マウス梁下ゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

サマリー

成体神経幹細胞(aNSC)の増殖のための培養システムを確立することで、aNSCの検査と治療への応用が可能になります。脳梁下領域(SCZ)は、最近、成体マウスの新規神経芽細胞形成領域として認識されています。ここでは、SCZ-aNSCの単離、拡張、および分化の方法について説明します。

要約

成体神経幹細胞(aNSC)は、損傷した脳組織の再生に使用することができます。神経幹細胞は、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトの3種類の細胞に分化・増殖する可能性を秘めています。aNSC由来の領域を同定し、aNSCの特性を特徴づけることは、aNSCの潜在的な使用と神経再生におけるそれらの役割の解明にとって重要です。白質と海馬の間に位置する脳梁下帯(SCZ)は、最近、aNSCを含み、神経芽細胞を絶えず引き起こすことが報告されています。SCZからのaNSCの低率はニューロンに分化します。ほとんどの細胞は、オリゴデンドロサイトやアストロサイトなどのグリア細胞に分化します。これらの細胞は、外傷性皮質損傷の治療可能性を有することが示唆されています。このプロトコルでは、成体マウスの脳からSCZ-aNSCを生成するプロセスを詳細に説明しています。1 mm間隔の脳マトリックスを使用して、SCZを含む冠状スライスを取得し、脳全体からSCZを正確に解剖します。SCZセクションは、最初にニューロスフィア培養を受けます。十分に発達した培養システムにより、それらの特性の検証が可能になり、NSCの研究を増やすことができます。ニューロスフィア培養システムは、増殖を測定し、本物のNSCを収集するための有用なツールを提供します。単層培養は、増殖と分化をアッセイするためのin vitroシステムでもあります。重要なことに、この培養システムは、ニューロスフェア培養システムよりもNSCに対してより均質な環境を提供します。したがって、これらの培養システムは、個別の脳領域を使用して、aNSCとその治療用途への応用に関する知識を広げるのに役立ちます。

概要

NSCは、自己再生と多系統分化の特徴を持っています。これらの特性を確認するために、ニューロスフェア培養システムが広く使用されてきました。ニューロスフィア培養システムは1990年代初頭に開発され、標準的な幹細胞培養システム¹として機能しました。自己再生力に応じて、NSCは連続的に増殖し、懸濁培養で細胞塊を生成します。細胞の数とニューロスフェアのサイズは、NSCの増殖特性と密接に関連していると考えられています。単層培養は、NSCの維持と分化にも広く使用されています。ニューロスフェア培養と比較して、単層培養システムはNSCの均一な維持と拡大に^{優れています2。}これら2つの十分に発達した培養システムは、in vitroでのaNSCの特性評価に貢献しています。

NSCは、側脳室の脳室下ゾーン(SVZ)や海馬^3-5の顆粒下ゾーン(SGZ)など、さまざまな脳領域に存在します。尾側皮質下白質の脳梁下領域(SCZ)は、新規の神経原性領域として認識されています^6-8。最近、SCZ-aNSCが外傷性脳損傷の治療可能性を持っていることが報告されました⁹。他の神経原性領域と比較して、SCZは皮質下白質に沿って存在します。ヒトの脳では、皮質下白質はマウスの脳よりも大きな領域を占めている¹⁰。したがって、in vitro培養システムを用いてSCZ-aNSCの特性を理解することは、これらの細胞の神経再生への利用を促進するために重要です。活性または静止性のNSCを含む望ましくない領域による汚染の可能性を排除するためには、目的の脳領域を正確に解剖する必要があります。例えば、非神経原性領域のaNSCは、損傷した脳やin vitro培養中に活性化され、新たな神経細胞を産生することができる¹¹。SCZからNSCを取得するために、SCZを含む脳スライスから細胞を採取しました。次に、細い針を用いてSCZ領域の慎重なマイクロダイセクションを行った。SCZからニューロスフェアを生成するために、マイクロ解剖したSCZ組織チャンクを単一細胞に解離し、上皮成長因子(EGF)および塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)の存在下で懸濁液として培養しました。SCZ-aNSCがニューロスフェアを形成した後、ニューロスフェアまたは単層として維持して拡張することもできます。この手順では、単層培養におけるNSCとその子孫の増殖および分化後のNSCを検出するためのさまざまなマーカーによる免疫染色プロセスも示しています。ここでは、SCZ-aNSC培養システムの視覚的なプロトコルを示します。このプロトコルには、SCZ領域のマイクロダイセクションと細胞の維持と継代に関する詳細な指示が含まれています。

