは、必然的に、したがって、試料と先端の損傷の危険、よりゆっくりと反応します。使用OFより柔らかいカンチレバーがある程度この問題を軽減します。

ここに提示される方法の主な利点は、それが液体でAFMで可能な最高の画像解像度を提供することであるが、任意の商業AFM上に実装することができ、機械のノイズレベルが十分に低いことを条件とします。市販の装置に匹敵する解像度は、通常、硬いカンチレバーと接触モードで、または時折FM-AFMで達成されます。 AMモードでは、比較的柔らかいカンチレバーを操作するサンプルのより広い選択を可能にし、ほとんどのシステムでFM-AFMよりも実装が容易です。アプローチは、解像度を向上させ、局所的な化学的情報を得るために、任意の固体と液体の間の界面に存在する溶媒和力を利用するに依存しています。これは、原理的にのみ空気の湿度に起因するほとんどの表面上に構築水層（典型的には数ナノメートルの厚さ）に依存する、周囲条件で使用することができます。基本原理高解像度の戦略は変わらないが、先端のほとんどは、先端の頂点と試料⁸⁵の間のみの毛細管ブリッジと、空気中です。高解像度は、これらの状態^86,87に固い試料で実証されています。撮影条件が原因で、カンチレバーの振動の高いQ値に浸漬液体のものとはしかし異なっています。実際に、我々は、おそらく毛細管ブリッジの時間的変化に、それが困難なソフトや不規則なサンプルにわたって安定した動作を実現発見し、与えられたカンチレバー剛性のためのQ値を増加させました。

本明細書に記載されたプロトコルは、最も近代的な商業AM-のAFMによる液中のサンプルの分子レベルの解像度の画像を達成するための方法論を提供しています。私たちは、撮像パラメータの我々の選択の背後にある科学的根拠を提供し、溶媒和力の役割を強調する。また、一般的な問題を議論し、特に汚染インチ特定のチップと試料の相互作用CAn個の撮像溶液、カンチレバー形状および材料、およびサンプルの化学的性質の内容に応じて劇的に変化します。スキャンの間に存在する支配的な力の性質の実用的な理解は、新しいシステムにこのプロトコルを適応させ、信頼性の高い結果を確保することが不可欠です。最適化されたときは、実験的なアプローチは、in-situで 、溶液中の試料の局所的分子レベルの洞察を得るために強力です。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
マルチモードIIIA AFM	ブラ	ッカーNA
Cypher ES AFM	Asylum Resarch	NA	を使用したマシンの1つ
AFMカンチレバー/チップ	Nanoworld	Arrow UHF-AUD	最高の高周波
AFMカンチレバー/チップ	リンパス	RC800-PSA	多用途で安価な
超純水	ミリポア	NA	ラボのフィルタリングシステムは、汚染を誘発することができます
ジメチルスルホキシ	Sigma-Aaldrich	200-664-3	標準的な化学薬品、それ以上の精製は不要
一価塩	Sigma-Aaldrich		標準化学薬品、それ以上の精製なし
脂質	Avanti 極性脂質		標準プロトコルを使用して形成された脂質二重層
クリスタル	MTI		研磨クリスタル
スコッチテープ	3M	スコッチマジックテープ	半透明テープ 最適に機能します。透明が強くくっついている