プロトコル

材料および培養培地の調製

1. SCZの解剖および解離のために、アルミホイルで脳マトリックス、両刃カミソリの刃、および鉗子をラップしてから、オートクレーブでそれらを滅菌します。
2. 全マウスの脳を洗浄するために、冷PBS緩衝液の50ミリリットルを準備します。
3. 解剖顕微鏡を設定し、脳（オートクレーブ処理ハサミやピンセット）の解剖とSCZ（1 mlシリンジ、30 G針、脳マトリックス、および細かい鉗子）を単離するために必要な手術器具を準備します。
4. N2培地の調製：
   1. F-12 / DMEM（+ L-グルタミン、+炭酸水素ナトリウム）2％B27、1％N2サプリメント、および1％ペニシリン - ストレプトマイシンを含む培地を準備します。
      注：成長培地は、N2培地および成長因子（20 ngの/ mLの精製された上皮成長因子（EGF）および20 ng / mLの塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF2））からなります。
5. 消化緩衝液を準備します（40単位/ mlのパパイン、2.4単位/ ml dispasE II、および2％のペニシリン - ストレプトマイシンPBS中）組織消化のために。
6. コーティングプレートとカバースリップの調製：
   1. （; 0.01％PLO）とラミニン（DH ₂ Oに溶解し10μg/ mlの）ポリ-L-オルニチンを準備します。免疫染色のために、単層または18ミリメートルカバースリップとしてSCZ-aNSCsのメンテナンスのためのコート6ウェルプレートに、4℃で一晩PLOでそれらをインキュベートします。そしてO.は、プレートとカバースリップは、最後の洗浄後に乾燥することができDH ₂でそれらを3回洗浄します。
   2. 次に、4℃で一晩ラミニンでプレートをインキュベート。そして、DH ₂ Oでそれらを3回洗浄
      注意：細胞付着に影響を与えるであろう、ラミニンを乾燥させないでください。
      注：コーティング溶液を3回再利用することができます。

2.単離と大人SCZの解離

1. 文化の準備に先立ち、氷上で脳マトリックスと両刃カミソリを配置します。
   脳マトリックスを凍結しないでください、理由BR注：アインは、それに添付可能性があります。
2. CO ₂窒息または頚椎脱臼により（8週齢）のマウスを生け贄に捧げます。
   1. 70％エタノールを噴霧した後、鋭利なハサミで頭部を切断。ヘッドを固定化するために、しっかりと頭の両側を保持。尾 - 吻側方向に正中線でハサミで皮膚をカット。これは、頭蓋骨から皮膚の完全な除去を促進します。
   2. 最初の（ラムダに後方）頭蓋骨の尾の部分を削除してから、背側正中線の位置で頭蓋骨と脳の間に鉗子を挿入します。左（または右）頭頂骨をつかみ、慎重にはがし。他の頭頂骨の除去のために、この手順を繰り返します。
      注：視神経と脳から髄膜の除去の切断はそれが簡単に頭蓋骨から脳をデタッチすることを可能にします。
   3. 冷PBS緩衝液（25ミリリットル）に脳を移し、余分な血液を除去するために、それを2回すすいでください。
3. 氷とミリアンペアに脳マトリックスに脳を置きますKE冠状カットは1mm厚のスライスを得ることができます。 35mmのプラスチック製ペトリ皿に冷PBSに脳の後部に配置されSCZ領域を含む脳切片（1mm）で転送します。
   注意：冠状切片の平行な面を得るために、脳の亀裂は、脳マトリックスの正中線に配置されることを確実にします。セクション内の不要な変動を回避することが重要です。
   注：ブレグマ2〜3ミリの後部に脳スライスを入手。これは、SVZからSCZの分離を可能にします。
4. 低倍率で解剖顕微鏡下で、曲がった30G針^6,9と皮質と海馬の白質領域からSCZをマイクロ解剖。そして、SCZ上記の皮質領域を削除します。冷PBSせずに氷の上で35ミリメートルのプラスチックペトリ皿にスライスから解剖SCZ領域を配置します。
   注：成熟した神経細胞を含む余分な地域の汚染がaNSCsとニューロスフェア形成bの生存能力に影響を与える可能性がありますecause彼らはANSC培養条件下で細胞死を起こします。
5. 曲がった30 G針を使用して、すぐに小片に切開した組織を切ります。
   注：長い時間がSCZ組織を切開するために必要とされている場合は、チョッピングの前に冷PBSで解剖した組織を浸します。
6. 再懸濁消化緩衝液1mlで刻んだ組織を、消化緩衝液2mlを含有する15mlチューブに組織を転送し、そして37℃の水浴中で30分間それをインキュベートします。
   注：十分に混合するためにチューブを10分ごとに振ります。

3.梁下ゾーン由来の成体神経幹細胞培養

1. 消化された組織を分離し、その後5分間、145×gでチューブを遠心分離する穏やかにチューブをタップします。消化緩衝液を洗い流し、ゆっくりP1000ピペットを用いて試料溶液を5回の最大をピペットするために予め温めておいたN2培地1mlで再懸濁消化された組織、上清を捨てます。
   注：過粉砕狭いとピペットチップは、細胞の生存及びその後の成長を減少させることができます。
2. 5分間、145×gでチューブを遠心。上清を廃棄した後、N2培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁します。
3. 非コート6ウェルプレート中のN2培地1mlを調製し、2mlの最終容量を作成するために懸濁された細胞を1ml加えます。
4. 各ウェルにEGF（20ng / ml）およびbFGFを（20 ngの/ ml）を加えます。穏やかに播種した細胞を添加した成長因子を混合するために手で6ウェル培養皿を振ります。 37℃、5％CO ₂インキュベーター中で6ウェルプレートを保管してください。
5. 8日間毎日各ウェルにEGF（20ng / ml）およびbFGFを（20 ngの/ ml）を加えます。すべての三日目は、培地のおおよそ2ミリリットルの容量を維持するために、N2培地200μlのを追加します。

ニューロスフェアとして、また単層培養へのNSCの4継代

1. ニューロスフェアを収集し、新しい15ミリリットルコニカルチューブに移します。
   注：ニューロスフェアの数（>直径50μm）PERならびに単一マウス脳のSCZからは^{、SVZ（190.5±6.33）9}のそれよりも少なかった64.3±7.31でした。
2. 単一細胞に神経球を解離し、37℃の水浴中で5分間解離緩衝液0.5 mlのニューロスフェアを培養します。一次ニューロスフェアは、単一の細胞に分離し、神経球または単層培養物のいくつかの継代にわたって維持することができます。
   SCZ-aNSCsは、単層培養形式で> 10回継代することができるので、単層としてSCZ-aNSCsを展開すると、神経球よりも優れているが、<ニューロスフェア培養形式で5回：注意してください。
   注意：SCZ-aNSCs強い凝集を示し、単一細胞にそれらを分離することは困難です。このように、ニューロスフェア培養形式は、ルーチン細胞増殖のために推奨されません。
3. ゆっくり5分間145×gで上下P1000ピペットで5倍未満と遠心チューブを試料溶液をピペット。上清および再suコマンドを破棄N2培地1mlの神経球を過ごします。
   注：細胞の生存及びその後の成長を減少させることができ、狭いピペットチップで粉砕にわたり。
4. 細胞懸濁液（10μl）を0.4％トリパンブルー溶液の1混合し、次いで血球上の生細胞の数を数える：細胞をカウントするには、1を作ります。 PLO /ラミニンで6ウェルプレートに塗布した後、各ウェルのためのN2培地2mlで2.5×10 ⁵細胞/ mlで細胞をプレート。
   注：細胞密度の変化は、それらの条件と分化能に影響を与えることができます。
5. 5日間の増殖因子の毎日の治療とSCZ-aNSCs（2ミリリットル、20 ngの/ ml）を維持し、それらの通路それら。

梁下ゾーン由来の成体神経幹細胞の分化5.

1. SCZ-aNSCsの分化のための成長因子を有する1ミリリットルN2（20 ngの/ ml）の中の1×10 ⁵細胞/ mlとPLO /ラミニンでコーティングした18ミリメートルカバースリップ上にプレートaNSCs。
2. 次の日、細胞がしっかりとカバースリップに結合している場合には、増殖因子を除去するためにN 2で成長培地を交換します。
3. 6日後、細胞破片を除去し、免疫染色のためにそれらを修正するためにPBS 1mlで分化した細胞を洗浄します。
   注：BrdUを増殖細胞の新たに合成されたDNAに組み込むことができます。そのため、必要に応じて、BrdUを（10μg/ ml）を、細胞の固定前に細胞を生きて追加することができます。

6.免疫染色成体神経幹細胞および分化した前駆細胞

1. 免疫染色のために、PBSで細胞を洗浄し、室温で20分間、4％PFAで固定し。
   注意：PFAは非常に有毒です。皮膚や眼との接触を避けます。
2. 、4％PFAを削除し、PBSで3回を固定した細胞を洗い流し、その後、4°Cuntil彼らは免疫染色のために必要とされるでそれらを格納します。
3. 1×P溶液（3％ウシ血清アルブミン及び0.1％トリトンX-100を遮断してカバースリップ上で細胞をインキュベート室温で少なくとも30分間BS）。
4. 新鮮なブロッキング溶液中で一次抗体を準備し、4℃で一晩サンプルをインキュベートします。
   1. aNSCsを免疫染色
      1. 抗ネスチンおよび抗BrdU抗体を用いてaNSCsを染色。固定する前に、aNSCsへのBrdUの20μgのを追加し、2時間のためにそれらをインキュベートします。ブロッキング工程を実施する37°Cbeforeで20分間2 N HClを用いて変性ステップを実行します。
   2. 分化した前駆細胞を免疫染色：
      1. 差別化前駆細胞を標識する抗O4、抗BIIIチューブリン、および抗グリア線維酸性タンパク質（GFAP）抗体を使用してください。
5. PBSで試料を3回洗浄し、蛍光色素（1：500）にコンジュゲート二次抗体でそれらをインキュベートし、室温で30分間ブロッキング溶液中。その後、PBSで試料を3回洗浄します。
   注：プライマリのホストと一致し使用した二次抗体抗体。 Hoechest33343（1：2,000）は、核染色のために使用されます。
6. スライドガラスにマウントソリューションを追加し、取り付けを進めます。複数の波長で共焦点顕微鏡でサンプルを観察し、画像：FITC（488 nm）と、のCy3（543 nm）で、Cy5の（647 nm）であり、Hoechest33343（405 nm）を。

結果

未知の神経形成領域からaNSCsための培養システムを定義すると、これらの細胞を理解し、脳修復¹²におけるそれらの潜在的用途を開発するために不可欠です。異なる発生段階で、または異なる地域でのNSCが異なる^3,4振る舞うことが知られています。最近、SCZ由来細胞は、SVZ由来細胞^7-9と比較して、インビボおよび インビトロで神経分化のために差動電位を示すことが報告されました。従って、正確にそれぞれの神経原性領域を分離するために、SCZを含む脳切片を1mm脳マトリックス（ 図1A）を使用して解剖しました。増殖因子との培養の8日後、SCZ由来するaNSCs細胞はその後（ 図1B）を維持することができる、ニューロスフェアを形成することができます。

ニューロスフェアでNSCのサブセットは、SPO可...

ディスカッション

本論文では、成体マウスSCZからのNSCを生成し、様々なアプリケーションのためにそれらを維持するための詳細なプロトコルを記述します。 SCZ-のNSCを精製し、展開するために必要なin vitroの培養系を確立するための3つの重要なステップがあります。まず、SCZ領域が正確に他の潜在的な神経性領域（ 図1B）から解剖されていることを確認することが重要です。 SCZ領域を含む厚さと正確なセクションを1mm間隔脳マトリックスを用いて得られ、その後細かい針が他の皮質領域（ 図1A）からSCZの顕微解剖のために使用しました。ときに非NSCのような大脳皮質などの隣接組織から、負SCZ-NSCを^16-18,22の生存率および球形成に影響を及ぼすSCZ-aNSCs、壊滅的な死が発生、と培養されます。尾SCZ（ブレグマ2-3ミリの後部）が明確なSCZ-aNSCsを生成するための最良の領域として確認されました。第二に、approp収穫と継代段階でriate酵素処理は細胞の高い収量を達成するために重要です。ディスパーゼIIおよびパパイン、トリプシンよ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
<ストロング>ミディアムコンポーネント
DMEM/F12	Gibco	11320-033	+L-グルタミン、+重炭酸ナトリウム
ペン/連鎖球菌	Invitrogen	15140-122
N2 サプリメント	Gibco	17502-048
B27 サプリメント	Gibco	17504-044
Growth factor
bFGF	R&D	233-FB
EGF	Gibco	PHG0313
バッファー
PBS (10x)	BIOSOLUTION	BP007a	1x 希釈液
HBSS	Gibco	14175-095
Dissociattion バッファー
ディスパーゼ II	ロシュ	04-942-078-001
パパイン	ワージントン	3126
アキュターゼ	ICT	AT-104
Tool
Fine鉗子	WPI	555229F
はさみ	ストルツ	E3321-C
脳マトリックス(1 mm)	RWD	68707
両刃カミソリ	DORCO	ST-300
30 G ニードル	SUNGSHIM	N1300
素材
15 ml チューブ	SPL	50015
50 ml チューブ	SPL	50050
35 mm ディッシュ	SPL	10035	ペトリ ディッシュ
100 mm ディッシュ	SPL	10090	ペトリ皿
カバー スリップ (18 mm)	Deckglaser	111580
12 ウェル ディッシュ	SPL	32012	非コーティング
6 ウェル ディッシュ	SPL	32006	非コーティング
< strong> コーティング材料
PLO	Sigma	P4957	0.01%
Laminin	Gibco	23017-015	10 mg/ml
一次抗体
Nestin	Millipore	MAB353	マウス (1:1,000)
EGFR	Abcam	ab2430	ウサギ (1:1,000)
DCX	Santa Cruz	SC8066	ヤギ (1:500)
Tuj1	Sigma	T2200	ウサギ (1:2,000)
GFAP	Invitrogen	13-0300	ラット (1:1,000)
O4	Millipore	MAB345	マウス (1:500)
BrdU	Abcam	ab6326	ラット (1:500)
Secondary 抗体
anti-mouse 488	Invitrogen	A21202	1:500
anti-mouse cy3	Jackson	715-165-151
anti-mouse 647	Jackson	715-606-150
抗ウサギ 488	アレクサ	A21206
反ウサギ cy3	ジャクソン	711-165-152
反ウサギ 647	ジャクソン	711-605-152
反ヤギ 488	アレクサ	A11055
反ヤギ cy3	ジャクソン	705-165-147
反ヤギ 647	Invitrogen	A21447
抗ラット 488	Invitrogen	A21208
抗ラット cy3	ジャクソン	712-166-150
抗ラット 647	ジャクソン	712-605-153
Immunostaining materials
BSA	Millipore	82-100-6	3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS
Triton X-100	usb	22686
4% PFA	Biosesang	P2031
Hoechest33342	Life Technology	H3570	核染色用色素